CN112746064B

CN112746064B - 一种来源于梭菌属的壳聚糖酶基因及其重组菌和在生产壳寡糖上的应用

Info

Publication number: CN112746064B
Application number: CN202011558290.3A
Authority: CN
Inventors: 沙凤; 孙科
Original assignee: Suzhou Koning Polyol Co ltd
Current assignee: Suzhou Koning Polyol Co ltd
Priority date: 2020-12-28
Filing date: 2020-12-28
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2040-12-28
Also published as: CN112746064A

Abstract

本发明公开了一种来源于梭菌属的壳聚糖酶基因及其重组菌在生产壳寡糖上的应用。该酶是一种内切酶，来源于糖苷水解酶GH‑46家族，其水解产物聚合度区间为3‑9，主要分布于3‑5，水解效率大于90%。此外，对该酶的基因序列进行对比发现，其与已经报道的壳聚糖酶氨基酸序列最高相似性仅为34.7%。通过酶学性质研究，其最适反应温度为50℃，最适反应pH为6.0，金属离子Mg²⁺、Mn²⁺对其活性有促进作用。同时，将编码该壳聚糖酶基因的重组质粒转化至大肠杆菌中，能有效表达并降解壳聚糖。本发明通过将梭菌属中地壳聚糖酶基因重组于大肠杆菌工程菌，获得能够高效表达该基因的重组大肠杆菌工程菌E.coli Trans1‑T1/pTrc99a‑csE，具有较高的经济价值和工业应用前景，为新酶的挖掘与应用拓宽了资源。

Description

一种来源于梭菌属的壳聚糖酶基因及其重组菌和在生产壳寡糖上的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种来源于梭菌属的壳聚糖酶基因，同时还涉及该酶的获取以及重组表达，还涉及该重组菌在生产壳寡糖上的具体应用。

背景技术

壳聚糖(Chitosan，简称CTS)是甲壳素脱N-乙酰基的产物，在自然界中储量丰富，由于具有无毒、良好的生物容性和成膜性等优良特性，在农业、医疗卫生等方面有广泛的用途。但是壳聚糖的分子量大，晶体结构紧密，水溶性较差，在人体内不易被吸收，使其应用开发受到限制。与壳聚糖相比，通过降解壳聚糖获得的壳寡糖(聚合度在20以下)，水溶性好，分子量低，容易被生物体吸收利用，具有壳聚糖不可比拟的优越性。由于其独特的功能性质，壳寡糖在废水处理、食品工业、日用化学品、纺织、化工、农业、生物工程和医药等领域均具有广泛的应用前景，是壳聚糖高值化利用的关键环节。

壳聚糖的水解方式一般有化学法、物理法和生物酶法，其中，生物酶法是利用非专一或专一性酶对壳聚糖进行降解产生壳寡糖，具有产物分子量易于控制、反应条件温和、低环境污染等优点。虽然已报道有30多种非专一性酶能降解壳聚糖(如蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶等)，但这些商品酶制剂大多存在专一性差、酶制剂用量大、水解效率并不高的问题，也尚未被证实是否含壳聚糖酶。而本发明所提供的壳聚糖酶的转化效率经验证均在90％以上。壳聚糖酶(EC3.2.1.132)是一种专一性水解酶，是酶法降解壳聚糖研究的核心。同时，从自然环境中寻找到产壳聚糖酶的新菌株也是壳聚糖应用研究的重要内容。

因此，合理开发从自然界筛选得到的壳聚糖酶新基因，进而对新酶的特性研究并将其应用到实际生产中，解决化学法生产所带来的严重环境问题，将是未来壳寡糖产业的发展方向。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对壳寡糖现有生产技术的弊端，提供一种来源于梭菌属的壳聚糖酶基因，同时提供一种包括该基因的重组质粒，还提供一种含有该基因的大肠杆菌工程菌及其获取方法。

为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案如下：

一种来源于梭菌属的壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其与已经报道的壳聚糖酶氨基酸序列最高相似性仅为34.7％。

编码所述壳聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种重组质粒，它包含所述的壳聚糖酶的基因。

一种重组菌，它含有所述的重组质粒。

壳聚糖酶的制备方法，在营养培养基中培养所述的重组菌，收集具有壳聚糖酶活性的多肽。

所述营养培养基为酵母粉5.0-7.5g/L，甘油10.2-12g/L，蛋白胨11.5-15.0g/L，磷酸氢二钾6.3-8.6g/L，磷酸二氢钾1.2-3.0g/L，硫酸镁0.32-0.48g/L，硫酸铵1.2-2.6g/L。

所述壳聚糖酶在生产壳寡糖上的应用。

将壳聚糖酶按照50U/g壳聚糖的添加量直接与底物0.1-8％的胶体壳聚糖溶液反应4-8h，即获得所述壳寡糖。所制备得到的壳寡糖聚合度区间为3-9，主要为3-5。壳寡糖聚合度区间为3-5的占比超过80％。所述反应温度为45-55℃，反应pH为5.0-6.0，优选反应温度为50℃，反应pH为6.0。

反应过程中添加Mg²⁺、Mn²⁺进一步提高水解效率。所述Mg²⁺、Mn²⁺浓度为1-10mmol/L，所述Mg²⁺、Mn²⁺浓度优选为5mmol/L。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。因此，本发明的壳聚糖酶还包括由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由SEQ ID No.1所示的蛋白质衍生的蛋白质。例如通过在末端添加标签序列，如His-tag或Strep-tag而衍生的蛋白质。

优选的，壳聚糖酶的衍生蛋白的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的同源性可为70％以上，优选80％以上，更优选90％以上。

本发明还提供的含有所述基因或基因簇的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本领域技术人员能够理解，作为遗传密码简并性的结果，许多不同的多核苷酸能够编码相同的多肽。另外，应当理解，本领域技术人员能够使用常规的技术进行核苷酸取代，所述取代不会影响本发明中所使用的多核苷酸编码的多肽序列。另外，还可以使用本领域中的已知的方法对多核苷酸进行修饰，以增强本发明多核苷酸在体内的活性或者存活期。

本发明中，可选用本领域己知的各种载体，如质粒，粘粒，噬菌体及反转录病毒等。

重组表达载体可以用本领域熟知的方法导入宿主细胞中，这些方法包括：氯化钙热激法，电转化法，PEG介导法，基因枪法等。

壳聚糖酶基因的获得、重组质粒和重组工程菌的构建：

所述梭菌属，该菌株分离自草莓根际土壤，经16s rDNA鉴定及生理生化指标测定，将该菌株鉴定为梭菌属；根据该菌株测序结果发现其具有潜在的壳聚糖酶基因。通过选用诺维赞的细菌基因组DNA提取试剂盒提取该菌株基因组，经NCBI比对后选用具有高度同源性的壳聚糖酶基因作为目标序列，设计引物csE-F：AGTAAAACAAAGATGAAAAATTTACGA

csF-R：ATAAACATCACCATCATTATTGGGATT

以梭菌属基因组DNA为模板，对其进行目的基因序列csE的扩增，从该菌中获得壳聚糖酶基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

壳聚糖酶(EC3.2.1.132)是一种糖基水解酶，主要来源于细菌和真菌，以内切方式催化水解部分乙酰化壳聚糖中的β-1,4-氨基葡萄糖苷键，生成壳寡糖。根据氨基酸序列不同，可将壳聚糖酶分为5个糖苷水解酶家族，分别为：GH-5、GH-8、GH-46、GH-75和GH-80。本发明所述壳聚糖酶是属于GH-46家族。

所述壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其与已经报道的壳聚糖酶氨基酸序列(来源Streptomyces sp.N174，Uniprot号为P33665)最高相似性为34.7％。

壳寡糖，是经该壳聚糖酶水解胶体壳聚糖后制得，其中胶体壳聚糖的浓度不仅仅局限于某一浓度，其浓度区间为0.1％-8％，其中，壳聚糖的脱乙酰度为65％-95％，经酶催化反应后制得的壳寡糖聚合度区间为3-9，其主要聚合度区间为3-5，产物的聚合度区间相对更为集中与稳定。

壳寡糖：化学名β-(1-4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，是氨基葡萄糖(Glucosamine)通过β-1,4糖苷键连接而成的聚合度为2-10功能性低聚糖，是迄今所发现的唯一天然阳离子碱性多糖，具有水溶性好、粘度低、生物活性高、分子量小、易被机体吸收等特性。由于含有功能性羟基和基团氨基酸，壳寡糖具备比如抗菌性、抗炎、抗氧化的效果，还能够促进动物机体免疫力效果的提升，所以实际应用效果非常好，同时具备良好的降解性，能够大量地应用到食品、药物、医学等多个行业中，应用广泛。而目前酶法或者化学法所制备的壳寡糖一般都是聚合度区间为2-20的壳寡糖，其产物聚合度区间分布广，后续带来一系列的分离纯化的过程。同时研究发现，在聚合度区间为3-7之间时，随着聚合度的升高壳寡糖的生物活性降低。

本发明得到的壳聚糖酶属于糖苷水解酶第46家族，具有较高的催化活性，该酶热稳定性及pH稳定性好，其能够在45℃-60℃、pH5.0-6.0的区间具有高效降解壳聚糖的酶活，最适反应温度为50℃，最适反应pH为6.0，Mg²⁺、Mn²⁺对其活性有一定的促进作用，Cu²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Co²⁺对其活性有一定的抑制作用，具有较高的经济价值和工业应用前景。

所述重组表达质粒的构建，首先设计带有酶切位点的引物，通过PCR扩增出壳聚糖酶基因csE，ptrc-99a质粒均用XbalI和HindIII进行双酶切，割胶回收的酶切产物通过同源重组的方式进行连接，得到重组质粒ptrc99a-csE，并对重组质粒经酶切鉴定并测序。

所述重组大肠杆菌工程菌的构建，将上述所获得的重组质粒通过化转的方式分别转入大肠杆菌pET-22b、Trans5a、Trans1-T1、Rosetta-gami感受态中，优选地，将重组质粒通过化转的方式转入E.coli Trans1-T1获得重组菌E.coli Trans1-T1/pTrc99a-csE。

所述重组菌的高密度发酵与高效表达，首先将该菌株活化于LB平板培养基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L)上，于37℃过夜培养后挑取单菌落于LB液体培养基(酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L)中培养16h后按照2％的接种量接种至发酵培养基，其中发酵培养基组成为：酵母粉5g/L，甘油10g/L，蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾8g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸铵1.2g/L，待其OD600长至0.8时，降温至28℃，加入IPTG使其终浓度为0.3mmol/L，控制溶氧与pH分别为30％、7.0，必要时补充500g/L的葡萄糖溶液作为补充碳源，待其诱导产酶12h后结束发酵后收集菌体破碎得到粗酶液。

包含壳聚糖酶基因的重组大肠杆菌E.coli Trans1-T1/pTrc99a-csE。

有益效果：

1、本发明通过将梭菌属中地壳聚糖酶基因通过PCR的方式获得，并将其重组于大肠杆菌工程菌，获得能够高效表达该基因的重组大肠杆菌工程菌E.coli Trans1-T1/pTrc99a-csE，为新酶的挖掘与应用拓宽了资源。

2、本发明所挖掘的壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其与已经报道的壳聚糖酶氨基酸序列最高相似性为34.7％。

3、本发明提供的包含壳聚糖酶基因的重组大肠杆菌E.coli Trans1-T1/pTrc99a-csE，该菌株能够高效表达获得壳聚糖酶，该壳聚糖酶经生物信息学分析表明，该壳聚糖酶属于糖苷水解酶第46家族，具有较高的催化活性，同时经过实验验证，该酶热稳定性及pH稳定性好，最适作用温度为50℃，最适反应pH为6.0，Mg²⁺、Mn²⁺对其活性有一定的促进作用，Cu² ⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺对其活性有一定的抑制作用，具有较高的经济价值和工业应用前景。

附图说明

图1是分离自梭菌属的本发明所述壳聚糖酶的最适作用温度；

图2是分离自梭菌属的本发明所述壳聚糖酶的最适作用pH；

图3水解产物液相色谱分析图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

本发明中，重组菌基础培养基组成为：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L。发酵培养基组成为：酵母粉5g/L，甘油10g/L，蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾8g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸铵1.2g/L。

本发明中，抗生素的使用浓度为：氯霉素25mg/L，硫酸卡那霉素25mg/L，氨苄青霉素钠100mg/L。

实施例1酶基因的获得及重组质粒的构建

通过NCBI比对结果发现，从草莓根际土壤所筛选的梭菌属菌株具有潜在的壳聚糖酶基因，通过选用诺维赞的细菌基因组DNA提取试剂盒提取该菌株基因组，经NCBI比对后选用具有高度同源性的壳聚糖酶基因作为目标序列，设计引物

csE-F：AGTAAAACAAAGATGAAAAATTTACGA

csF-R：ATAAACATCACCATCATTATTGGGATT

分别以从梭菌属基因组DNA为模板，对其进行目的基因序列csE(SEQ ID NO:2)进行扩增，以从该菌中获得本发明所述壳聚糖酶基因片段。反应体系总体积为50μL，2×TaqMax Master Mix 25μL，质粒模板2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddH₂O 21μL。PCR扩增反应程序为首先94℃预变性3min，然后94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min，总共循环30次，最后72℃终延伸10min。利用SanPreP柱式DNA胶回收试剂盒对PCR反应产物进行胶回收。方法参照试剂盒说明书。随后取3ul回收产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(150V，15min)，并利用凝胶成像仪观察。将PCR反应回收产物与经双酶切的pTrc99a质粒片段混合，37℃连接30min，冰浴30min，连接体系：3μL载体，1μL PCR回收片段、4μL CE buffer、2μLExnaseⅡ、10μL ddH₂O。

实施例2含有该壳聚糖酶基因的重组大肠杆菌工程菌的构建从-80℃冰箱取一管大肠杆菌Trans1-T1(购自诺维赞生物科技有限公司)感受态细胞，置于冰上融化；加入上述连接产物10μL轻轻混匀后冰浴30min；将上述混合物在42℃水浴中热击90s，然后立刻放置于冰上5min；加入800μL LB培养基，37℃培养1h，5000rpm离心10min，除去上清液，重悬沉淀；取适量的上述混合物涂布在LB(含卡那霉素25μg/mL和氯霉素25μg/mL)平板上，37℃倒置过夜培养挑取转化子，后提取质粒PCR验证即获得重组菌E.coli Trans1-T1/pTrc99a-csE。

实施例3壳聚糖酶酶活的测定

(1)壳聚糖酶的高密度诱导表达

将成功转入该壳聚糖酶基因的E.coli Trans1-T1/pTrc99a-csE于37℃LB平板过夜培养，挑取单菌落接种到新鲜LB(含卡那霉素25μg/mL和氯霉素25μg/mL)培养基中，37℃振荡过夜培养。以2％的接种量接种到含卡那霉素和氯霉素的发酵培养基中，其中发酵培养基组成为：酵母粉5g/L，甘油10g/L，蛋白胨15g/L，磷酸氢二钾8g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸铵1.2g/L，37℃培养，直到OD₆₀₀达到0.6-0.8时降低温度至28℃，控制溶氧与pH分别为30％、7.0，加入终浓度为0.3mM的IPTG诱导表达8h后，在低温4℃，8000rpm条件下离心5min收集菌体细胞。随后用生理盐水洗涤3次，用0.2M乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 6.0)重悬菌体备用。

(2)粗酶液的制备

用0.2M乙酸-乙酸钠缓冲液(pH 6.0)重悬的细胞在冰浴中用超声破碎仪破碎，脉冲3s，破碎30min。然后在4℃条件下10000rpm离心20min，去除菌体碎片，收集上清液即制得粗酶液。

(3)DNS法测定壳聚糖酶活性

用pH 6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置1％的胶体壳聚糖溶液，于2mL EP中进行反应，反应体系包含30μL稀释的酶液和970μL预热至50℃的1％浓度的壳聚糖溶液，在50℃条件下反应10min，加入1mL DNS溶液终止反应，12000×g条件下离心5min，取上清1mL，100℃水浴5min，迅速冷却后，测量OD₅₄₀。以氨基葡萄糖作为标样，制作标准曲线。一个酶活单位(U)定义为在上述条件下，每分钟产生相当于1μmol氨基葡萄糖的还原糖量所需的酶量。所述壳聚糖酶在上述最佳条件反映下酶活为16.4U/mL。

实施例4壳聚糖酶的酶学性质及生物活性

将实施例3所获得的粗酶液，分别在30℃至80℃范围内选择温度点(间隔5℃)，测定其在不同温度下的酶活力，以最大酶活为100％，以确定该酶的最适作用温度。同时取粗酶液，分别保温于上述不同温度中60min，测定其残存酶活力，以最大酶活为100％，以确定该酶的温度稳定性。

取一定量的粗酶液，分别在pH 3.5-6.0的乙酸钠缓冲液，pH 6.0-8.0的磷酸盐缓冲液中(pH间隔0.5单位)进行反应，测定不同pH下的酶活力，以最大酶活为100％，以确定该酶的最适作用pH。同时取粗酶液分别在pH 3.5-6.0的乙酸钠缓冲液，pH 6.0-8.0的磷酸盐缓冲液中(pH间隔0.5单位)放置60min，回调至pH 6.0后，再测定酶活力，以最大酶活为100％，以确定该酶的pH稳定性。

选择金属离子Mg²⁺，Mn²⁺，Cu²⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Ba²⁺，加入反应混合物中，使其浓度分别为5mmol/L，置于4℃1h后按照上述酶活力测定方法测定酶活力。以不加任何金属离子的粗酶液做对照，比较不同金属离子对酶活性的影响，结果见表1。

表1不同金属离子对壳聚糖酶酶活的影响

金属离子	CK	Mg<sup>2+</sup>	Mn<sup>2+</sup>	Cu<sup>2+</sup>	Ca<sup>2+</sup>	Zn<sup>2+</sup>	Co<sup>2+</sup>	Ba<sup>2+</sup>
									相对酶活(％)	100	108.6	126.8	76.4	74.8	68.9	89.6	64.8

由上述实验结果可知，以不添加任何金属离子作为空白对照，Mg²⁺、Mn²⁺对其活性有一定的促进作用，其中Mn²⁺的促进作用较为明显，Cu²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺对其活性有一定的抑制作用。

实施例5水解产物聚合度分析

将壳聚糖粉末用少量水溶胀后，溶于0.6mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝6.0)中，制成2％的胶体壳聚糖溶液，预热至50℃后按照50U/g壳聚糖的添加量往其中添加粗酶液，恒温水解5h后取样沸水浴10min终止反应，后通过高效液相色谱测定产物聚合度区间。以聚合度为2-10的壳寡糖混标为参考，采用蒸发光散射检测器，Shodex聚乙烯醇氨基柱(NH₂P-50 4E)，采用梯度洗脱的方式，流动相为乙腈/水(0-30min：70％-60％乙腈；30-50min：60％-50％乙腈；50-60min：50％-70％乙腈)，流速为0.6mL/min，柱温30℃，蒸发室温度：50℃，喷雾温度：50℃。

表2水解产物各聚合度占比

聚合度	3	4	5	6	7	8	9
								比例(％)	25.6	32.9	24.8	6.2	7.1	1.5	1.9

由以上结果可知，经酶解反应制得的产物聚合度区间为3-9，主要为3-5，产物聚合度区间集中。

实施例6水解产物稳定性实验

A:将壳聚糖粉末用少量水溶胀后，分别溶于0.6mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝5.0、5.5、6.0)中，制成2％的胶体壳聚糖溶液，预热至50℃后按照50U/g壳聚糖的添加量往其中添加粗酶液，恒温水解5h后取样沸水浴10min终止反应，后通过高效液相色谱测定产物聚合度区间。

B:将壳聚糖粉末用少量水溶胀后，分别溶于0.6mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝6.0)中，制成2％的胶体壳聚糖溶液，分别预热至45℃、50℃、55℃后按照50U/g壳聚糖的添加量往其中添加粗酶液，恒温水解5h后取样沸水浴10min终止反应，后通过高效液相色谱测定产物聚合度区间。

表3不同反应条件对产物聚合度的影响

由上表可以得出，该酶在pH5.0-6.0、反应温度45-55℃区间之内，对其水解产物的聚合度无明显影响，证明该酶的性质不随反应条件的改变而改变。

本发明的壳聚糖酶的水解产物聚合度相对比较集中，能特异性水解获得聚合度在3-5之间的壳寡糖。

表4不同反应条件对转化率的影响

由以上结果可以看出，不同水解条件下对水解转化率有一定的影响，但是并未有，而目前酶法生产壳寡糖的过程当中转化率一般都只有70％-80％左右，较低的转化率带来了较为复杂的后续分离纯化的过程，本发明所提供的酶及其在生产壳寡糖上的应用具有明显的优势与较高的应用价值。

序列表

<110> 苏州科宁多元醇有限公司

<120> 一种来源于梭菌属的壳聚糖酶基因及其重组菌和在生产壳寡糖上的应用

<141> 2020-12-28

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 266

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

Met Lys Asn Leu Arg Lys Leu Val Thr Leu Ala Val Ser Leu Ala Met

1 5 10 15

Cys Leu Ser Phe Cys Ser Ala Ala Leu Ala Ile Thr Ala Asn Ser Glu

20 25 30

Gln Arg Ala Val Ser Leu Gln Leu Ala Thr Val Ser Glu Asn Ser Lys

35 40 45

Thr Lys Phe Val Tyr Asn Tyr Ala Glu Gln Leu Gly Ser Phe Asp Arg

50 55 60

Arg Gly Ile Thr Phe Gly Cys Met Gly Phe Pro Arg Gly Thr Lys Asp

65 70 75 80

Gly Asn Ile Leu Ile His His Tyr Pro Arg Leu Asn Arg Pro Asn Asn

85 90 95

Leu Ala Gln Val Tyr Ser Ser Ile Arg Ser Asn Arg Gln Arg Arg Pro

100 105 110

Ser Arg Gly Trp Asn Ala Arg Arg Tyr Arg Ser Ser Arg Glu Phe Tyr

115 120 125

Ala Arg Cys Lys Val Met Leu Cys Phe Ile Ile Glu Glu Arg Pro Ile

130 135 140

Ile Gly Pro Ser Ser His Val Phe Ser Thr Thr Ser Thr Ser Ser Asn

145 150 155 160

Phe Pro Arg Arg Tyr Thr Ser Thr Asn Phe Ser Ile His Leu Arg Tyr

165 170 175

Val Ser Gln Ser Cys Arg Arg Trp Ser Lys Arg Ile Tyr Gln Ile Gly

180 185 190

Lys Gln Lys Val Arg Trp Ile Thr Glu Gly Trp Tyr Arg Cys Ala Asp

195 200 205

Thr Ser Val Gln Cys Asp Gly Leu Gln Ile Cys Ile Ser Gln Arg Ser

210 215 220

Ser Ser Arg Arg Phe Gly Thr Ser Lys Cys Ile Lys Gln Ile Ile His

225 230 235 240

Ser Ser Ser Cys Arg Phe Glu Thr Arg Leu Ser Phe Tyr Ser Leu Trp

245 250 255

Arg Tyr Phe Gln Tyr Arg Trp Arg Cys Phe

260 265

<210> 2

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

atgaaaaatt tacgaaaatt agttacttta gcagtatctt tggctatgtg tctctcattc 60

tgttcagcag cattagccat tactgcaaat tctgaacaga gagcagtgtc cctccagtta 120

gcgactgtat ctgaaaacag taaaacaaag tttgtttata attatgcaga gcagcttggc 180

tcctttgatc gacgaggaat tacatttgga tgtatgggat ttcctagagg aactaaggat 240

ggaaatatat taatacatca ttatcctcgg ctaaatcgcc ctaataattt ggcccaagta 300

tattccagca ttagatcgaa tagacaacga agaccatcaa gaggatggaa cgcacgaaga 360

tatagaagct ctagagaatt ttatgcaaga tgtaaagtca tgttatgctt cattattgaa 420

gaacgcccaa ttataggacc ttcatcacat gtattctcaa caaccagtac ctctagcaac 480

ttccctcggc gctacacatc cactaacttt agcattcatt tacgatatgt gtctcaatca 540

tgtagaagat ggagcaaaag aatatatcag atcggcaaac aaaaagttag gtggattacc 600

gaaggatggt atagatgcgc agacacttcg gtccagtgtg atggattaca gatatgcatt 660

tctcaaagat catcatccag aaggttcgga acgagtaaat gcataaagca gattattcac 720

agcagctcat gtagatttga aaccagactt tcattttaca gtttatggag atactttcaa 780

tatagatggc gatgtttcta a 801

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

agtaaaacaa agatgaaaaa tttacga 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

ataaacatca ccatcattat tgggatt 27

Claims

1.一种来源于梭菌属的壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述壳聚糖酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种重组质粒，其特征在于，它包含权利要求2所述的壳聚糖酶的基因。

4.一种重组菌，其特征在于，它含有权利要求3所述的重组质粒。

5.壳聚糖酶的制备方法，其特征在于，在营养培养基中培养权利要求4所述的重组菌，收集具有壳聚糖酶活性的多肽。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述营养培养基为酵母粉5.0-7.5 g/L，甘油10.2-12 g/L，蛋白胨11.5-15.0 g/L，磷酸氢二钾6.3-8.6 g/L，磷酸二氢钾1.2-3.0g/L，硫酸镁0.32-0.48 g/L，硫酸铵1.2-2.6 g/L。

7.权利要求1所述壳聚糖酶在生产壳寡糖上的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将壳聚糖酶直接与底物0.1-8%的胶体壳聚糖溶液反应4-8h，即获得壳寡糖。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所制备得到的壳寡糖聚合度区间为3-9，主要分布于3-5，水解效率大于90%。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，反应温度为45-55℃，反应pH为5.0-6.0。