CN109022397A

CN109022397A - 一种降解主产物为新琼二糖的内切型β-琼胶酶及其应用

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Publication number: CN109022397A
Application number: CN201811116706.9A
Authority: CN
Inventors: 吴中宝
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2018-12-18

Abstract

本发明涉及一种降解主产物为新琼二糖的内切型β‑琼胶酶及其应用。所述β‑琼胶酶为一种新型β‑琼胶酶AgaB10，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的β‑琼胶酶为一种人工设计的新型β‑琼胶酶，包含有350个氨基酸。其氨基酸序列与已有的β‑琼胶酶序列相似度仅为67%。本发明所述的β‑琼胶酶AgaB10降解方式为内切，具有产物均一的特性，降解产物中新琼二糖的比例高达86.2%。另外，本发明所述的β‑琼胶酶AgaB10性质稳定，产量大，具有一定的工业化应用潜质。

Description

一种降解主产物为新琼二糖的内切型β-琼胶酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种降解主产物为新琼二糖的内切型β-琼胶酶及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

琼胶是石花菜等红藻的细胞壁组成成分，是海洋中含量最多的海藻多糖之一。琼胶的结构复杂，由1,3连接的β-D-半乳吡喃糖和1,4连接的3,6-内醚-α-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接组成骨架，并包含硫酸基、甲基等取代基。琼胶酶是指能够降解琼胶，产生琼胶寡糖的一类糖苷水解酶，主要来源于海洋细菌，少部分来源于陆生环境中的细菌和海洋软体动物。根据琼胶酶降解琼脂糖时的糖苷键和产物不同，琼胶酶可以分成两大类：α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶作用于琼脂糖的α-1,3糖苷键，生成琼寡糖；β-琼胶酶作用于β-1,4糖苷键，降解产物为新琼寡糖（2-6糖）。β-琼胶酶降解所产生的新琼寡糖具有多种生理活性，如抑制细菌生长，抗肿瘤，免疫增强效应等。

寡糖自身的理化性质接近，分离纯化得到单一组分需要进行凝胶过滤层析，产率低、成本高，是阻碍其高值化应用的重要瓶颈。因此，发现一种β-琼胶酶可特异性降解琼胶，产生的降解产物中寡糖成分单一具有重要的应用意义。但是，目前报道的β-琼胶酶酶解产物成分复杂，通常包含有新琼二糖、四糖和六糖。目前尚未见报道有均一性产生新琼二糖的β-琼胶酶。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种特异性产生新琼二糖的β-琼胶酶AgaB10及其应用。β-琼胶酶AgaB10的包含有350个氨基酸。与已有β-琼胶酶的氨基酸相似度仅为67%。该酶降解方式为内切，降解产物中新琼二糖的比例高达86.2%。

一方面，本发明提供一种具有产物均一特性的β-琼胶酶AgaB10，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

MNLKKHSICVLFCFTSLISLNAQNKITYQKVEARQNALDPKWVAYDAKTIDKLPGFKIKKQLPGSIYGGSMWQKEATGFFRTEKIDNRWWIIDPEGYPYIYKGIAVFNAGRSENQQKAFDKKYGSKENWVKQESKLLRDNFVKISLSKPLEEGDFIGFNHPFGIGELEYDSNTLSKLSYPILDKMGQFNAEKWRGKLHSIDTLEFLGNQDRMTWPQKILSNKQLKTMAEEESQELVKWSKNTPTQDIYGGIGKRPQFRASKYFRTEKYKGRWYFVSPNGYQATFSHTVPDGRSKFNGWADGPKLAATGYFHTQKYQGKWTLVDPQGYLFFSNGIANVRMSNTSTITGYDF

另一方面，本发明还提供一种具有产物均一特性的β-琼胶酶AgaB10对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGAACTTAAAAAAACATTCTATTTGTGTATTATTCTGTTTCACATCTTTAATTTCTTTAAACGCACAAAACAAAATTACATACCAAAAAGTAGAAGCACGTCAAAACGCATTAGATCCAAAATGGGTAGCATACGATGCAAAAACAATTGATAAATTACCAGGTTTCAAAATTAAAAAACAATTACCAGGTTCTATTTACGGTGGTTCTATGTGGCAAAAAGAAGCAACAGGTTTCTTCCGTACAGAAAAAATTGATAACCGTTGGTGGATTATTGATCCAGAAGGTTACCCATACATTTACAAAGGTATTGCAGTATTCAACGCAGGTCGTTCTGAAAACCAACAAAAAGCATTCGATAAAAAATACGGTTCTAAAGAAAACTGGGTAAAACAAGAATCTAAATTATTACGTGATAACTTCGTAAAAATTTCTTTATCTAAACCATTAGAAGAAGGTGATTTCATTGGTTTCAACCATCCATTCGGTATTGGTGAATTAGAATACGATTCTAACACATTATCTAAATTATCTTACCCAATTTTAGATAAAATGGGTCAATTCAACGCAGAAAAATGGCGTGGTAAATTACATTCTATTGATACATTAGAATTCTTAGGTAACCAAGATCGTATGACATGGCCACAAAAAATTTTATCTAACAAACAATTAAAAACAATGGCAGAAGAAGAATCTCAAGAATTAGTAAAATGGTCTAAAAACACACCAACACAAGATATTTACGGTGGTATTGGTAAACGTCCACAATTCCGTGCATCTAAATACTTCCGTACAGAAAAATACAAAGGTCGTTGGTACTTCGTATCTCCAAACGGTTACCAAGCAACATTCTCTCATACAGTACCAGATGGTCGTTCTAAATTCAACGGTTGGGCAGATGGTCCAAAATTAGCAGCAACAGGTTACTTCCATACACAAAAATACCAAGGTAAATGGACATTAGTAGATCCACAAGGTTACTTATTCTTCTCTAACGGTATTGCAAACGTACGTATGTCTAACACATCTACAATTACAGGTTACGATTTC

另一方面，本发明还提供一种具有产物均一特性的β-琼胶酶AgaB10的制备方法。

另一方面，本发明还提供了所述β-琼胶酶AgaB10在水解琼胶中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述β-琼胶酶AgaB10在制备新琼二糖中的应用。

另一方面，一种水解琼胶的方法，所选用的β-琼胶酶为AgaB10。

优选：所述裂解条件中反应温度为10~60℃。最适反应温度为40℃。

优选：所述产物均一特性中降解主产物为新琼二糖，可占到产物总量的86.2%。

有益效果：

1.本发明的β-琼胶酶AgaB10为人工设计的合成序列，包含有350个氨基酸，其氨基酸序列与已有的β-琼胶酶序列相似度仅为67%，为一个结构与功能新颖的β-琼胶酶。

2.本发明的β-琼胶酶AgaB10经5 L发酵后，每毫升发酵液酶活力高达329 U。并且，该酶性质稳定，且具有产物均一的特性，这种新颖的性质能够促进其工业化应用。

3.本发明涉及的β-琼胶酶AgaB10基因序列为人工设计，全合成序列。本发明还提供了一种制备该新型β-琼胶酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将AgaB10基因异源重组到大肠杆菌，并利用镍柱对其进行分离纯化，研究了其降解方式和降解产物，发现其降解方式为内切，且具有产物均一的特性，酶解产物中新琼二糖的比例高达86.2%。本发明所述的β-琼胶酶AgaB10产量大，性质稳定，具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明β-琼胶酶AgaB10蛋白质分离纯化图（M，蛋白质标准品；1，纯化所得β-琼胶酶AgaB10）；

图2为本发明β-琼胶酶AgaB10的最适反应温度；

图3为粘度法检测β-琼胶酶AgaB10的降解方式；

图4为薄层层析（TLC）法检测本发明β-琼胶酶AgaB10的酶解产物（M，新琼寡糖4糖DP4标准品、新琼寡糖2糖DP2标准品；0，酶解前底物；1，酶解后产物）；

图5为高效液相（HPLC）法检测本发明β-琼胶酶AgaB10酶解产物（27.7分钟出峰为新琼四糖DP4，29.5分钟出峰为新琼二糖DP2）。

具体实施方式

实施例1 β-琼胶酶AgaB10的人工设计及序列分析

本发明所述β-琼胶酶基因agaB10为人工设计，全合成序列（华大基因公司合成），包含有1,050个碱基序列，编码350个氨基酸序列。利用NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/中的保守结构域分析Conserved domain (CDD, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)和多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool (Blast,https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)发现，该序列C端包含有一个β-琼胶酶多糖水解酶第50家族（GHfamily 50）的保守区，N端包含有一个碳水化合物结合结构域。Blast分析发现，与AgaB10氨基酸序列相似度最高的琼胶酶序列仅为67%。

实施例2 β-琼胶酶AgaB10的基因克隆与重组表达

将实施例1中全合成的agaB10基因序列以限制性内切酶Nco I和Xho I（购自大连宝生物公司）为酶切位点并设计酶切位点保护碱基，设计重组引物如下（下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基）：

正向引物：SEQ ID NO.3：PAgaB10EF：

5’- CATG CCATGGGTATGAACTTAAAAAAACATTC -3’ (Nco I)

反向引物：SEQ ID NO.4：PAgaB10ER：

5’- CCG CTCGAGGAAATCGTAACCTGTAAT -3’ (Xho I)

利用上述重组引物PCR扩增所述β-琼胶酶基因，PCR所用高保真DNA聚合酶PrimerstarHS购自大连宝生物公司。具体PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟。

将PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。将购买自美国Invitrogen公司的pET22b (+)质粒DNA (100 ng)，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系（温度、时间、DNA用量等）均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

将经过双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体，参照DNA连接酶说明书（购自大连宝生物公司）进行连接；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株（购自大连宝生物公司），涂布在含有50 μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上，37℃培养16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至含有50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中（50 mL尖底离心管装载5 mL液体培养基），在37℃ 180 rpm的摇床中培养过夜。利用质粒提取试剂盒（购自大连宝生物公司）按照产品说明书提取菌液中的质粒，通过Nco I和Xho I双酶切鉴定阳性克隆并进行序列测定；选择与目的基因（SEQ ID 1）序列一致的单克隆所提取的质粒，将其命名为pET22b-AgaB10。

参照产品说明书，将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)（购自大连宝生物公司），将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-AgaB10，保存在-80℃备用。

实施例3 β-琼胶酶AgaB10的发酵工艺及纯化制备方法

将实施例2中构建并保存在-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-AgaB10在LB固体平板上划线，37℃培养16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至含有50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中（500 mL锥形瓶装载50 mL液体培养基），在37℃ 180 rpm的摇床中培养至OD₆₀₀=0.6。5 L发酵罐装载60% (3 L)的Terrific Broth (TB)培养基，并提前灭菌处理；发酵罐中添加50 μg/mL氨苄青霉素，将锥形瓶中培养好的菌液按照2%的接种量接种至5 L发酵罐中。调整初始通气量为50 L/h，初始转速为350 rpm，温度控制在37℃，溶氧控制在15-40%；当菌体生长到OD₆₀₀=5.0时，加入终浓度为0.1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在22℃诱导76 h。酶活力检测方法为：100 μl酶液加入900 μl 0.3%琼胶底物（20 mM 磷酸盐缓冲液，pH=7.6），在40℃下反应10 min，加入DNS试剂停止反应，沸水中煮沸10分钟，用分光光度计测定A520数值，根据标准曲线计算酶活力。每毫升发酵液酶活力高达329 U。

发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液；3 L发酵上清液分10批次（每次300 mL）上样于5 mL镍离子亲和层析柱，利用50 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150 mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将150 mM的咪唑洗脱后所得组分，透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子仿生亲和纯化，蛋白回收率达到72.1%，蛋白纯度达到95%以上，如图1所示。

实施例4 β-琼胶酶AgaB10的最适反应温度测定

将实施例3中纯化所得β-琼胶酶100 μl加入900 μl 0.3%琼胶底物（20 mM 磷酸盐缓冲液，pH=7.6），在不同温度（10-60℃）下反应10 min，加入DNS试剂停止反应，沸水中煮沸10分钟，用分光光度计测定A520数值。以最高酶活力为100%，计算不同温度下AgaB10的相对酶活力。如图2所示，β-琼胶酶AgaB10的最适反应温度为40℃。

实施例5 β-琼胶酶AgaB10降解方式的粘度法测定

使用乌氏粘度计进行降解方式的确定，100 ul酶液（30 U）加入9 ml 0.3%褐藻胶底物，30℃反应不同时间（1、5、10、15、30、60 min），煮沸10 min终止反应。在室温条件下，利用乌氏粘度计计算不同酶解时间的产物粘度。同时，利用DNS法（OD520）测定不同酶解时间的产物的吸光度变化，测定对应的酶活力。通过测定结果（图3）可知，酶解反应初期（1-5分钟），产物粘度急剧下降，而此时DNS法检测的酶解产物形成的寡糖还原端没有急剧增加，说明AgaB10的酶解方式为内切。

实施例6 β-琼胶酶AgaB10酶解产物薄层层析分析

将实施例3中纯化所得β-琼胶酶AgaB10纯酶（10-20 U）与0.1%琼胶在30℃下孵育6 h，然后在高效薄层层析板（HPTLC）检测。具体为：TLC把预先在100℃烘箱中活化2 h的HPTLC层析板裁剪成7 cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂（正丁醇:冰乙酸:水=2:1:1）的展缸中20 min，吹干层析板，浸入显色剂（苯胺二苯胺）中2s，取出吹干，高温烘烤，至样品出现。如图4所示，与标准品迁徙率比较发现，β-琼胶酶AgaB10酶解主产物为新琼二糖（DP2）。

实施例7 β-琼胶酶AgaB10酶解产物高效液相分析

将实施例6中酶解产物，12,000 g离心10分钟，弃沉淀，将上清20 μl上样于预平衡（0.2M的碳酸氢铵）的凝胶过滤柱（Superdex peptide 10/300）。流速为0.6 ml/min，流动相为0.2 M的碳酸氢铵，检测时间为40分钟，检测器为视差检测器。如图5所示，按照凝胶过滤柱说明书，及标准糖出峰时间比对，27.7分钟出峰为新琼四糖，29分钟出峰为新琼二糖。通过计算峰面积得出各组分在最终产物中所含的比例。β-琼胶酶AgaB10酶解产物中新琼二糖的比例高达86.2%。

序列表

<110> 吴中宝

<120> 一种降解主产物为新琼二糖的内切型β 琼胶酶及其应用

<141> 2018-09-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 350

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Leu Lys Lys His Ser Ile Cys Val Leu Phe Cys Phe Thr Ser

1 5 10 15

Leu Ile Ser Leu Asn Ala Gln Asn Lys Ile Thr Tyr Gln Lys Val Glu

20 25 30

Ala Arg Gln Asn Ala Leu Asp Pro Lys Trp Val Ala Tyr Asp Ala Lys

35 40 45

Thr Ile Asp Lys Leu Pro Gly Phe Lys Ile Lys Lys Gln Leu Pro Gly

50 55 60

Ser Ile Tyr Gly Gly Ser Met Trp Gln Lys Glu Ala Thr Gly Phe Phe

65 70 75 80

Arg Thr Glu Lys Ile Asp Asn Arg Trp Trp Ile Ile Asp Pro Glu Gly

85 90 95

Tyr Pro Tyr Ile Tyr Lys Gly Ile Ala Val Phe Asn Ala Gly Arg Ser

100 105 110

Glu Asn Gln Gln Lys Ala Phe Asp Lys Lys Tyr Gly Ser Lys Glu Asn

115 120 125

Trp Val Lys Gln Glu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Asn Phe Val Lys Ile

130 135 140

Ser Leu Ser Lys Pro Leu Glu Glu Gly Asp Phe Ile Gly Phe Asn His

145 150 155 160

Pro Phe Gly Ile Gly Glu Leu Glu Tyr Asp Ser Asn Thr Leu Ser Lys

165 170 175

Leu Ser Tyr Pro Ile Leu Asp Lys Met Gly Gln Phe Asn Ala Glu Lys

180 185 190

Trp Arg Gly Lys Leu His Ser Ile Asp Thr Leu Glu Phe Leu Gly Asn

195 200 205

Gln Asp Arg Met Thr Trp Pro Gln Lys Ile Leu Ser Asn Lys Gln Leu

210 215 220

Lys Thr Met Ala Glu Glu Glu Ser Gln Glu Leu Val Lys Trp Ser Lys

225 230 235 240

Asn Thr Pro Thr Gln Asp Ile Tyr Gly Gly Ile Gly Lys Arg Pro Gln

245 250 255

Phe Arg Ala Ser Lys Tyr Phe Arg Thr Glu Lys Tyr Lys Gly Arg Trp

260 265 270

Tyr Phe Val Ser Pro Asn Gly Tyr Gln Ala Thr Phe Ser His Thr Val

275 280 285

Pro Asp Gly Arg Ser Lys Phe Asn Gly Trp Ala Asp Gly Pro Lys Leu

290 295 300

Ala Ala Thr Gly Tyr Phe His Thr Gln Lys Tyr Gln Gly Lys Trp Thr

305 310 315 320

Leu Val Asp Pro Gln Gly Tyr Leu Phe Phe Ser Asn Gly Ile Ala Asn

325 330 335

Val Arg Met Ser Asn Thr Ser Thr Ile Thr Gly Tyr Asp Phe

340 345 350

<210> 2

<211> 1050

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaacttaa aaaaacattc tatttgtgta ttattctgtt tcacatcttt aatttcttta 60

aacgcacaaa acaaaattac ataccaaaaa gtagaagcac gtcaaaacgc attagatcca 120

aaatgggtag catacgatgc aaaaacaatt gataaattac caggtttcaa aattaaaaaa 180

caattaccag gttctattta cggtggttct atgtggcaaa aagaagcaac aggtttcttc 240

cgtacagaaa aaattgataa ccgttggtgg attattgatc cagaaggtta cccatacatt 300

tacaaaggta ttgcagtatt caacgcaggt cgttctgaaa accaacaaaa agcattcgat 360

aaaaaatacg gttctaaaga aaactgggta aaacaagaat ctaaattatt acgtgataac 420

ttcgtaaaaa tttctttatc taaaccatta gaagaaggtg atttcattgg tttcaaccat 480

ccattcggta ttggtgaatt agaatacgat tctaacacat tatctaaatt atcttaccca 540

attttagata aaatgggtca attcaacgca gaaaaatggc gtggtaaatt acattctatt 600

gatacattag aattcttagg taaccaagat cgtatgacat ggccacaaaa aattttatct 660

aacaaacaat taaaaacaat ggcagaagaa gaatctcaag aattagtaaa atggtctaaa 720

aacacaccaa cacaagatat ttacggtggt attggtaaac gtccacaatt ccgtgcatct 780

aaatacttcc gtacagaaaa atacaaaggt cgttggtact tcgtatctcc aaacggttac 840

caagcaacat tctctcatac agtaccagat ggtcgttcta aattcaacgg ttgggcagat 900

ggtccaaaat tagcagcaac aggttacttc catacacaaa aataccaagg taaatggaca 960

ttagtagatc cacaaggtta cttattcttc tctaacggta ttgcaaacgt acgtatgtct 1020

aacacatcta caattacagg ttacgatttc 1050

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg gtatgaactt aaaaaaacat tc 32

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagg aaatcgtaac ctgtaat 27

Claims

1.一种具有产物均一特性的β-琼胶酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的β-琼胶酶所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的β-琼胶酶在水解大分子琼胶中的应用。

4.如权利要求1所述的β-琼胶酶在制备新琼二糖中的应用。

5.一种水解琼胶的方法，其特征是，所选用的β-琼胶酶为权利要求1所述的具有产物均一特性的β-琼胶酶。

6.如权利要求5所述的方法，其特征是，水解条件中反应温度为10~60℃，最适反应温度为40℃。