CN110713997B

CN110713997B - 一种降解产物均一的琼胶酶及其应用

Info

Publication number: CN110713997B
Application number: CN201911065858.5A
Authority: CN
Inventors: 廖祥儒; 李静; 杨邵岚; 黄琳; 蔡宇杰; 管政兵
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-11-04
Filing date: 2019-11-04
Publication date: 2022-02-01
Anticipated expiration: 2039-11-04
Also published as: CN110713997A

Abstract

本发明公开了一种降解产物均一的琼胶酶及其应用，属于酶工程领域。本发明将类芽孢杆菌(Paenibacillus odorifer)来源的琼胶酶AgaP1(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)在大肠杆菌中异源表达，其中粗酶液中琼脂糖和琼脂粉为底物的酶活分别为5716.68U/L和4116.96U/L。纯化得到的琼胶酶AgaP1纯酶液能够降解琼脂糖得到单一降解产物新琼二糖，是一种具有工业应用前景的琼胶酶。

Description

一种降解产物均一的琼胶酶及其应用

技术领域

本发明涉及一种降解产物均一的琼胶酶及其应用，属于酶工程领域。

背景技术

琼胶又名琼脂，是从石花菜、江蓠等红藻提取出的多糖，属于三大海藻胶之一。它的主要组成成分是琼脂糖和琼脂胶，琼脂糖是由1,3糖苷键连接的β-D-半乳糖(G)和由1,4糖苷键连接的3,6-内醚-α-L-半乳糖(LA)残基重复交替连接成的线性多糖分子，不含硫酸酯(盐)的非离子型多糖，是形成凝胶的组分。琼脂胶的结构是在交联的半乳糖糖链上常含有D-半乳糖、3,6-半乳糖苷、半乳糖醛酸以及硫酸基、羧酸、丙酮酸等电荷基团，并结合着钙、镁等无机元素。

琼胶酶是指能够降解琼胶，产生琼胶寡糖的一类糖苷水解酶，主要来源于海洋细菌，少部分来源于陆生环境中的细菌以及海洋软体动物。根据琼胶酶降解糖苷键和产物的不同，琼胶酶可以分成α-琼胶酶和β-琼胶酶。α-琼胶酶作用于琼脂糖的α-1,3糖苷键，生成琼寡糖；β-琼胶酶作用于β-1,4糖苷键，降解产物为新琼寡糖。β-琼胶酶降解所产生的新琼二糖对肠道菌群的生长还具有显著的益生元效应，也可以通过抑制黑色素的合成达到美白效果。

运用酸解法和酶解法制备琼脂寡糖都会出现产物不均一的问题，而因为寡糖自身的理化性质接近，得到单一组分需要进行分离纯化，导致产率低成本高，阻碍了其高值化应用。因此，发现一种可特异性降解琼胶产生的单一寡糖成分的β-琼胶酶具有重要的应用意义。但是，目前报道的β-琼胶酶酶解产物成分复杂，通常包含有新琼二糖、四糖和六糖。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种降解产物均一的琼胶酶，含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明的第二个目的是提供编码上述琼胶酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，上述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供含上述基因的质粒或载体。

本发明的第四个目的是提供表达上述琼胶酶的细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞的宿主包括并不限于大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞的宿主包括并不限于大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述细胞是以pColdII为表达载体。

本发明的第五个目的是提供一种产琼脂酶的方法，是先在大肠杆菌中表达上述琼脂酶，得到表达上述琼脂酶的基因工程菌，再应用该基因工程菌进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的培养基为LB培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为将基因工程菌E.coli BL21-pColdII-AgaP1接种于LB培养基中，35-39℃，200-220rmp培养10-15h得到种子液，然后按1％-10％的接种量(V/V)将上述种子液接种于LB培养基中，35-39℃培养至OD₆₀₀为0.4-0.6，以终浓度为0.2-0.5mM的IPTG作为诱导剂，于12-18℃，200-220rmp培养20-30h。。

本发明的第六个目的是提供一种产新琼二糖的方法，是以琼脂糖底物，添加含上述琼脂酶的粗酶液或表达上述琼脂酶的细胞，进行降解反应。

在本发明的一种实施方式中，每克琼脂糖添加100U-500U粗酶液或细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述降解反应的pH为4.0-9.0。

在本发明的一种实施方式中，所述降解反应的温度为20-60℃。

在本发明的一种实施方式中，所述降解的时长为0.5-6h。

在本发明的一种实施方式中，所述降解具体为：将琼胶酶粗酶液加入到终浓度为0.1-0.5％(m/V)的琼脂糖溶液中在20-60℃水浴0.5-6h。

在本发明的一种实施方式中，反应过程中添加K⁺,Ca²⁺,Fe³⁺中的一种或多种。

本发明的第七个目的是提供上述琼脂酶在制药、化工或化妆品领域中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明将解类芽孢杆菌(Paenibacillus odorifer)来源的琼胶酶AgaP1(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)在大肠杆菌中异源表达，粗酶液中琼脂糖和琼脂粉为底物的酶活分别为5716.68U/L和4116.96U/L，纯化得到的琼胶酶(AgaP1)以琼脂糖和琼脂粉为底物的比酶活，分别为694.61U/mg和490.11U/mg。

(2)纯化得到的琼胶酶AgaP1纯酶液可以降解琼脂糖得到单一降解产物新琼二糖，具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1：最适反应温度。

图2：最适反应pH。

图3：温度稳定性。

图4：pH稳定性。

图5：薄层层析(TLC)法检测本发明琼胶酶AgaP1的酶解产物(M1：新琼寡糖四糖DP4标准品；M2：新琼寡糖二糖DP2标准品；1：酶解前底物；2,3,4分别为酶解1h、2h、6h后产物)。

具体实施方式

(1)以琼脂糖或琼脂粉为底物测定琼胶酶酶活的方法：

DNS试剂：3,5-二硝基水杨酸3.15g，溶于500mL的蒸馏水边搅拌边溶解，水浴至45℃，于热溶液中依次加入NaOH 20g，酒石酸钾91g，无水亚硫酸钠2.5g，苯酚2.5mL，搅拌，降至室温，再定容到1000mL，用可避光棕色的试剂瓶保存，室温下放置7d后使用，有效期是6个月。

酶活力检测方法为：100μL酶液加入900μL 0.3％琼脂糖底物(磷酸盐缓冲液，pH＝7)，在40℃下反应30min，加入DNS试剂停止反应，沸水中煮沸5分钟，用分光光度计测定A540数值，根据标准曲线计算酶活力。

(2)琼胶酶蛋白浓度的测定：根据Bradford蛋白定量试剂盒方法，将稀释一定倍数的酶液与G250染色液混合，用酶标仪测定595nm处的吸光值，根据蛋白浓度标曲计算蛋白浓度。比酶活(U/mg)＝酶活(U/mL)×[蛋白浓度(mg/mL)]^-1。

实施例1：基因工程菌的构建

根据类芽孢杆菌(Paenibacillus odorifer)全基因组序列，设计特异性引物(表1)，以类芽孢杆菌基因组为模板，F1、R1为引物进行PCR扩增。得到目的产物后，送至天霖生物科技(无锡)有限公司测序，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示(氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示)的琼胶酶AgaP1基因序列。将PCR产物和质粒载体pColdII用限制性内切酶KpnI和XbaI进行双酶切，连接得到重组质粒。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，得到重组菌E.coli BL21-pColdII-AgaP1。

表1引物序列

实施例2：琼胶酶(AgaP1)的表达与纯化

LB培养基(g/L)：氯化钠10，胰蛋白胨10，酵母膏5，pH 7。

以原始菌株E.coli BL21(DE3)和空载菌株E.coli BL21(DE3)中转入pClodII质粒)作为对照，将重组大肠杆菌E.coli BL21-pColdII-AgaP1接种于含有100mg/mL氨苄的LB液体培养基中，37℃，200rmp培养12h，然后将500μL上述种子液接种于含有50μL氨苄的50mLLB培养液中，37℃培养2.5h，至OD₆₀₀为0.5，将摇床降温至15℃，静置30min。每瓶加入20μL终浓度为0.2mM的IPTG作为诱导剂，以不加诱导剂作为对照组，于15℃，200rmp培养24h。

收集菌液，4℃，8000rmp离心10min后得到菌体，加入5mL磷酸盐缓冲液(0.02mol/L，pH 7.0)重悬菌体，超声破碎仪破碎，离心收集上清液得到粗酶液。将上述得到的粗酶液采用AKTA avant 150蛋白纯化系统进行镍柱纯化得到AgaP1酶液，测得AgaP1的浓度为2.96mg/mL，用于后续实验。

实施例3：琼胶酶(AgaP1)的酶活测定

在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7)中，以琼脂糖为底物，20-60℃范围内，每隔10℃，琼胶酶AgaP1酶活，可知琼胶酶AgaP1的最适温度为40℃(见图1)。在最适反应温度40℃条件下，pH 4.0-9.0范围内，每隔1个单位，测定酶活，确定较佳反应pH为7.0(见图2)。

在磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.0)中，40℃条件下，分别以0.3％的琼脂糖和琼脂粉为底物测定实施例2中得到的粗酶液的酶活以及纯化得到的琼胶酶AgaP1的比酶活，其中粗酶液中AgaP1的酶活分别为5716.68U/L和4116.96U/L，纯化得到的琼胶酶AgaP1的比酶活分别为694.61U/mg和490.11U/mg。

温度稳定性：将琼胶酶(AgaP1)酶液300μL，在pH为7.0时分别在4,20,30,40,50,60,70℃中保存1h后测定剩余酶活，以酶活最高的设置为100％。结果显示：琼胶酶AgaP1在40℃放置1h后酶活性依然保持在70％以上，具有良好的温度稳定性(见图3)。

表2温度稳定性

pH稳定性：将300μL琼胶酶(AgaP1)酶液在温度40℃条件下，分别在pH4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0中保存1h后测定剩余酶活，以酶活最高的设置为100％。结果显示：琼胶酶AgaP1在pH 5.0-8.0范围内放置1h后酶活性保持在45％以上，具有良好的pH稳定性(见图4)。

表3 pH稳定性

实施例4：金属离子对琼胶酶(AgaP1)的影响

在900μL琼脂糖浓度0.3％的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(pH 7.0)中，40℃下，加入100μL琼胶酶(AgaP1)酶液，5mM不同金属离子(Na⁺,K⁺,Mg²⁺,Ca²⁺,Fe³⁺,Zn⁺,Mn²⁺,Cu²⁺,Co² ⁺,Ni⁺)，测定金属离子对琼胶酶(AgaP1)酶活的影响。结果如表4所示，可知K⁺和Ca²⁺对酶活有明显的促进作用，Fe³⁺有一定促进作用，而其余金属离子则对酶活有不同程度的抑制作用。

表4不同金属离子对琼胶酶酶活的影响

实施例5：琼胶酶AgaP1酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得琼胶酶AgaP1纯酶与0.3％的琼脂糖在30℃下分别孵育1h、2h、6h，然后在薄层层析板(TLC)检测。具体为：TLC把预先在100℃烘箱中活化2h的HPTLC层析板裁剪成9cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂(正丁醇:冰乙酸:水＝2:1:1)的展缸中30min，吹干层析板，浸入显色剂(浓硫酸:无水乙醇＝1:9)中2s，取出吹干，高温烘烤，至样品出现。如图5所示，与标准品迁徙率比较发现，琼胶酶AgaP1酶解产物为新琼二糖(DP2)。

实施例6：琼胶酶AgaP1酶解产物薄层层析分析

将实施例2中纯化所得琼胶酶AgaP1纯酶与0.3％的琼脂糖在30℃下分别孵育1h、2h、6h，然后在薄层层析板(TLC)检测。具体为：TLC把预先在100℃烘箱中活化2h的TLC层析板裁剪成9cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂(正丁醇:冰乙酸:水＝2:1:1)的展缸中30min，吹干层析板，浸入显色剂(浓硫酸:无水乙醇＝1:9)中2s，取出吹干，高温烘烤，至样品出现。如图5所示，与标准品迁徙率比较发现，琼胶酶AgaP1酶解产物为新琼二糖(DP2)。

对比例1

按照本申请实施例1-2提供的方法表达纯化其他琼胶酶AG52(NCBI：KCCM42924)，得到基因工程菌pColdII-AG52和纯化后的重组琼脂酶蛋白。

按照本申请实施例5提供的方法将纯化后的重组琼脂酶蛋白用于生产新琼寡糖，结果表明，重组琼胶酶AG52的最适反应条件比琼胶酶AgaP1严苛，其最适反应温度为55℃，最适反应pH为5.5，更重要的是，重组琼胶酶AG52的降解产物为新琼四糖与新琼六糖，并非单一降解产物。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种降解产物均一的琼胶酶及其应用

<130> 233

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 667

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Leu Ser Val Ser Phe Pro Met Glu Trp Phe Lys Ser Ala Pro

1 5 10 15

His Thr Gln Leu Thr Ala Thr Ser Ser Glu Ala Phe Gln Leu Ile Thr

20 25 30

Thr Pro Glu Gly Gly Gly Phe Glu Leu Gln Pro Gly His Leu Glu Ser

35 40 45

Ala Ala Trp Cys Asp Tyr Gly Phe Val Asn Ala Glu Val Tyr His Glu

50 55 60

Ser His Asp Val Leu Val Leu Leu Phe Ser Phe Tyr Asp Arg Asp His

65 70 75 80

Arg Val Ile Thr Tyr His Val Gly Ile Leu Pro Gly Val Arg Thr Lys

85 90 95

Ile Cys Leu Pro Leu Ile His Leu Asn Gly Glu Lys Leu Phe Leu Pro

100 105 110

Arg Tyr Pro Gly Val Met Gln Thr Val Leu Arg Gly Asp Ala Gly Ile

115 120 125

Val Arg Lys His Ile Thr Arg Phe Ser Ile Ala Thr Leu Pro Ser Thr

130 135 140

Thr Ser Arg Ala Val Gln Ile Ser Gly Leu Ala Leu Ser Leu Thr Glu

145 150 155 160

Pro Ala Phe Glu Tyr Glu Gln Gln Pro Tyr Ile Asp Asp Leu Gly Gln

165 170 175

Leu Lys Gly Arg Asp Trp Pro Gly Lys Thr Val Asp Ala Glu Ala Leu

180 185 190

Thr Asp Arg Leu His Ala Glu Arg Gln Phe Val Ala Gln Val Asp His

195 200 205

Ser Gly Gly Asp Leu Ser Arg Tyr Gly Gly Trp Lys Ala Leu Ser Phe

210 215 220

Ala Ala Thr Gly Tyr Phe Arg Thr Glu Phe Asp Gly Ser Arg Trp Trp

225 230 235 240

Phe Val Asp Pro Glu Gly Tyr Ala Leu Phe Ser Thr Gly Met Asp Cys

245 250 255

Val Gly Pro Ala Cys Ser Met His Val Thr Gly Met Glu His Leu Ile

260 265 270

Pro Ser Leu Pro Glu Arg Glu Gly Ile Tyr Gln Glu Ala Trp Ser Gln

275 280 285

Asp Gly Glu Glu Phe Ser Phe Glu Ile Ala Asn Leu Ile Thr Ala Phe

290 295 300

Gly Ala Glu Trp Arg Ser Asn Trp Val Ala Met Thr Asp Phe Arg Leu

305 310 315 320

Gln Gln Trp Gly Tyr Asn Thr Ile Gly Asn Trp Ser Asn Asp Leu Phe

325 330 335

Ile Lys Glu Ser Gln Leu Pro Tyr Val Tyr Pro Leu Val Asp Phe Pro

340 345 350

Met Thr Glu Gln Ser Ile Phe Arg Asp Phe Pro Asp Val Phe Ser Pro

355 360 365

Glu Tyr Glu Arg Asn Ala Gly Ser Phe Ala Glu Gln Leu Leu Pro Leu

370 375 380

Arg Glu Asp Gln Arg Met Val Gly Tyr Phe Met Arg Asn Glu Pro His

385 390 395 400

Trp Ala Phe Val Asp Gly Leu Asn Leu Thr Gly Gln Met Leu Lys Ser

405 410 415

Pro Val Arg Tyr Ala Ser Lys Lys Glu Phe Ile Arg Trp Leu Ala Glu

420 425 430

Lys Tyr Lys Thr Val Glu Gln Leu Asn Lys Ala Trp Asp Ser Val Phe

435 440 445

Glu Glu Phe Glu Asp Leu Tyr Asp Val Ser Asn Val Asn Val Thr Gly

450 455 460

Asp Asn Leu Thr Ser Ala Arg Glu Val Asp Tyr Asn Gln Phe Asn Arg

465 470 475 480

Ile Met Ile Arg Arg Tyr Val Glu Val Pro Ala Arg Leu Cys Lys Gln

485 490 495

Thr Asp Pro Asn His Leu Asn Leu Gly Met Arg Tyr Ala Trp Val Gly

500 505 510

Ser Asp Glu Val Leu Glu Gly Cys Glu Trp Phe Asp Val Phe Ser Met

515 520 525

Asn Cys Tyr Gln Phe Ser Pro Asp Lys Glu Gln Ile Ala Gln Ile Ser

530 535 540

Gly Arg Leu Asn Lys Pro Val Met Ile Gly Glu Tyr His Phe Gly Ala

545 550 555 560

Ala Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Gly Ile Arg Ala Val Ala Thr Gln

565 570 575

Lys Glu Arg Gly Glu Ala Tyr Arg Tyr Tyr Val Glu Gln Gly Ala Ala

580 585 590

Ile Pro Gln Leu Ile Gly Val His Tyr Phe Gln Trp Asn Asp Gln Pro

595 600 605

Val Leu Gly Arg Tyr Asp Gly Glu Asn Tyr Gln Ile Gly Val Val Asp

610 615 620

Val Cys Asn Arg Pro Tyr Glu Pro Phe Val Gln Ala Ala Arg Lys Ala

625 630 635 640

His Asp Gln Met Tyr Arg Val Arg Thr Gly Met Thr Ala Pro Tyr Asn

645 650 655

Ile Val Pro Ile Glu Ile Pro Lys Thr Gly Phe

660 665

<210> 2

<211> 2004

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtttat ctgtctcctt ccctatggaa tggtttaaaa gtgcccccca tacacaactt 60

actgcgactt cctctgaggc gtttcagtta atcactacac cagaaggtgg tggatttgag 120

cttcagccag ggcatctgga atccgccgct tggtgcgatt atggtttcgt taatgcggag 180

gtttaccatg aaagccatga cgttctggtg ctgttattca gtttttatga tcgggatcat 240

cgcgtcatta cttatcatgt aggaatttta cctggtgtac gcacgaaaat ttgtttaccc 300

ttgattcatt taaatgggga gaagctgttc cttccccgtt atccgggtgt gatgcagaca 360

gtactgaggg gagatgcagg catcgttcgc aagcatatca cccgattctc tatcgctact 420

ctcccttcaa caacaagtag agctgtgcaa attagtggct tggctctaag tctaactgag 480

cccgcctttg agtatgaaca gcaaccatat atagatgatc tgggccaatt aaagggaagg 540

gattggccag gaaaaacggt tgatgcagaa gcgttgaccg atcggctgca cgcagagcgg 600

caatttgtgg cacaagttga tcacagtgga ggtgacctca gcaggtacgg aggttggaaa 660

gcgctgagtt tcgcggcaac tggatatttc cgcacggagt ttgacggcag ccgctggtgg 720

ttcgttgatc cagagggtta tgccctgttt agtacgggga tggactgtgt gggtccagcc 780

tgttctatgc atgtaacggg tatggaacac ttgataccct cgttgccgga gcgggaagga 840

atctatcaag aagcttggtc acaggatggc gaggaattca gcttcgagat tgctaatctg 900

atcactgctt ttggggcgga gtggcgctct aactgggtgg ctatgacgga ttttcgctta 960

caacaatggg gatacaacac catcggtaac tggtccaatg atcttttcat taaggaatct 1020

cagcttccgt atgtttatcc tctagtggac tttcctatga cggagcaatc tattttccgg 1080

gatttcccgg atgtgtttag cccggagtat gagcggaatg ccgggagctt tgcggagcag 1140

cttcttccat taagggagga ccagagaatg gttggctatt tcatgcgtaa tgagccacat 1200

tgggcattcg tggatggctt gaatttgacc gggcagatgc tgaaatctcc ggtccgttat 1260

gccagcaaga aggaattcat tcgctggctt gcagaaaagt acaaaacagt ggagcaatta 1320

aacaaggcgt gggatagcgt ttttgaagag ttcgaggatt tatacgatgt atcgaatgtg 1380

aatgtaaccg gggataatct cacttctgcc cgagaagtgg attataacca gttcaaccgg 1440

atcatgatcc ggcggtatgt agaagtgcca gcccgtcttt gcaagcagac ggatccgaat 1500

catctgaatt tgggaatgcg ttatgcctgg gttggcagtg atgaggtgct ggagggctgc 1560

gaatggtttg atgtattctc tatgaactgc tatcagttca gtcctgacaa ggaacagatc 1620

gcccagatca gcggacgact gaacaaacca gtcatgattg gggaatatca ttttggtgcg 1680

gctgaaggcg gcatgttggc ttatgggatc cgtgcggtgg caactcagaa ggagcgcggt 1740

gaagcttacc gttattatgt ggagcagggg gcagccatcc cgcagctgat cggagttcat 1800

tattttcagt ggaatgatca gcccgtgctt ggacgttatg acggagaaaa ctatcaaatc 1860

ggtgtagtgg atgtctgcaa ccgtccatat gaacctttcg tacaagcagc gagaaaggcc 1920

catgaccaga tgtatcgggt gcggacgggt atgacagcgc cctataatat tgtgccaata 1980

gagattccga aaacgggatt ctga 2004

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggggtacca tgagtttatc tgtctccttc cc 32

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgctctagat cagaatcccg ttttcggaat c 31

Claims

1.一种降解产物均一的琼胶酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述琼胶酶的基因。

3.含权利要求2所述基因的质粒或载体。

4.表达权利要求1所述琼胶酶的细胞。

5.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述细胞的宿主包括大肠杆菌。

6.一种产新琼二糖的方法，其特征在于，是以琼脂糖底物，添加含权利要求1所述琼脂酶的粗酶液或表达权利要求1所述琼脂酶的细胞，进行降解反应。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，每克琼脂糖添加100 U-500 U粗酶液。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述降解反应的条件为：pH 4.0-9.0，20-60℃，琼脂糖溶液终浓度为0.1-0.5%（m/V），降解0.5-6h。

9.如权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，反应过程中添加K⁺, Ca²⁺, Fe³⁺中的一种或多种。

10.权利要求1所述琼脂酶在制药、化工或化妆品领域中的应用。