CN103352031B - 一种糖基转移酶基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种糖基转移酶基因，所述基因来源于海洋淤泥宏基因组文库，该基因核苷酸序列全长1332碱基，编码443个氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。该基因能在大肠杆菌表达体系中高效的可溶性表达，由该基因表达的重组酶酶学性质为：以邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷为底物，该酶的最适反应温度为45°C，最适pH为7.0，并且在45℃以下和pH6.0~8.0的范围内具有良好的稳定性。该重组糖基转移酶不仅具有较高的转糖基活性，还具有糖苷键的水解活性，在以30%(w/v)的乳糖溶液为底物，pH7.0，40℃的条件下反应12h，低聚半乳糖的产量高达49.47%。

Description

一种糖基转移酶基因及应用

技术领域

   本发明属于基因工程领域，具体涉及一种糖基转移酶的新基因，尤其涉及所述糖基转移酶在生物制备低聚半乳糖的方面的应用。

背景技术

    功能性低聚糖因具有独特的生理功能而成为重要的功能性食品配料,已引起全世界广泛的关注。近年来，人们对于功能性低聚糖等保健食品的需求越来越大。低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharides, GOS) 又称寡糖，是一种天然存在的功能性低聚糖，也是众多功能性低聚糖中获得最广泛认可的、最为安全的低聚糖之一，它是在乳糖分子的半乳糖或葡萄糖一侧连接了1~9个半乳糖残基而生成的一类低度聚合糖。低聚半乳糖具有调节肠道菌群、保护肝脏、促进排毒、增加机体对矿物元素的吸收、降低胆固醇的含量、抑制病原微生物的感染等保健功能，因此已广泛地应用于食品、医药及饲料领域。

目前，酶法合成是工业化生产低聚半乳糖的主要途径，酶的来源广泛，反应条件温和、反应过程不需添加保护与去保护反应、副产物少等优势，满足了大规模、低成本的低聚糖生产要求。低聚半乳糖主要通过糖苷水解酶 (EC 3.2.1) 和糖基转移酶 (EC 2.4) 通过转糖基反应合成。

糖基转移酶是自然界中广泛存在的一大类酶，能够催化活化的糖连接到不同的受体分子，如寡糖、蛋白、核酸、脂类和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。相对于糖苷水解酶，糖基转移酶具有更高的立体选择性和区域选择性，因而能合成更高产量的低聚半乳糖。尽管如此，糖基转移酶却很难用于低聚半乳糖糖的大规模工业化生产，主要原因是糖基转移酶没有水解糖苷键的活性，不能水解乳糖，因此需要提供活化的糖供体（通常为核苷二磷酸糖类）才能进行转糖基反应，但是活化的糖供体价格昂贵，如果用于低聚半乳糖的工业化生产，则产品成本太高。因此，具有糖苷键水解活性的糖基转移酶将具有广泛的工业应用潜力，一方面，它能水解乳糖产生糖基供体，不需要活化的糖供体，从而大大降低了生产成本，另一方面，由于糖基转移酶所具有的严格的立体选择性和区域选择性，它能合成更高产量的低聚半乳糖。

    由上可知，获得具有糖苷键水解活性的糖基转移酶将具有明显的工业生产优势。微生物数量巨大、种类繁多，广泛分布于不同的物理化学环境，在自然界长期缓慢的进化过程中，产生了功能多样的、在不同生理环境下具有高度精确性和特异性的生物催化剂。所以，自然界的微生物中隐藏了一个巨大的宝藏，蕴藏着大量具有新特性的，适于不同工业生产条件的生物催化剂。然而，自然界中99%的微生物是不可培养的，这大大限制了微生物的多样性资源的开发和利用。宏基因组学就是利用非培养的分子生物学技术、方法和手段，对宏基因组进行系统研究，该方法绕过了未可培养微生物纯化培养的难题，直接开发和利用其中蕴藏的新资源。因此，宏基因组技术为人们开发和利用具有新特性的生物催化剂提供了一条新的途径，也是挖掘具有糖苷键水解活性的糖基转移酶的一种有效方法。

    近年来，宏基因组学在新型生物催化剂的研究中取得了令人瞩目的进展，研究者们已利用宏基因组技术从不同环境样品中筛选到了脂肪酶/酯酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、β-葡萄糖苷酶等多种具有工业应用潜力的生物催化剂，但是到目前为止，国内外尚未有利用糖基转移酶从乳糖中合成低聚半乳糖和通过宏基因组技术从海洋样品中获得糖基转移酶的报道。

发明内容

    为了降低糖基转移酶在合成低聚半乳糖过程中的生产成本，以及提高酶法合成低聚半乳糖的产量，本发明提供一种糖基转移酶的新基因及应用，该基因具有糖苷键水解活性，能利用乳糖为底物合成低聚半乳糖，不需要另外添加昂贵的活化糖供体，而且能合成高产量的低聚半乳糖。

    本发明的第一个目的在于提供一种糖基转移酶的新基因。

    本发明所涉及的糖基转移酶来自于海洋淤泥宏基因组文库，具有以下任意一个特征：

   （1）具有如SEQ ID NO.1 所示核苷酸序列，全长1332个碱基对；

   （2）该基因编码443个氨基酸，序列如SEQ ID NO.2 所示；

   （3）由于遗传密码子的简并性，具有与SEQ NO.1不同的核苷酸序列但是与SEQ NO.2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列。

    本发明的第二个目的在于提供一种糖基转移酶，具有如SEQ ID NO.2 所示的氨基酸序列。

    本发明的第三个目的在于提供上述糖基转移酶的宏基因组学克隆方法。

    本发明所提供的糖基转移酶的宏基因组学克隆方法所采用的技术方案是：通过直接法提取海洋淤泥样品总DNA，将不完全酶切后的基因组DNA片段与载体pUC19?lacZ进行连接，连接产物通过电击转化大肠杆菌DH5α构建宏基因组文库，用5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆子经测序和用ORF Finder分析插入片段的阅读框后，通过PCR的方法克隆目的基因。

    本发明的第四个目的在于提供含有上述糖基转移酶基因的表达载体。

    本发明所提供的含有糖基转移酶基因的表达载体所采用的技术方案是：将所述糖基转移酶基因通过EcoR I和Hind III双酶切后连接至表达载体pET32a (+)上。

    本发明的第五个目的在于提供含有上述糖基转移酶基因的重组菌株。

    本发明所提供的含有糖基转移酶基因的重组菌株所采用的技术方案是：将含有糖基转移酶的表达载体转化至宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)中。

    本发明的第六个目的在于提供重组糖基转移酶的制备方法。

    本发明所提供的重组糖基转移酶的制备方法所采用的技术方案是：将所述重组菌株在一定的条件下进行上述糖基转移酶基因的异源表达，从表达产物中获得重组糖基转移酶。具体来说，是将含有糖基转移酶基因的重组菌株在LB培养基中培养至OD₆₀₀=0.6~1.0时，加入终浓度为0.1~1.2 mM 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），18~37 ℃条件下诱导表达6~14 h，收集菌体，破碎后离心得到酶液。

    本发明所涉及的重组糖基转移酶具有如下酶学性质：以邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷 (o-NPG) 为底物，上述重组糖基转移酶的最适反应温度为45 ℃，在40~55 ℃范围内，酶活力在最高活力的65%以上，在45 ℃以下处理12 h，酶活力仍保持在76%以上，具有良好的热稳定性；上述重组糖基转移酶的最适pH为7.0，在pH 6.0~8.0的范围内活力是最高活力的72%以上，且在pH 6.0~8.0下处理12 h后残余活力仍在75%以上。

    上述不同pH值缓冲液分别为：磷酸氢二钠/柠檬酸缓冲液pH 4.0~6.0；磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液pH 7.0~8.0；甘氨酸/氢氧化钠缓冲液pH 9.0~10.0。

    本发明的第七个目的在于提供上述糖基转移酶在催化乳糖上的应用。

优选地，本发明的糖基转移酶可用于利用乳糖合成低聚半乳糖。

本发明所提供的利用糖基转移酶从乳糖中合成低聚半乳糖所采用的技术方案是：向底物乳糖溶液中加入10U糖基转移酶，30%~50%，pH 7.0~8.0，反应温度为30℃~50℃，反应时间为6h~12h。

优选地，可向底物乳糖溶液中加入10U糖基转移酶，乳糖浓度为30%，pH 7.0，反应温度为40 ℃，反应时间为12 h，低聚半乳糖产量达49.47%。

    本发明的有益效果是：

   （1）本发明从海洋淤泥样品构建的宏基因组文库中筛选到一个糖基转移酶基因，氨基酸序列比对结果分析表明，该基因与目前已知的糖基转移酶同源性较低，属于一个新的糖基转移酶，为糖基转移酶的获得提供了新的途径和酶源。

   （2）本发明所涉及的糖基转移酶具有目前已知的糖基转移酶所没有的新特性：该酶不仅具有较高的转糖基活性，还具有糖苷键的水解活性，所以不同于已报道的糖基转移酶，该酶能够以乳糖为底物合成低聚半乳糖，而不需要另外添加活化的糖供体，从而大大降低了生产成本，简化了生产过程，并填补了国内外利用糖基转移酶以乳糖为底物合成低聚半乳糖研究的空白。

附图说明

    图1本发明的重组糖基转移酶SDS-PAGE图。

    其中：M，标准蛋白分子量Marker；Lane 1，pET32a (+)空载诱导后的破碎液；Lane 2，重组糖基转移酶粗酶液；Lane 3为纯化后的重组糖基转移酶。

    图2o-NP标准曲线图。

    图3本发明的糖基转移酶以o-NPG为底物时的反应最适pH值折线图。

    图4本发明的糖基转移酶以o-NPG为底物时的pH稳定性折线图。

    其中：pH 4.0 (■)，pH 5.0 (□)，pH 6.0 (▲)，pH 7.0 (●)，pH 8.0 (○)，pH 9.0 (△)。

    图5本发明的糖基转移酶以o-NPG为底物时的反应最适温度折线图。

    图6本发明的糖基转移酶以o-NPG为底物时的温度稳定性折线图。

    其中：40 ?С (■)，45 ?С (□)，50 ?С (●)，55 ?С (○)。

    图7本发明的糖基转移酶以乳糖为底物的合成低聚半乳糖的薄层层析（TLC）结果图。

    其中：M，乳糖、葡萄糖和半乳糖的标准品；Lane 1，乳糖与糖基转移酶反应合成的低聚半乳糖。

具体实施方式

实施例1 海洋淤泥宏基因组文库的构建及阳性克隆子的筛选

（1）海洋淤泥样品基因组DNA的提取：称取5 g样品至50 mL 离心管中，加入 13.5 mL

DNA提取缓冲液，剧烈振荡混匀，然后加入100 μL蛋白酶K (10 mg/ml)，反复颠倒5~6次后于37 ℃水浴30 min，然后再加入1.5 mL 20% SDS，65 ℃水浴2 h（期间每隔15 min上下颠倒几次）后6000 g 离心10 min，取上清液，用等体积氯仿抽提2次，10,000 g离心20 min后取上清，加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置1 h后16,000 g离心20 min，弃上清，加入5 mL预冷的70%乙醇后16,000 g离心5 min收集DNA沉淀，风干后用适量TE缓冲液溶解。

    上述DNA提取缓冲液配方为：100 mM 三羟甲基氨基甲烷（Tris），100 mM 乙二胺四乙酸二钠（EDTA–Na₂），1.5 M氯化钠（NaCl），1% 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB），100 mM 磷酸钠缓冲液（pH 8.0）；

    TE缓冲液配方为：10 mM Tris，1 mM EDTA–Na₂，调pH至8.0.

   （2）土壤基因组DNA的纯化：采用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit (OMEGA) 试剂盒，按照说明书进行操作。

   （3）基因组DNA的不完全酶切：使用限制性内切酶Sau3A I对基因组DNA进行不完全酶切，37 ℃酶切5 min后，加入6×loading buffer混合终止反应。在1%琼脂糖凝胶以9 V/cm的电压电泳分离30 min，切胶回收2~10 kb的片段用于连接反应。反应体系如下：

基因组总DNA	1 μg
		10×H Buffer	5 μl
Sau3AI (2 U/μl)	1 μl
			补充水至50 μl

（4）克隆载体pUC19?lacZ的构建：用NdeI和SmaI双酶切pUC19质粒，去除其中大约200 bp的lacZ序列，产生约2400 bp无lacZ的序列，胶回收后用Klenow大片段酶补平末端，用T4 DNA连接酶连接并转化大肠杆菌DH5a，涂布含氨节青霉素的LB平板，挑取白斑菌落、摇菌并提取pUC19?lacZ质粒。用BamH I单酶切pUC19?lacZ质粒，并用碱性磷酸酶(CIAP，TAKARA)去磷酸化制备载体，具体操作方法参照 Alkaline Phosphatase (TAKARA) 说明书。

   （5）基因组DNA片段的连接：凝胶回收的基因组DNA片段与载体pUC19?lacZ在下列连接体系中，16 ℃连接过夜。反应体系如下：

DNA片段	150 ng
		pUC19?lacZ/BamHI(BAP) (100 ng/μl)	0.5 μl
10×T4 Ligation Buffer	1 μl
		T4 连接酶 (350 U/μl)	1 μl
	补充水至10 μl

   （6）重组质粒的电击转化：使用E.Z.N.A. MicroElute DNA Clean-Up Kit (OMEGA) 试剂盒对上述连接产物进行纯化回收，电击转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，转化后的菌体涂布于LB（含100 μg/ml 氨苄青霉素，0.5 mM IPTG和40 μg/ml X-gal）平板上，37 ℃培养过夜。

    上述LB培养基配方为：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L，用去离子水溶解后调至pH 7.0，121 ℃高压灭菌20 min。

   （7）阳性克隆子的筛选及鉴定：通过蓝白斑筛选，将阳性克隆接种到LB液体培养基培养，提质粒后进行酶切，并对重组质粒的插入片段进行测序分析。通过ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/) 分析外源DNA片段中的ORF，结果显示该插入片段含有一个1332 bp的开放阅读框，其核苷酸序列如 SEQ ID NO.1所示，将其命名为Glyt7-2，该阅读框编码443个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，Blast比对结果表明该基因所编码的氨基酸序列属于糖基转移酶家族，且与目前已知的糖基转移酶具有较低同源性（最高同源性为33%），是一个新的糖基转移酶基因。

实施例2 糖基转移酶基因Glyt7-2在大肠杆菌中的表达

（1）糖基转移酶基因的PCR扩增：根据上述糖基转移酶基因的序列设计引物，引入能插入表达载体pET32a (+) (Novagen) 的EcoR I和Hind III双酶切位点，引物序列如下：

     Glyt7-2 F：TGGCACCCGAATTCATGCGGATCGCGTTCCATAAGC

     Glyt7-2 R：CCGTCGATAAGCTTTCATGCCGCGCCAATTGGGAAG

以提取的重组质粒pUC19?lacZ–Glyt7-2为模板，采用上述引物进行PCR扩增反应，其体系如下：

pUC19?lacZ–Glyt7-2模板	5 ng
		5×Buffer	1 μl
dNTP (2.5 mM)	4 μl
		Glyt7-2 F (20 μM)	1 μl
Glyt7-2 R (20 μM)	1 μl
		PrimerSTAR (2.5 U/μl)	0.5 μl
	补充水至50 μl

PCR反应条件如下：

第一阶段：94 ℃预变性3 min；第二阶段：94 ℃变性30 sec，65 ℃退火45 sec，72 ℃延伸1 min，共30个循环；第三阶段：72 ℃延伸10 min；最后于4 ℃保存。反应结束后，取PCR产物5 μl进行凝胶电泳。PCR产物经凝胶电泳鉴定后-20 ℃保存备用。

（2）糖基转移酶基因PCR产物的纯化回收：采用E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (OMEGA) 试剂盒对PCR产物进行纯化回收，按照说明书进行操作。

（3）PCR产物及载体的酶切及纯化：纯化回收后的Glyt7-2 PCR产物与载体pET-32a (+) 分别在37 ℃下进行EcoR I和Hind III过夜双酶切反应，反应体系如下：

酶切产物使用E.Z.N.A. MicroElute DNA Clean-Up Kit (OMEGA) 试剂盒进行纯化回收，按照说明书进行操作。

（4）酶切产物连接：经过双酶切后的糖基转移酶基因Glyt7-2与载体pET-32a(+)在16 ℃连接过夜。连接体系如下：

Glyt7-2的PCR产物(EcoRI/HindIII)	150 ng
		pET-32a (+)(EcoRI/HindIII)	50 ng
10×T4 DNA Ligase Buffer	1 μl
		T4 DNA Ligase (350 U/μl)	1 μl
	补充水至10 μl

（5）连接产物的转化：将含有上述糖基转移酶基因Glyt7-2与表达载体pET-28a-c(+)的连接产物转化大肠杆菌BL21 (DE3)，即得到重组菌株E. coli BL21/pET32a-Glyt7-2。

实施例3 重组糖基转移酶Glyt7-2粗酶液的制备及纯化

    将实施例2所保存的重组菌株接种于含100 μg/ml 氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 ℃剧烈振荡培养至OD₆₀₀=0.6~1.0时，加入终浓度为0.1~1.2 mM（IPTG），18~37 ℃条件下诱导表达6~14 h，收集菌体，破碎后离心得到粗酶液。破碎后的粗酶液用His·Bind Purification Kit (Novagen) 纯化，按照说明书进行操作。SDS–PAGE电泳分析表明（附图1），纯化后的重组糖基转移酶为单一的条带，分子量约为64.5 kDa (其中18 kDa为表达载体上的融合蛋白标签)，与理论预测蛋白分子量 (46.5 kDa) 相符。

实施例4 重组糖基转移酶Glyt7-2的酶学性质

（1）重组糖基转移酶的酶活测定

① 测定原理：邻硝基苯酚-β-半乳糖苷 (o-NPG) 为易溶于水的无色化合物，糖苷水解酶能催化1 mol o-NPG水解生成1 mol邻硝基苯酚 (o-NP)，o-NP在中、碱性范围呈黄色，在420 nm有最大吸收峰。在405 nm有较大吸收峰，为便于使用酶标仪，使用405 nm作为吸收峰。

② 测定方法：取0.25 % (w/v) 的o-NPG溶液400 μL，加入100 μL稀释了100倍的酶液，将反应液置于45 ℃下水浴反应15 min，加入500 μL 10 % Na₂CO₃溶液终止反应并显色，并用磷酸缓冲液 (100 mM, pH 7.0) 稀释1倍，取出300 μL于OD_405 nm处测定吸光值。每次反应重复3次。

③ o-NP标准曲线的绘制 

 称取28 mg o-NP，先溶于1 mL甲醇中，再用磷酸钾缓冲液 (100 mM, pH 7.0)定容于100 mL，配成2 mM o-NP母液。按表1分别加入不同量的o-NP和磷酸钾缓冲液 (100 mM, pH 7.0)，总体积4 mL，测定OD_405 nm的光吸收值。同时，绘制酶活性标准曲线（附图2）。

表1 o-NP标准曲线的绘制

④ 

⑤ 酶活定义：以o-NPG为底物时，重组糖基转移酶的酶活力单位 (U _o-NPG) 定义为：在45°C反应条件下，每分钟分解邻硝基苯酚-β-半乳糖苷 (o-NPG) 释放1 μmol邻硝基酚 (o-NP) 和1 μmol半乳糖所需的酶量为一个酶活力单位。根据o-NP标准曲线，推算出以o-NPG为底物时的β-半乳糖苷酶酶活力单位计算公式：

U _o-NPG (U/mL) = 10 × N × (1592.2 x–19.812)/(15 × 1000)

其中：x，405 mm处光吸收值；15，反应时间15 min；N，稀释倍数；10，将100 μL稀释酶液中的酶活力折算为1 mL的酶活力。

（2）重组糖基转移酶Glyt7-2的最适反应pH值及pH稳定性的测定

    最适反应pH值的测定：设定pH范围为pH 4.0~10.0，以o-NPG为底物测定不同pH条件下重组糖基转移酶Glyt7-2的酶活力，将最高酶活力定为100%，计算相对酶活。结果如附图3所示，上述重组糖基转移酶的最适pH为7.0，在pH 6.0~8.0的范围内活力是最高活力的72%以上，

pH稳定性的测定：取等量的酶液，分别在上述不同pH值（pH4.0~9.0）的缓冲液中4 ℃静置12 h，每隔一段时间取出酶液测定残余酶活，以处理0 min的酶液酶活力为100%，计算相对酶活。结果如附图4所示，上述重组糖基转移酶在pH 6.0~8.0范围内保持稳定，在pH 8.0下处理12 h后残余活力仍在75%以上。

（3）重组糖基转移酶Glyt7-2的最适反应温度及热稳定性的测定

    最适反应温度的测定：在35～65 ℃的温度范围内测定重组糖基转移酶Glyt7-2的酶活力，以酶活力最高者为100%，计算相对酶活。结果如附图5所示，上述重组糖基转移酶的的最适反应温度为45 ℃，在40~55 ℃范围内，酶活力在最高活力的65%以上。

    热稳定性的测定：在100 mM磷酸缓冲液 (pH 7.0)，将重组糖基转移酶Glyt7-2酶液分别置于不同温度 (40～55 ℃)下孵育，每隔一段时间取出酶液测定残余酶活，以处理0 min的酶液酶活力为100%，计算相对酶活。结果如附图6所示，上述重组糖基转移酶在45 ℃以下处理12 h，酶活力仍保持在76%以上，具有良好的热稳定性。

实施例5 重组糖基转移酶Glyt7-2以乳糖为底物的转糖基反应

将4 mL pH 7.0 磷酸钠缓冲液配制的30%（w/v）乳糖溶液，与50 μL（10 U）纯酶液于40 ℃反应12 h，100 ℃煮沸5 min灭活酶液，14000 g离心5 min后取上清液，将上清液稀释成5%（w/v）的糖溶液后进行薄层层析（Thin–Layer Chromatography,TLC）分析。转糖基产物TLC薄板点样后，展层剂展开，雾喷显色剂，于120 ℃烘烤10 min，糖斑点的显色根据其种类从棕黄色至深紫色。如附图7所示，重组糖基转移酶Glyt7-2在水解乳糖的同时发生转糖基作用合成了低聚半乳糖，通过Image J软件对各糖分斑点进行分析，低聚半乳糖的产量为49.47%，是目前所报道的较高水平。

上述展层剂配方为：正丁醇：乙醇：水=5:3:2（v/v/v）；显色剂配方为20% 硫酸+0.5% 3，5–二羟基甲苯；

上述低聚半乳糖产量的计算方式为：GOS产量%= × 100%

以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序 列 表

SEQ ID NO.1 糖基转移酶Glyt7-2核苷酸序列全长

<110>  中山大学

<120>  一种糖基转移酶基因及应用

<130>  2013

<160>  1    

<211>  1332

<212>  DNA

<213>  未知微生物

<400>  1

atgcggatcg cgttccataa gccgcccggg ttgggcgacc atccgttcac ctatgtcccg     60

ttgctggggg gcggcgaccg gcggcttatg ccgtttcgcc tgcgcagcgc ggcagcgatc    120

gggtaccacc tcgccggcgc acgcgaggcg aggaacatct ggcggcgcgc actgtggtac    180

gggctcgcgc ccgattggag cgcgaagctc gacgcggtgg cggcgctcgg catcccggcg    240

atgcaccgtg cggacaagtc gcacgacgcg ggcggcgctc cgcctgaccg cgcagtagag    300

cgcgcccgga tcccgaagag tcaggccgac ctcggcgcgc tggaattccc ggcgctcccg    360

gtcgaccgcg acttcgacgg ccaggacgcc tcgcgggcgt acgccgcttg cctgctgccg    420

ctgctgcgcg aggcgatggg ccgcgccgcg gtcgcgctgc ccgacgccgg cggcgcgtac    480

gcgtcctacc cgcggctctt ggacccggcg cccgcgcgcc tgatccccgc cgcggcggcg    540

gcgctcgtcg ccgtccgctc cctcgacggc cccggcagct ttcgcctgat gcgacggccg    600

gccgcgctgt ttctccgccg cgtgctgtgg gtggtcggct gggaaccggc ccgggacggg    660

gacgaagcgg tccagggcgg gcgcgtgcgc taccgcggcg cggccgcggc gctcgacgag    720

gccggcgtcg ccgatctgtt cgtctggccg gcggagaacg aagccttcgg gatggccctg    780

gcgctcgcgg cgctcgcgca ggcgagcgcc ccgctcggga tggggctgcc ggtggtcgcc    840

gccctggccc aggcgggggc gagcggcggg gtcggcgaaa tcgtcgatca cggcacgacc    900

gggctgctgc cgccgcccgg cgacgcggcc gctttcgcgg cggcgcgccg tgccgtcgcc    960

gtcgagcgac acgccccacc accgagtgca ttgcgccact actgcatcct cgacgcggtg   1020

cgccgcctcc gggttgccgt cgccgacgtc ggggcgcggc gcgcgcgcgc cctgggcccg   1080

agcgtcgccg tagtgcgcga gcacgatctc cggctcgcgg cacagctcgg ctggttgatg   1140

atgagtcggg gtggcggtgg cccgtttggc cagattaccg actggtggcc gcgggcgcgg   1200

 

cctgcgctgg ctcccccgct gctgcgcctg ttgggcggcg ggaccaagca ggtcgcctcg   1260

gccgagtcgg gcccttggga tagctttggc ctgcgcgggc acgagctcgc cttcccaatt   1320

ggcgcggcat ga                                               1332

 

SEQ ID NO.2 糖基转移酶Glyt7-2氨基酸序列全长

<210>  2

<211>  443

<212>  PRT

<213>  未知微生物

<400>  2

Met Arg Ile Ala Phe His Lys Pro Pro Gly Leu Gly Asp His Pro Phe

1               5                   10                  15     

Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Gly Gly Asp Arg Arg Leu Met Pro Phe

            20                  25                  30         

Arg Leu Arg Ser Ala Ala Ala Ile Gly Tyr His Leu Ala Gly Ala Arg

        35                  40                  45             

Glu Ala Arg Asn Ile Trp Arg Arg Ala Leu Trp Tyr Gly Leu Ala Pro

    50                  55                  60                 

Asp Trp Ser Ala Lys Leu Asp Ala Val Ala Ala Leu Gly Ile Pro Ala

65                  70                  75                  80 

Met His Arg Ala Asp Lys Ser His Asp Ala Gly Gly Ala Pro Pro Asp

                85                  90                  95     

Arg Ala Val Glu Arg Ala Arg Ile Pro Lys Ser Gln Ala Asp Leu Gly

            100                 105                 110        

Ala Leu Glu Phe Pro Ala Leu Pro Val Asp Arg Asp Phe Asp Gly Gln

        115                 120                 125            

Asp Ala Ser Arg Ala Tyr Ala Ala Cys Leu Leu Pro Leu Leu Arg Glu

    130                 135                 140                

Ala Met Gly Arg Ala Ala Val Ala Leu Pro Asp Ala Gly Gly Ala Tyr

145                 150                 155                 160

 

Ala Ser Tyr Pro Arg Leu Leu Asp Pro Ala Pro Ala Arg Leu Ile Pro

                165                 170                 175     

Ala Ala Ala Ala Ala Leu Val Ala Val Arg Ser Leu Asp Gly Pro Gly

            180                 185                 190        

Ser Phe Arg Leu Met Arg Arg Pro Ala Ala Leu Phe Leu Arg Arg Val

        195                 200                 205             

Leu Trp Val Val Gly Trp Glu Pro Ala Arg Asp Gly Asp Glu Ala Val

    210                 215                 220                

Gln Gly Gly Arg Val Arg Tyr Arg Gly Ala Ala Ala Ala Leu Asp Glu

225                 230                 235                 240

Ala Gly Val Ala Asp Leu Phe Val Trp Pro Ala Glu Asn Glu Ala Phe

                245                 250                 255    

Gly Met Ala Leu Ala Leu Ala Ala Leu Ala Gln Ala Ser Ala Pro Leu

            260                 265                 270        

Gly Met Gly Leu Pro Val Val Ala Ala Leu Ala Gln Ala Gly Ala Ser

        275                 280                 285            

Gly Gly Val Gly Glu Ile Val Asp His Gly Thr Thr Gly Leu Leu Pro

    290                 295                 300                

Pro Pro Gly Asp Ala Ala Ala Phe Ala Ala Ala Arg Arg Ala Val Ala

305                 310                 315                 320

Val Glu Arg His Ala Pro Pro Pro Ser Ala Leu Arg His Tyr Cys Ile

                325                 330                 335    

Leu Asp Ala Val Arg Arg Leu Arg Val Ala Val Ala Asp Val Gly Ala

            340                 345                 350        

Arg Arg Ala Arg Ala Leu Gly Pro Ser Val Ala Val Val Arg Glu His

        355                 360                 365            

Asp Leu Arg Leu Ala Ala Gln Leu Gly Trp Leu Met Met Ser Arg Gly

370                 375                 380                

Gly Gly Gly Pro Phe Gly Gln Ile Thr Asp Trp Trp Pro Arg Ala Arg

385                 390                 395                 400

 

Pro Ala Leu Ala Pro Pro Leu Leu Arg Leu Leu Gly Gly Gly Thr Lys

                405                 410                 415    

Gln Val Ala Ser Ala Glu Ser Gly Pro Trp Asp Ser Phe Gly Leu Arg

            420                 425                 430        

Gly His Glu Leu Ala Phe Pro Ile Gly Ala Ala

        435                 440  

Claims (10)

1.一种糖基转移酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

2.一种糖基转移酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或其核苷酸序列是与SEQ ID NO.1不同，但是能够编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。

3.一种表达载体，其特征是：所述的表达载体含有权利要求2所述的糖基转移酶基因。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征是：出发载体为pET32a (+)。

5.一种重组菌株，其特征是：权利要求3所述的表达载体转化至宿主细胞中形成的重组菌株。

6.一种重组糖基转移酶制备方法，其特征是：将权利要求5所述的重组菌株在LB培养基中培养至OD600=0.6~1.0时，加入终浓度为0.1~1.2mM 的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），18~37 ℃条件下诱导表达6~14h，收集菌体，破碎后离心得到粗酶液。

7.如权利要求1所述的糖基转移酶在催化乳糖中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，应用条件为：温度30~60 ℃，pH 5.0~9.0。

9.一种应用重组糖基转移酶制备低聚半乳糖的方法，其特征是：权利要求1所述的糖基转移酶以乳糖为底物催化合成低聚半乳糖。

10.如权利要求9所述应用重组糖基转移酶制备低聚半乳糖的方法，其特征是：所述乳糖浓度为30%~50%，pH 7.0~8.0，反应温度为30℃~50℃，反应时间为6h~12h。