CN109022404A

CN109022404A - 一种新型冷适应性褐藻胶裂解酶AlgA7及其应用

Info

Publication number: CN109022404A
Application number: CN201811116604.7A
Authority: CN
Inventors: 王存良; 李尚勇
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2018-12-18

Abstract

本发明涉及一种新型具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶及其应用。所述褐藻胶裂解酶为一种人工设计的新型褐藻胶裂解酶AlgA7，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，N端含有一段碳水化合物结合域（Met¹‑Pro¹⁷⁶），C端含有一段褐藻胶裂解酶保守催化区（Ser¹⁷⁷‑Asp⁵²⁶），其氨基酸序列与现有已知功能的褐藻胶裂解酶序列相似度仅为71%。本发明所述的褐藻胶裂解酶AlgA7具有冷适应特性，最适反应温度为25℃，在20℃和10℃下反应活性可达到最适温度下的81.9%和42.6%。本发明所述的褐藻胶裂解酶可将酶促反应控制在低温下进行，节省了工业化应用过程中的能量消耗，从而节省成本。

Description

一种新型冷适应性褐藻胶裂解酶AlgA7及其应用

技术领域

本发明涉及一种具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶AlgA7及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

褐藻胶是褐藻细胞壁的重要成分，由互为差向异构体的α-L-甘露糖醛酸（Mannuronic acid，M）和β-D-古罗糖醛酸（Guluronic acid，G）通过1,4糖苷键连接而成的线性多糖。通常，褐藻胶由海带、马尾藻、巨藻等大型褐藻加工制成。我国是海藻养殖大国，褐藻胶产量占到世界总产量的70%以上。褐藻胶广泛应用在化工、医药、食品等行业。不同聚合度的褐藻胶寡糖具有不同的生物学活性。最新研究表明，利用褐藻胶制备的聚M段寡糖药物GV-971能多靶点的抑制β淀粉样细胞的聚集和细胞毒性，已完成三期临床实验；聚G寡糖能够与抗生素联合使用抑制多种临床多耐药致病菌。对比传统的酸碱法降解褐藻胶，酶法降解褐藻胶具有条件温和、易控制、绿色环保等优势。

褐藻胶裂解酶通过β-消除反应催化褐藻胶分子内1,4糖苷键的断裂，产生非还原性末端具有共轭双键的不饱和寡糖。传统的褐藻胶裂解酶是从海洋动物消化道或海洋细菌的发酵液上清中直接分离提取，受限于天然褐藻胶裂解酶产量低，发展基因工程的褐藻胶裂解酶势在必行。目前在多糖降解酶数据中，已有几百个预测的褐藻胶裂解酶基因，其中部分基因在大肠杆菌或酵母菌中进行了重组表达，并研究了其酶学性质。但是大多数报道的褐藻胶裂解酶在低温下活性很低，必须加热到一定程度（40-50℃）才能发挥作用，极大增加了工业化应用过程中的能量消耗，因此，寻找具有在低温下可以发挥作用的具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶并研究其降解条件及最终产物具有重要意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种具有热恢复特性的褐藻胶裂解酶及其应用。该酶与已有褐藻胶裂解酶的氨基酸相似度仅为71%。其C端为催化区（Ser¹⁷⁷-Asp⁵²⁶），N端含有一段碳水化合物结合域（Met¹-Pro¹⁷⁶），该区域可形成一个稳定的结构域，从而对酶的稳定性和冷适应性产生影响。该酶的最适反应温度为25℃，在20℃和10℃下反应活性可达到最适温度下的81.9%和42.6%。该酶降解方式为内切，降解主产物为褐藻胶不饱和二糖和三糖。

一方面，本发明提供一种具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶AlgA7，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

SEQ ID NO.1：

MTPPTLTSPPPHPRRHRGRIALSAALAAALGATVLSAASSASAADAPISQGKPATASSVESAAFPASAAVDGDAGTRWSSTFADPQWLQVDLGSTQSISQVVLNWEAAYASAFTIQTSANGSTWTTISPVTAGKAGVQTLTVTGSGRYVRMSGTTRATPYGYSLWEFQVFGTGTTPSNTSISAELKPADKFNLSEWKITLPTDNDGNGKVDEVSVKNIQKLSHPDFFYLDDEGNMVFAAPNKALTTQNSSNTRSELRHMLRGSNTRIKTHSPKNNFTVASNPISDRFAQVGGKLNATLKVQHVATRAKYPDKAPAFSVVVGQIHASKWKKKVKGFGWGNEPLKIYYKKWPQHETGSVFWTYERNLPKNDKNRTDIAYPVWGNLWTDPENPGSEGIKLNESFSYEVNVHGDVMYLSFKSDGHKTVNYAINLANGVNAYGELDQHDHPYGYTLDWNYFKAGAYNQCSTKDDDGFWYAACMGTGNWEEDKKNGDYVQVAFSHLTVGESSEPTETFKANLVTQRPVAKSD

另一方面，本发明还提供一种具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶AlgA7对应的核酸序列，如SEQ ID NO.2所示。

SEQ ID NO.2：

ATGACCCCGCCGACCCTGACCTCCCCGCCGCCGCACCCGCGCCGCCACCGCGGCCGCATCGCCCTGTCCGCCGCCCTGGCCGCCGCCCTGGGCGCCACCGTGCTGTCCGCCGCCTCCTCCGCCTCCGCCGCCGACGCCCCGATCTCCCAGGGCAAGCCGGCCACCGCCTCCTCCGTGGAGTCCGCCGCCTTCCCGGCCTCCGCCGCCGTGGACGGCGACGCCGGCACCCGCTGGTCCTCCACCTTCGCCGACCCGCAGTGGCTGCAGGTGGACCTGGGCTCCACCCAGTCCATCTCCCAGGTGGTGCTGAACTGGGAGGCCGCCTACGCCTCCGCCTTCACCATCCAGACCTCCGCCAACGGCTCCACCTGGACCACCATCTCCCCGGTGACCGCCGGCAAGGCCGGCGTGCAGACCCTGACCGTGACCGGCTCCGGCCGCTACGTGCGCATGTCCGGCACCACCCGCGCCACCCCGTACGGCTACTCCCTGTGGGAGTTCCAGGTGTTCGGCACCGGCACCACCCCGTCCAACACCTCCATCTCCGCCGAGCTGAAGCCGGCCGACAAGTTCAACCTGTCCGAGTGGAAGATCACCCTGCCGACCGACAACGACGGCAACGGCAAGGTGGACGAGGTGTCCGTGAAGAACATCCAGAAGCTGTCCCACCCGGACTTCTTCTACCTGGACGACGAGGGCAACATGGTGTTCGCCGCCCCGAACAAGGCCCTGACCACCCAGAACTCCTCCAACACCCGCTCCGAGCTGCGCCACATGCTGCGCGGCTCCAACACCCGCATCAAGACCCACTCCCCGAAGAACAACTTCACCGTGGCCTCCAACCCGATCTCCGACCGCTTCGCCCAGGTGGGCGGCAAGCTGAACGCCACCCTGAAGGTGCAGCACGTGGCCACCCGCGCCAAGTACCCGGACAAGGCCCCGGCCTTCTCCGTGGTGGTGGGCCAGATCCACGCCTCCAAGTGGAAGAAGAAGGTGAAGGGCTTCGGCTGGGGCAACGAGCCGCTGAAGATCTACTACAAGAAGTGGCCGCAGCACGAGACCGGCTCCGTGTTCTGGACCTACGAGCGCAACCTGCCGAAGAACGACAAGAACCGCACCGACATCGCCTACCCGGTGTGGGGCAACCTGTGGACCGACCCGGAGAACCCGGGCTCCGAGGGCATCAAGCTGAACGAGTCCTTCTCCTACGAGGTGAACGTGCACGGCGACGTGATGTACCTGTCCTTCAAGTCCGACGGCCACAAGACCGTGAACTACGCCATCAACCTGGCCAACGGCGTGAACGCCTACGGCGAGCTGGACCAGCACGACCACCCGTACGGCTACACCCTGGACTGGAACTACTTCAAGGCCGGCGCCTACAACCAGTGCTCCACCAAGGACGACGACGGCTTCTGGTACGCCGCCTGCATGGGCACCGGCAACTGGGAGGAGGACAAGAAGAACGGCGACTACGTGCAGGTGGCCTTCTCCCACCTGACCGTGGGCGAGTCCTCCGAGCCGACCGAGACCTTCAAGGCCAACCTGGTGACCCAGCGCCCGGTGGCCAAGTCCGAC

另一方面，本发明还提供一种具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶AlgA7的制备方法：

（1）褐藻胶裂解酶AlgA7的基因克隆与重组表达；

（2）重组质粒；

（3）重组质粒转化至大肠杆菌；

（4）重组大肠菌株的发酵；

（5）褐藻胶裂解酶的纯化。

优选：所述产酶条件中发酵罐培养基为Terrific Broth (TB)。初始孵育温度为37℃。初始孵育pH为7.6。初始通气量为50 L/h。初始转速为350 rpm。

另一方面，本发明还提供了所述褐藻胶裂解酶AlgA7在裂解褐藻胶中的应用。

另一方面，本发明还提供了所述褐藻胶裂解酶AlgA7在制备褐藻寡糖中的应用。

另一方面，一种裂解褐藻胶的方法，所选用的褐藻胶裂解酶为AlgA7。

优选：所述裂解条件中反应温度为0~50℃。最适反应温度为25℃。

有益效果：

1.本发明的褐藻胶裂解酶AlgA7为人工设计的合成序列，其C端为催化区，N端为碳水化合物结合结构域，其氨基酸序列与已有的褐藻胶裂解酶序列相似度仅为71%，为一个新颖的褐藻胶裂解酶。

2.本发明的褐藻胶裂解酶AlgA7经5 L发酵后，每毫升发酵液酶活力高达364 U。并且，该酶具有冷适应的特性。这种新颖的性质能够使得酶促反应在低温下进行，从而降低了工业化应用过程中的能量消耗。

3.本发明涉及的褐藻胶裂解酶AlgA7基因序列为人工设计，全合成序列。本发明还提供了一种制备该新型褐藻胶裂解酶的方法，即利用基因工程的技术方法，将AlgA7基因异源重组到大肠杆菌，并利用镍柱对其进行分离纯化，研究了其酶学性质，发现其具有冷适应的特性。最适反应温度为25℃，在20℃和10℃下反应活性可达到最适温度下的81.9%和42.6%。利用该重组酶进行了降解产物分析，该酶降解主产物为不饱和褐藻胶二糖和三糖。本发明所述的褐藻胶裂解酶AlgA7具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1为本发明褐藻胶裂解酶AlgA7蛋白质分离纯化图（M，蛋白质标准品；1，纯化所得褐藻胶裂解酶AlgA7）；

图2为本发明褐藻胶裂解酶AlgA7的冷适应性特性；

图3为本发明褐藻胶裂解酶AlgA7的温度稳定性；

图4为粘度法检测本发明褐藻胶裂解酶AlgA7的降解方式；

图5为薄层层析（TLC）法检测本发明褐藻胶裂解酶AlgA7的酶解产物（M，褐藻寡糖2糖DP2、3糖DP3标准品；0，酶解前底物；1，酶解产物）。

具体实施方式

实施例1褐藻胶裂解酶AlgA7的人工设计及序列分析

本发明所述褐藻胶裂解酶基因algA7为人工设计，全合成序列（华大基因公司合成），包含有1,578个碱基序列，编码526个氨基酸序列，其N端含有一段碳水化合物结合域（Met¹-Pro¹⁷⁶）。其C端含有一段褐藻胶裂解酶保守催化区（Ser¹⁷⁷-Asp⁵²⁶），该结合结构域可形成一段稳定的三级结构，从而对酶的热稳定性和热恢复性产生影响。利用National Center forBiotechnology Information （NCBI）中的保守结构域分析Conserved Domain（CDD）和多重序列比对该序列C端包含有一个褐藻胶裂解酶第2超家族（Alginate lyase 2superfamily）的保守区，N端包含有一个碳水化合物结合结构域。多重序列比对Basic Local Alignment Search Tool (Blast)发现，与AlgA7氨基酸序列相似度最高的为多糖裂解酶第7家族（PL-7）的褐藻胶裂解酶与AlgA7的氨基酸序列相似度最高仅为71%。

实施例2褐藻胶裂解酶AlgA7的基因克隆与重组表达

将实施例1中全合成的algA7基因序列以限制性内切酶Nco I和Xho I（购自大连宝生物公司）为酶切位点并设计酶切位点保护碱基，设计重组引物如下（下划线为限制性内切酶位点，斜体为限制性内切酶保护碱基）：

正向引物：SEQ ID NO.3：PAlgA7EF：

5’- CATG CCATGGGTATGACCCCGCCGACCCTGA-3’ (Nco I)

反向引物：SEQ ID NO.4：PAlgA7ER：

5’- CCG CTCGAGGTCGGACTTGGCCACCGGG -3’ (Xho I)

具体PCR扩增条件为：94℃预变性3分钟；94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共 30个循环；72℃延伸5分钟；4℃稳定15分钟。PCR所用高保真DNA聚合酶PrimerstarHS购自大连宝生物公司。

将PCR产物用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收酶切后的PCR产物。将购买自美国Invitrogen公司的pET22b (+)质粒DNA (100 ng)，同样用限制性内切酶Nco I和Xho I进行双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切后的产物片段。酶切所用酶和底物反应体系（温度、时间、DNA用量等）均参照大连宝生物提供的产品说明操作。

将经过双酶切处理的PCR产物和pET-22b(+)质粒载体，参照DNA连接酶说明书（购自大连宝生物公司）进行连接；连接产物转化至大肠杆菌DH5α菌株（购自大连宝生物公司），涂布在含有50 μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani (LB)培养基固体平板上，37℃培养16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至含有50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中（50 mL尖底离心管装载5mL液体培养基），在37℃摇床中 180 rpm震荡培养过夜。利用质粒提取试剂盒（购自大连宝生物公司）按照产品说明书提取菌液中的质粒，通过Nco I和Xho I双酶切鉴定阳性克隆并进行序列测定；选择与目的基因序列一致的单克隆所提取的质粒，将其命名为pET22b-AlgA7。参照产品说明书，将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)（购自大连宝生物公司），将重组大肠菌株命名为BL21(DE3)/pET22b-AlgA7，保存在-80℃备用。

实施例3褐藻胶裂解酶AlgA7的发酵工艺及纯化制备方法

将实施例2中构建并保存在-80℃的大肠杆菌BL21(DE3)/pET22b-AlgA7在LB固体平板上划线，37℃培养16小时后，挑取单克隆；将单克隆转接至含有50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中（500 mL锥形瓶装载50 mL液体培养基），在37℃ 摇床中180 rpm震荡培养至OD₆₀₀=0.6。5 L发酵罐装载3 L的Terrific Broth （TB）培养基，并提前灭菌处理；发酵罐中添加50 μg/mL氨苄青霉素，将锥形瓶中培养好的菌液按照2%的接种量接种至5 L发酵罐中。调整初始通气量为50 L/h，初始转速为350 rpm，温度控制在37℃，溶氧控制在15-40%；当菌体生长到OD₆₀₀=5.0时，加入终浓度为0.1 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在25℃诱导60 h。褐藻胶裂解酶活性测定方法为：100 μl酶液加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（20 mM 磷酸盐缓冲液，pH=7.6），在25℃下反应10 min，用分光光度计测定A235数值。酶活力定义为1 ml酶液引起A235数值增加0.1为一个酶活力单位。每毫升发酵液酶活力高达364U。

发酵停止后，12000 rpm离心10 min，弃菌体，收集上清液；3 L发酵上清液分10批次（每次300 mL）上样于5 mL镍离子亲和层析柱，利用50 mM咪唑洗脱，去除杂蛋白，再利用150 mM的咪唑洗脱，收集洗脱组分。将150 mM的咪唑洗脱后所得组分，透析去除咪唑，分装储存在-20℃备用。通过镍离子仿生亲和纯化，蛋白回收率达到41.7%，聚丙烯酰胺电泳（SDS-PAGE）分析，蛋白纯度达到95%以上。

实施例4褐藻胶裂解酶AlgA7的冷适应性测定

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶100 μl加入900 μl 0.3%褐藻胶底物（20 mM 磷酸盐缓冲液，pH=7.6），在不同温度（0-50℃）下反应10 min，用分光光度计测定A235数值，以最高酶活力为100%，计算不同温度下AlgA7的相对酶活力。如图2所示，本发明所述的褐藻胶裂解酶AlgA5具有冷适应（Cold-adapted）的特性。褐藻胶裂解酶AlgA7的最适反应温度为25℃。褐藻胶裂解酶AlgA7在20℃、10 ℃和0 ℃下反应活性可占到最适反应温度下活性的81.9%，42.6%和37.5%。

实施例5褐藻胶裂解酶AlgA7的温度稳定性测定

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶1 ml在不同温度（0-80 ℃）下孵育1 h，取出后，立即在其最适反应温度（25℃）下检测其酶活力，以孵育前的活力作为100%，如图3所示，褐藻胶裂解酶AlgA7具有良好的温度稳定性，在40 ℃下孵育1 h，依然可以保持80%以上的酶活力。

实施例6褐藻胶裂解酶AlgA7降解方式的粘度法测定

使用乌氏粘度计进行降解方式的确定，0.1 ml酶液（30 U）加入9.9 ml 0.3%褐藻胶底物，30℃反应不同时间（1、5、10、15、30、60 min），煮沸10 min终止反应。在室温条件下，利用乌氏粘度计计算不同酶解时间的产物粘度。同时，利用A235法测定不同酶解时间的产物的吸光度变化，测定对应的酶活力。通过测定结果（图4）可知，酶解反应初期（1-5分钟），产物粘度急剧下降，而此时A235法检测的酶解产物形成的不饱和双键没有急剧增加，说明AlgA7的酶解方式为内切。

实施例7 褐藻胶裂解酶AlgA7酶解产物薄层层析分析

将实施例3中纯化所得褐藻胶裂解酶AlgA7纯酶（10-20 U）与0.1%褐藻胶在30℃下孵育6 h，然后在高效薄层层析板（HPTLC）检测。具体为：TLC把预先在100℃烘箱中活化2 h的HPTLC层析板裁剪成7 cm宽合适大小的样本，将孵育前后样品点样在原点处，置于有展开剂（正丁醇:甲酸:水=4:5:1）的展缸中20 min，吹干层析板，浸入显色剂（苯胺二苯胺）中2s，取出吹干，高温烘烤，至样品出现。如图5所示，与标准品迁徙率比较发现，褐藻胶裂解酶AlgA7酶解主产物为褐藻胶二糖（DP2）和三糖（DP3）。

序列表

<110> 王存良

<120> 一种新型冷适应性褐藻胶裂解酶AlgA7及其应用

<141> 2018-09-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Pro Pro Thr Leu Thr Ser Pro Pro Pro His Pro Arg Arg His

1 5 10 15

Arg Gly Arg Ile Ala Leu Ser Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Gly Ala

20 25 30

Thr Val Leu Ser Ala Ala Ser Ser Ala Ser Ala Ala Asp Ala Pro Ile

35 40 45

Ser Gln Gly Lys Pro Ala Thr Ala Ser Ser Val Glu Ser Ala Ala Phe

50 55 60

Pro Ala Ser Ala Ala Val Asp Gly Asp Ala Gly Thr Arg Trp Ser Ser

65 70 75 80

Thr Phe Ala Asp Pro Gln Trp Leu Gln Val Asp Leu Gly Ser Thr Gln

85 90 95

Ser Ile Ser Gln Val Val Leu Asn Trp Glu Ala Ala Tyr Ala Ser Ala

100 105 110

Phe Thr Ile Gln Thr Ser Ala Asn Gly Ser Thr Trp Thr Thr Ile Ser

115 120 125

Pro Val Thr Ala Gly Lys Ala Gly Val Gln Thr Leu Thr Val Thr Gly

130 135 140

Ser Gly Arg Tyr Val Arg Met Ser Gly Thr Thr Arg Ala Thr Pro Tyr

145 150 155 160

Gly Tyr Ser Leu Trp Glu Phe Gln Val Phe Gly Thr Gly Thr Thr Pro

165 170 175

Ser Asn Thr Ser Ile Ser Ala Glu Leu Lys Pro Ala Asp Lys Phe Asn

180 185 190

Leu Ser Glu Trp Lys Ile Thr Leu Pro Thr Asp Asn Asp Gly Asn Gly

195 200 205

Lys Val Asp Glu Val Ser Val Lys Asn Ile Gln Lys Leu Ser His Pro

210 215 220

Asp Phe Phe Tyr Leu Asp Asp Glu Gly Asn Met Val Phe Ala Ala Pro

225 230 235 240

Asn Lys Ala Leu Thr Thr Gln Asn Ser Ser Asn Thr Arg Ser Glu Leu

245 250 255

Arg His Met Leu Arg Gly Ser Asn Thr Arg Ile Lys Thr His Ser Pro

260 265 270

Lys Asn Asn Phe Thr Val Ala Ser Asn Pro Ile Ser Asp Arg Phe Ala

275 280 285

Gln Val Gly Gly Lys Leu Asn Ala Thr Leu Lys Val Gln His Val Ala

290 295 300

Thr Arg Ala Lys Tyr Pro Asp Lys Ala Pro Ala Phe Ser Val Val Val

305 310 315 320

Gly Gln Ile His Ala Ser Lys Trp Lys Lys Lys Val Lys Gly Phe Gly

325 330 335

Trp Gly Asn Glu Pro Leu Lys Ile Tyr Tyr Lys Lys Trp Pro Gln His

340 345 350

Glu Thr Gly Ser Val Phe Trp Thr Tyr Glu Arg Asn Leu Pro Lys Asn

355 360 365

Asp Lys Asn Arg Thr Asp Ile Ala Tyr Pro Val Trp Gly Asn Leu Trp

370 375 380

Thr Asp Pro Glu Asn Pro Gly Ser Glu Gly Ile Lys Leu Asn Glu Ser

385 390 395 400

Phe Ser Tyr Glu Val Asn Val His Gly Asp Val Met Tyr Leu Ser Phe

405 410 415

Lys Ser Asp Gly His Lys Thr Val Asn Tyr Ala Ile Asn Leu Ala Asn

420 425 430

Gly Val Asn Ala Tyr Gly Glu Leu Asp Gln His Asp His Pro Tyr Gly

435 440 445

Tyr Thr Leu Asp Trp Asn Tyr Phe Lys Ala Gly Ala Tyr Asn Gln Cys

450 455 460

Ser Thr Lys Asp Asp Asp Gly Phe Trp Tyr Ala Ala Cys Met Gly Thr

465 470 475 480

Gly Asn Trp Glu Glu Asp Lys Lys Asn Gly Asp Tyr Val Gln Val Ala

485 490 495

Phe Ser His Leu Thr Val Gly Glu Ser Ser Glu Pro Thr Glu Thr Phe

500 505 510

Lys Ala Asn Leu Val Thr Gln Arg Pro Val Ala Lys Ser Asp

515 520 525

<210> 2

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaccccgc cgaccctgac ctccccgccg ccgcacccgc gccgccaccg cggccgcatc 60

gccctgtccg ccgccctggc cgccgccctg ggcgccaccg tgctgtccgc cgcctcctcc 120

gcctccgccg ccgacgcccc gatctcccag ggcaagccgg ccaccgcctc ctccgtggag 180

tccgccgcct tcccggcctc cgccgccgtg gacggcgacg ccggcacccg ctggtcctcc 240

accttcgccg acccgcagtg gctgcaggtg gacctgggct ccacccagtc catctcccag 300

gtggtgctga actgggaggc cgcctacgcc tccgccttca ccatccagac ctccgccaac 360

ggctccacct ggaccaccat ctccccggtg accgccggca aggccggcgt gcagaccctg 420

accgtgaccg gctccggccg ctacgtgcgc atgtccggca ccacccgcgc caccccgtac 480

ggctactccc tgtgggagtt ccaggtgttc ggcaccggca ccaccccgtc caacacctcc 540

atctccgccg agctgaagcc ggccgacaag ttcaacctgt ccgagtggaa gatcaccctg 600

ccgaccgaca acgacggcaa cggcaaggtg gacgaggtgt ccgtgaagaa catccagaag 660

ctgtcccacc cggacttctt ctacctggac gacgagggca acatggtgtt cgccgccccg 720

aacaaggccc tgaccaccca gaactcctcc aacacccgct ccgagctgcg ccacatgctg 780

cgcggctcca acacccgcat caagacccac tccccgaaga acaacttcac cgtggcctcc 840

aacccgatct ccgaccgctt cgcccaggtg ggcggcaagc tgaacgccac cctgaaggtg 900

cagcacgtgg ccacccgcgc caagtacccg gacaaggccc cggccttctc cgtggtggtg 960

ggccagatcc acgcctccaa gtggaagaag aaggtgaagg gcttcggctg gggcaacgag 1020

ccgctgaaga tctactacaa gaagtggccg cagcacgaga ccggctccgt gttctggacc 1080

tacgagcgca acctgccgaa gaacgacaag aaccgcaccg acatcgccta cccggtgtgg 1140

ggcaacctgt ggaccgaccc ggagaacccg ggctccgagg gcatcaagct gaacgagtcc 1200

ttctcctacg aggtgaacgt gcacggcgac gtgatgtacc tgtccttcaa gtccgacggc 1260

cacaagaccg tgaactacgc catcaacctg gccaacggcg tgaacgccta cggcgagctg 1320

gaccagcacg accacccgta cggctacacc ctggactgga actacttcaa ggccggcgcc 1380

tacaaccagt gctccaccaa ggacgacgac ggcttctggt acgccgcctg catgggcacc 1440

ggcaactggg aggaggacaa gaagaacggc gactacgtgc aggtggcctt ctcccacctg 1500

accgtgggcg agtcctccga gccgaccgag accttcaagg ccaacctggt gacccagcgc 1560

ccggtggcca agtccgac 1578

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catgccatgg gtatgacccc gccgaccctg a 31

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgagg tcggacttgg ccaccggg 28

Claims

1.一种具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶所对应的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征是：

（1）褐藻胶裂解酶的基因克隆与重组表达；

（2）重组质粒；

（3）重组质粒转化至大肠杆菌；

（4）重组大肠菌株的发酵；

（5）褐藻胶裂解酶的纯化。

4.如权利要求3所述的褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征是：步骤（4）中发酵罐培养基为Terrific Broth，初始孵育温度为37℃，初始孵育pH为7.6，初始通气量为50 L/h，初始转速为350 rpm。

5.如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶在裂解大分子褐藻胶中的应用。

6.如权利要求1所述的褐藻胶裂解酶在制备褐藻寡糖中的应用。

7.一种裂解褐藻胶的方法，其特征是，所选用的褐藻胶裂解酶为权利要求1所述的具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶。

8.如权利要求6所述的方法，其特征是，裂解条件中反应温度为0~50℃，优选，反应温度为25℃。