CN113481187B - 一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用 - Google Patents

一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。本发明为了解决现有的褐藻胶裂解酶突变体无法满足工业化生产需求的问题，使用生物信息学软件，通过同源建模、蛋白质表面氨基酸确定、序列比对等方法确定若干个位于非保守区域的蛋白表面酸性氨基酸，将氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的褐藻胶裂解酶的第29位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，得到了一种催化活性/效率提高，温度稳定性好，终产物单一性好，利于减少工业化生产中后续产物的纯化成本的褐藻胶裂解酶突变体，为褐藻胶裂解酶突变体进一步工业化应用奠定了基础。

Description

一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用
技术领域
本发明涉及一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
褐藻富含海藻酸盐、海带素、海藻多糖及甘露醇，是一种具有巨大产业价值的海洋作物。其中关于甘露醇和海藻多糖的研究已被广泛报道，相关技术较为成熟。与之不同的是关于海藻酸盐(海藻酸钠)的研究相对较少，加之海藻酸盐由于其分子量大，在水中溶解度低的特点无法被广泛应用。因此，如何实现海藻酸盐的高效降解，并使其实现工业化应用是目前研究的热点。
海藻酸钠是主要由α-L-古罗糖醛酸(G)和β-D-甘露糖醛酸(M)通过糖苷键连接的线性多糖，褐藻胶裂解酶(Alginate lyase)能够通过β-消除反应裂解GM\MG、MM、GG单元间的糖苷键降解海藻酸钠，显著降低其粘度，并最终在降解产物非还原端形成不饱和双键，生成具有优良生理活性的褐藻寡糖。褐藻寡糖具有出色的抗氧化活性，能够通过提高体内抗氧化酶的活性来清除体内的自由基。此外，褐藻寡糖还兼具抑菌与益菌活性。褐藻寡糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌乃至真菌均有一定抑制作用。研究发现，褐藻寡糖对嗜水气单胞菌、白色念球菌具有较强的抗菌作用。与此同时，褐藻寡糖也能够调节肠道菌群，促进益生菌的增值。其优良的生物活性使其愈发成为当下相关研究的热点。
褐藻胶裂解酶来源广泛，迄今为止已经从多种海洋藻类、海洋软体动物(例如Littorina spp., Haliotis spp.,Turbo cornutus.等)以及一系列的海洋和陆地微生物中鉴定出分属于8个不同家族的褐藻胶裂解酶。然而，由于其来源环境等因素的影响，目前为止能够应用于工业环境中的褐藻胶裂解酶少之又少，大多数褐藻胶裂解酶的性质往往无法满足工业化生产需求。因此，通过基因工程、酶工程手段，对已有的褐藻胶裂解酶进行改造，提高褐藻胶裂解酶的催化性能成为了当前的一个重要研究热点。
发明内容
本发明为了解决现有褐藻胶裂解酶无法满足工业化生产需求的问题，提供了一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，所述技术方案如下：
本发明第一个目的在于提供一种褐藻胶裂解酶突变体，所述突变体是以氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示的褐藻胶裂解酶为亲本，将亲本第29位天冬氨酸替换为谷氨酰胺，获得的褐藻胶裂解酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所述。
本发明的第二个目的在于提供编码所述褐藻胶裂解酶突变体的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.3所示。
本发明的第三个目的在于提供携带所述基因的质粒。
本发明的第四个目的在于提供表达所述突变体或携带所述基因的重组细胞。
本发明的第五个目的在于提供一种制备褐藻寡糖的方法，所述方法以海藻酸钠水溶液为底物，添加所述褐藻胶裂解酶突变体，催化获得褐藻寡糖。
在本发明的一个实施方式中，所述海藻酸钠水溶液的浓度为0.2％～0.3％，所述褐藻胶裂解酶突变体的添加量为0.9U/g底物～1.2U/g底物。
在本发明的一个实施方式中，所述褐藻胶裂解酶突变体的添加量为1.08U/g底物。
在本发明的一个实施方式中，所述催化是在32℃～35℃反应4h～7h后，终止反应。
本发明的第六个目的在于提供所述的褐藻胶裂解酶突变体，或所述基因在生产褐藻寡糖中的应用。
本发明的第七个目的在于提供一种制备所述褐藻胶裂解酶突变体的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带褐藻胶裂解酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清即为褐藻胶裂解酶突变体的粗酶液。
在本发明的一个实施方式中，所述质粒载体为pET-28a(+)；所述宿主细胞为大肠杆菌 BL21(DE3)。
本发明的有益效果：
本发明获得的褐藻胶裂解酶突变体D29Q酶活较原始酶提高了0.26倍；最适温度为35℃，较原始酶没有明显变化，在35℃保温3h后，残余酶活力在65％以上，具有较好的温度稳定性，有利于连续生产；与原始酶相比，突变体D29Q对海藻酸钠的Km值下降了11％，表明底物亲和力得到一定的增强，且其Kcat/Km值提高了0.38倍，则说明催化效率有所提高。本发明所述的褐藻胶裂解酶突变体D29Q用于酶解法制备的褐藻寡糖能够更好的保留寡糖的生物活性，此外，由于本发明所述褐藻胶裂解酶突变体及原始酶最终酶解产物均为褐藻三糖(不饱和寡糖)，因此，该方法的最终产物的单一性较好，利于减少工业化生产中后续产物的纯化成本，为褐藻胶裂解酶突变体的进一步工业化应用奠定基础。
附图说明
图1为定点突变PCR产物图，其中，M为marker，1-8分别为重组质粒pET28a(+)-Aly01， Aly01D29Q，Aly01E203A，Aly01D293G，Aly01E348A，Aly01D463N，Aly01D466N，Aly01E481V的PCR产物；
图2为纯化后原始酶及各突变体酶蛋白的SDS-PAGE图，其中，M为marker，1-8分别为纯化后的重组酶pET28a(+)-Aly01，D29Q，E203A，D293G，E348A，D463N，D466N，E481V；
图3为纯化后原始酶及各突变体的绝对酶活图；
图4为原始酶Aly01及突变体AlyD29Q在不同pH下的相对酶活图；
图5为原始酶Aly01及突变体AlyD29Q在不同温度下的相对酶活图；
图6为原始酶Aly01及突变体AlyD29Q在35℃下保存不同时间的相对酶活图；
图7为原始酶Aly01及突变体AlyD29Q的解链温度(Tm)图；
图8为原始酶Aly01及突变体AlyD29Q完全酶解产物的TLC产物分析图，其中，1表示未添加酶；2表示原始酶；3表示突变体D29Q。
具体实施方式
以下结合实例与附图对本发明的具体实施作进一步的说明，以下实例中所使用的质粒、 PCR试剂、限制性内切酶、质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒等采用商业产品，具体操作按照试剂盒说明书进行。本发明的实施方式不限于此，其他未注明的实验操作和工艺参数按照常规技术进行。
各培养基的组成：
LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 5.0g/L。
LB固体培养基：胰蛋白胨10.0g/L，酵母提取物5.0g/L，NaCl 5.0g/L，琼脂20g/L。
TB发酵培养基：酵母提取物24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油4g/L，KH2PO4 2.3g/L，K2HPO4 16.4g/L。
褐藻胶裂解酶酶活测定方法：
本发明采用改良的DNS法。酶活测定条件：950μL 0.5％的海藻酸钠溶液中加入50μL褐藻胶裂解酶粗酶液，混匀后于35℃反应10min，沸水浴终止反应；取300μL反应液与1MLDNS 试剂混匀，沸水浴5min显色，最后加入1mL去离子水混匀后在540nm下测定吸光值。对照组用去离子水代替粗酶液。1酶活活力单位(U)定义：上述条件下，每分钟产生1μmol糖醛酸所需要的酶量。配置不同浓度的甘露糖、古罗糖醛酸混合溶液，在上述条件下与DNS试剂反应，测定在540nm下的吸光值，绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。
比酶活(U/mg)＝酶活/蛋白质量
催化动力学参数测定方法如下：
以50mM pH 8.0的PBS缓冲液分别配置不同浓度的海藻酸钠底物溶液(海藻酸钠含量分别为0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL和1mg/mL)，测定原始酶及突变体D29Q在最适反应温度(35℃)、最适反应pH(8.0)条件下的酶活力，采用Lineweaver-Burk法，以反应速率倒数为纵坐标，底物浓度倒数为横坐标作图，计算Km、Vmax和Kcat/Km。
实施例1：褐藻胶裂解酶突变体的构建
对来源于V.natriegens SK42.001的褐藻胶裂解酶基因Aly01进行突变，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，全长1566bp，编码521个氨基酸，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.2 所示。对其第29、203、293、348、463、466和第481的氨基酸分别突变，构建如表1所示的突变体。
设计含有突变位点的引物，以重组质粒pET-28a(+)-Aly01为模板，采用PCR技术环式扩增获得目的突变重组质粒基因片段，转化至E.coli BL21(DE3)中，获得突变重组菌，并涂布在含有卡纳抗性的LB固体平板上，过夜培养后挑取单菌落测序，选择测序正确即为重组菌株。定点突变引物如表1所示。
表1.引物序列
*下划线标出的密码子为突变位点
PCR扩增体系：2×PrimeSTAR MIX 10μL，模板质粒50ng，上下游引物10pmol，最后用ddH2O补齐至20μL。
PCR反应参数：95℃变性3min；95℃变性30s；56℃退火15s；72℃延伸100s；28个循环；72℃保温5min；4℃保存。取4.5μLPCR扩增产物加入0.5μL 10×loading buffer后用琼脂糖凝胶电泳检测(见图1)。剩余的PCR产物中加入1μLdpnⅠ及2μL buffer，37℃，30min 消化模板。取10μL消化产物加入到100μLE.coli(DH5α)感受态细胞中，轻柔的吹打均匀后冰浴30min；42℃热激90s；在冰上放置5min；加入1mL LB培养基，37℃、200r/min复苏45min；6000rpm离心5min，吸取1ml上清液弃去，剩余液体重悬后涂布在含有卡纳抗性的LB平板上，37℃培养12h。挑取单菌落测序验证，验证正确的即为重组质粒pET28a(+) -Aly01、pET28a(+)-Aly01D29Q、pET28a(+)-Aly01E203A、pET28a(+)-Aly01D293G、 pET28a(+)-Aly01E348A、pET28a(+)-Aly01D463N、pET28a(+)-Aly01D466N和pET28a (+)-Aly01E481V。
实施例2：原始酶Aly01及突变体的诱导表达与纯化
提取重组质粒pET28a(+)-Aly01、pET28a(+)-Aly01D29Q、pET28a(+)-Aly01E203A、pET28a(+)-Aly01D293G、pET28a(+)-Aly01E348A、pET28a(+)-Aly01D463N、pET28a (+)-Aly01D466N和pET28a(+)-Aly01E481V，将其分别转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，具体操作同实施例1，挑取单菌落于5mL LB(Kan)液体培养基中，37℃、200rpm 培养12h。取1mL培养液接种至100mL LB(Kan)液体培养基中，在37℃、200rpm条件下培养至OD600在0.6-0.8之间，加入IPTG(终浓度为1mM),并将其转移至18℃、200rpm培养条件下，诱导72h，将培养液置于6000rpm的条件下离心10min，取上清液测定褐藻胶裂解酶活力，以原始酶Aly01作为对照。
将收集的上清液过水系滤膜后上载到镍柱进行纯化，使用50mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液作为平衡缓冲液(binding buffer)；以binding buffer为溶剂配置50mM、500mM咪唑梯度洗脱液。收集经梯度洗脱后的蛋白，进行SDS-PAGE检验蛋白纯度(如图2所示)。纯化后的蛋白溶液对50mM PBS透析，每隔8h换一次透析液，透析24h，获得纯化后的蛋白。
利用蛋白浓度测定试剂盒(上海生工)测定纯化后的蛋白浓度，同时测定纯化后纯酶酶活，计算得原始酶及各突变体酶活如图3所示，与原始酶相比，突变体D29Q酶活提高0.26 倍。
实施例3：原始酶和突变体D29Q的酶学性质
最适反应pH测定：将原始酶和突变体D29Q分别加入由不同pH缓冲液(pH4.0-6.0为柠檬酸钠缓冲液；pH6.0-8.0为磷酸盐缓冲液(磷酸钠缓冲液)；pH7.5-8.5为Tris-盐酸缓冲液； pH8.5-10.0为甘氨酸-NaOH缓冲液)配置的浓度为0.5％的海藻酸钠底物中反应，缓冲液浓度为50mM，反应温度为35℃，反应时间为10min。使用上述改良的DNS法测定酶活，以最高酶活为100％，计算不同pH条件下的相对酶活，测定得到最适反应pH。如图4所示，原始酶与突变体的最适pH均为8.0。
最适反应温度测定：在上述最适反应pH条件下，其他反应条件不变，测定原始酶与突变体D29Q在不同温度下的酶活力，温度梯度为4℃、20℃(室温)、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃℃、60℃和70℃。将测定的最高酶活力设定为100％，计算不同温度下的相对酶活，测定得到最适反应温度。如图5所示，原始酶与突变体最适温度均为35℃。
温度稳定性测定：在最适反应温度与最适反应pH条件下，分别测定原始酶与突变体D29Q 在35℃保温的参与酶活力，酶活测定时间间隔为保温0min、30min、60min、120min和180min。如图6所示，两种酶均具有良好的温度稳定性，但是突变体酶较原始酶具有更优秀的温度稳定性。
解链温度(Tm)的测定：使用纳米差示扫描量热仪测定原始酶与突变体D29Q的解链温度。纯酶经透析后用50mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度1mg/mL，4℃孵育24h后，超声除去气泡。使用未加入酶的50mM pH 8.0的磷酸盐缓冲液作为对照，扫描温度从0℃至 75℃，升温速度为1℃/min。如图7所示，原始酶与突变体D29Q的Tm值分别为35.2℃和36.03℃。突变体D29Q解链温度相较于原始酶提高了0.83℃，与温度稳定性结果吻合。
实施例4：原始酶和突变体D29Q的催化动力学参数测定
催化动力学参数测定结果见表2，与原始酶相比，突变体D29Q对海藻酸钠底物的Km至下降了11％，说明突变导致酶的底物亲和力有所提高；且突变体D29Q的Kcat/Km值与原始酶相比，提高了0.38倍，说明突变导致酶的催化效率提高。
表2.原始酶Aly01及突变体D29Q的催化动力学参数
实施例5：原始酶Aly01及突变体D29Q在生产褐藻寡糖中的应用
完全酶解产物的制备方法如下：0.25％(w/v)的海藻酸钠水溶液(添加量为1mL)加入 8μg(比酶活为127.5U/mg)经镍柱纯化后的酶，于35℃反应6h后沸水浴终止反应，离心后收集上清待用。
薄层色谱法鉴定酶解产物：1μL上清液及标样经展开剂(正丁醇：醋酸：蒸馏水＝3：2： 3v/v)充分展开后晾干，然后在显色剂(硫酸：乙醇＝1：9v/v)作用下在120℃显色，未经酶解的海藻酸钠底物溶液作为对照。结果如图8所示，突变体D29Q最终酶解产物仍为三糖，未丧失酶解产物专一性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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gagggtggcc gatacatgta cttcaaggcc ggtgtttata accagaatat gtacggcaat 1500
ccagatgatt acgctcaagc aactttctac aagctagatc aatcttttgg taagtaccaa 1560
ggctag 1566
<210> 2
<211> 521
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Lys His Ile Phe Phe Lys Ser Leu Leu Ala Ser Ser Ile Leu Leu
1 5 10 15
Ala Val Gly Cys Asn Ser Thr Ala Thr Ala Lys Ala Asp Phe Pro Asn
20 25 30
Asn Gln Glu Thr Gly Val Asp Ile Leu Thr Pro Val Ala Ile Thr Ala
35 40 45
Ser Ser His Asp Gly Asn Val Pro Glu Asn Leu Leu Asp Gln Asp Ile
50 55 60
Met Thr Arg Trp Ala Ala Asn Gly Asp Gly Glu Trp Ala Met Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Gly Ser Val Tyr Gly Phe Asp Ala Ile Gln Ala Ser Phe Ser Lys
85 90 95
Gly Asn Glu Arg Val Thr Ser Phe Asp Val Gln Phe Ser Thr Asp Gly
100 105 110
Glu Asn Trp Val Thr Val Ile Glu Gly Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ala
115 120 125
Leu Gly Leu Glu Arg Phe Gln Phe Glu Pro Ala Val Lys Ala Arg Tyr
130 135 140
Val Arg Tyr Val Gly His Gly Asn Thr Lys Asn Gln Trp Asn Ala Val
145 150 155 160
Thr Glu Met Ala Ala Val Asn Cys Gly Ile Asn Ala Cys Pro Ala Ser
165 170 175
His Val Ile Thr Asp Asp Val Val Lys Ala Glu Ala Thr Met Ile Ala
180 185 190
Ala Met Lys Ala Lys Glu Lys Ala Gln Lys Glu Leu Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Arg Lys Gly Asp Phe Gly Glu Pro Ile Val Arg Pro Cys Gly Thr Thr
210 215 220
Val Thr Cys Asp Leu Thr Lys Ala Met Pro Ser Pro Thr Leu Pro Ala
225 230 235 240
Val Pro Leu Ala Lys Asn Ala Pro Gly Gln Asn Phe Asp Leu Thr Arg
245 250 255
Trp Lys Leu Thr Thr Pro Phe Asp His Asp Lys Asp Gly Arg Ala Asp
260 265 270
Asp Ile Asp Glu Trp Asp Met Ala Asn Gly Phe Gln His Pro Asp Ile
275 280 285
Phe Tyr Thr Ala Asp Asp Gly Gly Met Val Phe Lys Ser Tyr Val Lys
290 295 300
Gly Ala Arg Thr Ser Lys Asn Thr Lys Tyr Ala Arg Thr Glu Leu Arg
305 310 315 320
Thr Met Leu Arg Ala Gly Glu Lys Ser His Ser Thr Lys Gly Val Asn
325 330 335
Pro Asn Asn Trp Val Phe Ser Ser Ala Pro Val Glu Asp Gln Lys Ala
340 345 350
Ala Gly Gly Val Asp Gly Thr Leu Glu Ala Thr Leu Lys Ile Asp His
355 360 365
Ala Thr Thr Thr Gly Gln Ser His Glu Val Gly Arg Phe Ile Ile Gly
370 375 380
Gln Ile His Asp Lys Asp Asp Glu Pro Ile Arg Leu Tyr Tyr Arg Lys
385 390 395 400
Leu Pro Asp Gln Pro Thr Gly Thr Val Tyr Phe Ala His Glu Lys Thr
405 410 415
Lys Thr Gly Thr Glu Asp Tyr Tyr Ser Leu Val Gly Asp Met Thr Gly
420 425 430
Glu Ile Gly Asn Asp Gly Ile Ala Leu Gly Glu Lys Phe Ser Tyr Ile
435 440 445
Ile Asp Val Lys Gly Asn Thr Met Thr Val Thr Val Lys Arg Asp Gly
450 455 460
Lys Asp Asp Val Val Gln Val Val Asp Met Ser Asp Ser Gly Tyr Asp
465 470 475 480
Glu Gly Gly Arg Tyr Met Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn
485 490 495
Met Tyr Gly Asn Pro Asp Asp Tyr Ala Gln Ala Thr Phe Tyr Lys Leu
500 505 510
Asp Gln Ser Phe Gly Lys Tyr Gln Gly
515 520
<210> 3
<211> 1566
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgaagcata ttttcttcaa aagcttgtta gcttcttcaa tcctattggc tgttggttgt 60
aacagcactg caactgcgaa ggctcaattc ccaaacaatc aagaaaccgg cgttgacatt 120
ctaactcctg ttgcaatcac ggcgagtagc catgatggta atgtgcctga gaacttactt 180
gaccaagata ttatgactcg ctgggcagcg aacggtgacg gtgagtgggc aatgttggat 240
tacggctcag tttatgggtt cgatgcaatc caagcgtcgt ttagtaaagg taatgaacgt 300
gtcacgtcat ttgatgttca gttcagcaca gatggtgaaa actgggtaac ggttattgaa 360
ggtgcacaaa gctctggtcg tgctcttggt ctggaacgct tccagttcga gcctgcggta 420
aaagctcgtt atgtacgtta cgttggccac ggcaatacca aaaaccaatg gaacgctgtt 480
actgaaatgg ccgcggttaa ctgtggaatc aatgcgtgcc cggcaagcca tgtcattacc 540
gatgatgttg ttaaagctga agcgactatg attgctgcaa tgaaggctaa ggaaaaagcg 600
caaaaggaac tccttaaaaa taatcgcaaa ggtgatttcg gagaaccaat cgtccgtcct 660
tgcgggacga cagtgacgtg tgacctaact aaagcaatgc catccccaac gctaccggct 720
gttccactag ctaagaatgc accaggccaa aactttgacc tgacgcgctg gaaactgaca 780
acgcctttcg atcacgacaa agacggccgc gctgatgata ttgatgagtg ggatatggca 840
aacggcttcc agcacccaga tatcttctac acagctgatg atggcggcat ggttttcaag 900
agctatgtaa aaggtgcacg tacctctaaa aatactaagt acgcacgtac agagttgcgc 960
actatgctgc gtgcgggtga gaagtctcac agtacaaaag gtgtaaatcc aaataactgg 1020
gtattcagct cagcgccggt agaagatcag aaagcagcgg gtggggtaga tggcacgctt 1080
gaggcaactc tgaagattga ccatgcaacc acaacgggtc agtcacacga agttggccgt 1140
ttcattatcg gtcagattca tgacaaagat gatgagccaa ttcgccttta ctaccgtaag 1200
ctaccagacc agccaacagg tacggtttac ttcgctcacg aaaaaaccaa aacaggtact 1260
gaagattact acagcctggt tggtgatatg actggtgaaa tcggtaacga tggtatcgcg 1320
ctaggtgaaa aattcagcta catcattgat gtaaaaggca acacgatgac agttacggta 1380
aaacgtgacg gtaaagatga tgttgtacaa gtcgtagata tgagtgacag tggttatgat 1440
gagggtggcc gatacatgta cttcaaggcc ggtgtttata accagaatat gtacggcaat 1500
ccagatgatt acgctcaagc aactttctac aagctagatc aatcttttgg taagtaccaa 1560
ggctag 1566
<210> 4
<211> 521
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Lys His Ile Phe Phe Lys Ser Leu Leu Ala Ser Ser Ile Leu Leu
1 5 10 15
Ala Val Gly Cys Asn Ser Thr Ala Thr Ala Lys Ala Gln Phe Pro Asn
20 25 30
Asn Gln Glu Thr Gly Val Asp Ile Leu Thr Pro Val Ala Ile Thr Ala
35 40 45
Ser Ser His Asp Gly Asn Val Pro Glu Asn Leu Leu Asp Gln Asp Ile
50 55 60
Met Thr Arg Trp Ala Ala Asn Gly Asp Gly Glu Trp Ala Met Leu Asp
65 70 75 80
Tyr Gly Ser Val Tyr Gly Phe Asp Ala Ile Gln Ala Ser Phe Ser Lys
85 90 95
Gly Asn Glu Arg Val Thr Ser Phe Asp Val Gln Phe Ser Thr Asp Gly
100 105 110
Glu Asn Trp Val Thr Val Ile Glu Gly Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ala
115 120 125
Leu Gly Leu Glu Arg Phe Gln Phe Glu Pro Ala Val Lys Ala Arg Tyr
130 135 140
Val Arg Tyr Val Gly His Gly Asn Thr Lys Asn Gln Trp Asn Ala Val
145 150 155 160
Thr Glu Met Ala Ala Val Asn Cys Gly Ile Asn Ala Cys Pro Ala Ser
165 170 175
His Val Ile Thr Asp Asp Val Val Lys Ala Glu Ala Thr Met Ile Ala
180 185 190
Ala Met Lys Ala Lys Glu Lys Ala Gln Lys Glu Leu Leu Lys Asn Asn
195 200 205
Arg Lys Gly Asp Phe Gly Glu Pro Ile Val Arg Pro Cys Gly Thr Thr
210 215 220
Val Thr Cys Asp Leu Thr Lys Ala Met Pro Ser Pro Thr Leu Pro Ala
225 230 235 240
Val Pro Leu Ala Lys Asn Ala Pro Gly Gln Asn Phe Asp Leu Thr Arg
245 250 255
Trp Lys Leu Thr Thr Pro Phe Asp His Asp Lys Asp Gly Arg Ala Asp
260 265 270
Asp Ile Asp Glu Trp Asp Met Ala Asn Gly Phe Gln His Pro Asp Ile
275 280 285
Phe Tyr Thr Ala Asp Asp Gly Gly Met Val Phe Lys Ser Tyr Val Lys
290 295 300
Gly Ala Arg Thr Ser Lys Asn Thr Lys Tyr Ala Arg Thr Glu Leu Arg
305 310 315 320
Thr Met Leu Arg Ala Gly Glu Lys Ser His Ser Thr Lys Gly Val Asn
325 330 335
Pro Asn Asn Trp Val Phe Ser Ser Ala Pro Val Glu Asp Gln Lys Ala
340 345 350
Ala Gly Gly Val Asp Gly Thr Leu Glu Ala Thr Leu Lys Ile Asp His
355 360 365
Ala Thr Thr Thr Gly Gln Ser His Glu Val Gly Arg Phe Ile Ile Gly
370 375 380
Gln Ile His Asp Lys Asp Asp Glu Pro Ile Arg Leu Tyr Tyr Arg Lys
385 390 395 400
Leu Pro Asp Gln Pro Thr Gly Thr Val Tyr Phe Ala His Glu Lys Thr
405 410 415
Lys Thr Gly Thr Glu Asp Tyr Tyr Ser Leu Val Gly Asp Met Thr Gly
420 425 430
Glu Ile Gly Asn Asp Gly Ile Ala Leu Gly Glu Lys Phe Ser Tyr Ile
435 440 445
Ile Asp Val Lys Gly Asn Thr Met Thr Val Thr Val Lys Arg Asp Gly
450 455 460
Lys Asp Asp Val Val Gln Val Val Asp Met Ser Asp Ser Gly Tyr Asp
465 470 475 480
Glu Gly Gly Arg Tyr Met Tyr Phe Lys Ala Gly Val Tyr Asn Gln Asn
485 490 495
Met Tyr Gly Asn Pro Asp Asp Tyr Ala Gln Ala Thr Phe Tyr Lys Leu
500 505 510
Asp Gln Ser Phe Gly Lys Tyr Gln Gly
515 520
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
actgcgaagg ctcaattccc aaacaatcaa g 31
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gagccttcgc agttgcagtg ctgttac 27
<210> 7
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcgcaaaagg cactccttaa aaataatcgc aaag 34
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agtgcctttt gcgctttttc cttagccttc 30
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cagctggtga tggcggcatg gttttc 26
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gccatcacca gctgtgtaga agatatctgg 30
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
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<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gatctgctac cggcgctgag ctg 23
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgtaacggta aagatgatgt tgtacaagtc g 31
<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
ctttaccgtt acgttttacc gtaactgtca tc 32
<210> 15
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cgtgacggta aaaatgatgt tgtacaagtc g 31
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ttttaccgtc acgttttacc gtaactgtca tc 32
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ggttatgatg tgggtggccg atacatg 27
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
acccacatca taaccactgt cactcatatc 30

Claims (10)

1.一种褐藻胶裂解酶突变体，其特征在于，所述突变体是以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的褐藻胶裂解酶为亲本，将亲本第29位天冬氨酸替换为谷氨酰胺。
2.编码权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的质粒。
4.表达权利要求1所述突变体或携带权利要求2所述基因的重组细胞。
5.一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，以海藻酸钠水溶液为底物，添加权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体，催化获得褐藻寡糖。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述海藻酸钠水溶液的浓度为0.2％～0.3％，所述褐藻胶裂解酶突变体的添加量为0.9U/g底物～1.2U/g底物。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述催化是在32℃～35℃反应4h～7h后，终止反应。
8.权利要求1所述的褐藻胶裂解酶突变体，或权利要求2所述基因在生产褐藻寡糖中的应用。
9.一种制备权利要求1所述褐藻胶裂解酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带褐藻胶裂解酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，离心收集细胞，细胞破壁上清即为褐藻胶裂解酶突变体的粗酶液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述质粒载体为pET-28a(+)；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
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