CN104762281B - 一种α‑鼠李糖苷酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种α‑鼠李糖苷酶及其制备方法和应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；该重组酶最适反应温度高、热稳定性好，在优选条件下可高效表达目的蛋白，因此可在选择性水解芦丁、橘皮苷、柚皮苷、樱桃苷、柴胡皂苷及其它连接α‑鼠李糖苷的黄酮类化合物或萜类香气前体化合物中的鼠李糖等领域中具有广泛的应用。

Description

一种α-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种极耐热α-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用。

背景技术

α-鼠李糖苷酶(α-L-Rhamnosidase)是一种可以水解多种天然化合物糖基末端并释放鼠李糖的糖苷水解酶，包括橙皮苷、芦丁、槲皮苷、柚皮苷及一些萜烯类糖苷等天然化合物。由于α-鼠李糖苷酶广泛地催化多种底物，使得其在众多领域被广泛应用，例如转化柚皮苷、橙皮苷等使其苦味降低，从而改善果汁的口味；转化芦丁生成生物利用度更高、在抑制恶性肿瘤增殖活性、抑制HIV-1和HSV-1/2等方面生物活性更强的异槲皮素；转化人参皂苷Re、Rg2等生成稀有且活性更强的人参皂苷Rg1、Rh1等。这些使得α-鼠李糖苷酶在食品、医药领域具有广泛应用的潜力。

α-鼠李糖苷酶早在1938年即被分离鉴定，经过多年的研究目前已有3000多种不同来源的α-鼠李糖苷酶被分离鉴定、克隆表达，但是至目前为止还没有用于商业化的纯的α-鼠李糖苷酶。仅有两种分别来源于黑曲霉和青霉菌来源的菌株被用于商业化制备富含α-鼠李糖苷酶的酶制剂。我们分析了已有的研究，发现其中存在的问题与局限性，并进行了总结：(1)真菌产α-鼠李糖苷酶大多是发酵后的粗酶液，其中不仅含有α-鼠李糖苷酶还有大量的β－葡萄糖苷酶等其它糖苷水解酶，在使用过程中无法避免的产生副产物而降低目的产物得率。(2)目前报道的大部分α-鼠李糖苷酶活力较低，无法适用于规模化的生产，同时真菌发酵产酶过程中影响因素较多不利于生产调控。(3)目前绝大部分不同来源的α-鼠李糖苷酶普遍为中温酶，反应温度不高，当需要提高催化体系温度转化一些溶解度不高的原料时，大部分酶无法在高温条件下保持较高的热稳定性，影响生产效率。

综合考虑上述问题，申请人认为发掘耐热α-鼠李糖苷酶基因，并通过基因工程手段得到基因重组菌，优化表达条件从而较高地表达高温型α-鼠李糖苷酶可能是有效的解决途径。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对上述局限性，提供一种改良的α-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用，并通过基因工程技术获得催化性能稳定，成分单一的新型重组α-鼠李糖苷酶TPERha，该重组酶TPERha最适反应温度高、具有较高的热稳定性，在优选条件下可高效表达目的蛋白，因此可在选择性水解芦丁、橘皮苷、柚皮苷、樱桃苷、柴胡皂苷及其它连接α-鼠李糖苷的黄酮类化合物或萜类香气前体化合物中的鼠李糖等领域中具有广泛的应用。

技术方案：一种α-鼠李糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码上述α-鼠李糖苷酶的核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述α-鼠李糖苷酶的制备方法，将SEQ ID NO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌后诱导表达，并通过后续目的蛋白的纯化而得。

所述制备方法的具体步骤如下：

1）、以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995基因组DNA为模板，用具有SEQID NO.3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到SEQ ID NO.2所示的DNA片段；

2）、将得到的DNA片段和pET-28b分别用Nhe I和NotI进行双酶切，连接得到含有所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒；

3）、将步骤2）得到的重组质粒转化表达宿主菌JM109(DE3)，加入适量浓度的诱导剂IPTG于30℃下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni²⁺亲和层析柱纯化即得。

包含上述α-鼠李糖苷酶的DNA片段的重组质粒。

上述α-鼠李糖苷酶在选择性水解芦丁、橘皮苷、柚皮苷、樱桃苷、柴胡皂苷及其它连接α-鼠李糖苷的黄酮类化合物或萜类香气前体化合物中鼠李糖中的应用。

有益效果：(1)本发明所述的α-鼠李糖苷酶TPERha最适反应温度高，热稳定性优异；(2)本发明所述α-鼠李糖苷酶TPERha的优选制备方法可达到目的蛋白的较高表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例2纯化的α-鼠李糖苷酶的纯度鉴定结果图；其中泳道M为蛋白Marker(购自Thermo scientific公司，货号2661)，泳道1为纯酶蛋白；泳道2为PET-20b转化宿主菌空白对照的全细胞裂解液；泳道3为诱导表达后全细胞裂解液。

图2为实施例3本发明所述α-鼠李糖苷酶的定性测定结果（图a, b, c, d）及黑曲霉来源的α-鼠李糖苷酶最适温度及温度稳定性的测定结果图(图e, f)，其中a为本发明所述α-鼠李糖苷酶的最适反应pH的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位%；b为本发明所述α-鼠李糖苷酶的最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度（℃），纵坐标为相对酶活力，单位%； c为本发明所述α-鼠李糖苷酶的pH稳定性的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位%； d为本发明所述α-鼠李糖苷酶的温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位小时（min），纵坐标为相对酶活力，单位%。e为黑曲霉来源的α-鼠李糖苷酶最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度（℃），纵坐标为相对酶活力，单位%；f为黑曲霉来源的α-鼠李糖苷酶温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位小时（min），纵坐标为相对酶活力，单位%。

图3为实施例4本发明所述α-鼠李糖苷酶诱导表达结果图，其中纵坐标为相对酶活力，单位为%；横坐标为诱导条件的编号，其中1-5分别表示：1, 30℃不加IPTG; 2, 30℃加IPTG至终浓度0.01mM; 3，30℃加IPTG至终浓度0.05mM；4，30℃加IPTG至终浓度0.1mM；5，30℃加IPTG至终浓度0.5mM。

图4 为实施例5本发明所述α-鼠李糖苷酶的产酶曲线图，其中横坐标为诱导时间，单位（h）；纵坐标为α-鼠李糖苷酶活力，单位U/mL。

图5为实施例6本发明所述α-鼠李糖苷酶水解橘皮苷的HPLC图谱。图5-a是灭活的重组α-L-鼠李糖苷酶酶液处理的橘皮苷的HPLC图谱，图5-b是重组α-L-鼠李糖苷酶处理的橘皮苷的HPLC图谱。橘皮苷保留时间为4.830 min，而橘皮苷经黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶水解产物橘皮素单糖苷保留时间为5.457 min。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种新型α-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为TPERha。

本发明也提供了编码本发明所述α-鼠李糖苷酶的DNA分子片段。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了可以编码所述的α-鼠李糖苷酶TPERha的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

为了制备本发明所述酶蛋白，本发明还提供了本发明所述的α-鼠李糖苷酶的制备方法

在一些实施方案中，本发明所述的α-鼠李糖苷酶的制备方法，为获得本发明所述的α-鼠李糖苷酶的DNA分子片段，将该DNA分子插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化表达宿主菌，加入诱导量浓度的诱导剂IPTG后进行诱导表达，获得目的蛋白。

本发明同时还提供了一种包含本发明所述的α-鼠李糖苷酶的DNA分子的重组质粒，所述的重组质粒为pET-TPERha。

本发明所述转化表达宿主菌为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21、JM109系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为JM109(DE3)菌株。

本发明所述α-鼠李糖苷酶的制备方法所述诱导表达分离纯化具体为不加IPTG于37℃下诱导培养含重组质粒的表达宿主菌，收集菌体超声波破碎，取上清亲和层析得到融合蛋白。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南 第三版》。

实施例1：本发明所述α-鼠李糖苷酶基因的获得及重组质粒pET-TPERha的构建

1.1 Thermotoga petrophila DSM 13995的培养

Thermotoga petrophila DSM 13995购于DSMZ菌种保藏中心（www.dsmz.de）编号为13995，其培养基配方为：10 g/L淀粉、5 g/L胰蛋白胨、3 g/L酵母提取物、5 g/L肉浸液、10 g/L 2-马啉乙磺酸、10 mg/L 七水合硫酸铁、1 mg/L 刃天青, 调整pH为7.2。用注射器按照0.5wt.% 培养基的接种量接种，85℃静止培养24 h，收集细胞。

1.2 基因组DNA的提取

（1）静置培养Thermotoga petrophila DSM 13995 约24小时，取30 mL菌液4,000g离心10 min收集细胞。

（2）用9.5 mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5 mL 10 wt.％十二烷基硫酸钠（SDS）和50 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混合均匀，37℃保温1 h。

（3）加入1.8 mL 5 mol/L NaCl，1.5 mL 十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）/NaCl，混匀，65℃温育20 min。

（4）加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000 g离心10 min。

（5）为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000 g离心10 min。

（6）另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。

（7）用吸管将DNA缠绕其上，在70 wt.％酒精中清洗。

（8）用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5 mL离心管中。

（9）室温下风干，加500 μL TE 缓冲液溶解。

（10）取50 μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。

1.3 重组质粒pET-BGL的构建

按照已知的Thermotoga petrophila DSM 13995耐高糖α-鼠李糖苷酶基因（登录号：YP_001244492.1）设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：

P1: CG GCTAGC ATGATACAGGCCTGTGATCTTCGCTGT，下划线表示Nde I 位点（SEQ IDNO.3）。

P2: TATA GCGGCCGC TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACA，下划线表示Not I 位点，并去除终止密码子（SEQ ID NO.4）。

以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5 min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40 μL石蜡油密封；28次循环（ 94℃，30 s；58℃，30 s；72℃，2.9 min ）；72℃，10 min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对 PCR 扩增产物进行纯化。得到α-鼠李糖苷酶TPERha的DNA分子。

将得到的α-鼠李糖苷酶TPERha的DNA分子和pET-20b分别用Nde I和NotI进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有新型α-鼠李糖苷酶DNA分子的重组质粒pET-TPERha，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：本发明所述α-鼠李糖苷酶的制备

将重组质粒pET-TPERha转化大肠杆菌JM109(DE3) 宿主菌（购自Novagen公司），在含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板（LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl5 g/L，琼脂 15 g/L）上经过37℃培养过夜，挑转化子到200 mL的LB培养基中（50 μg/mL 卡那霉素）37℃，200 rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.5 mM 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导剂，30℃培养6 h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15 min，收集菌体。

由于重组质粒pET-TPERha中含有His-tag标签，通过His•Bind Purification Kit（购自Novagen公司）进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程：

A.样品的处理

（1）将洗涤过的菌体，用1×Binding Buffer 8mL重悬，超声波破壁。

（2）破壁后，13,000 g离心30 min，取上清即为样品。

B.处理柱子

（1）取1 mL填料装柱。

（2）用3mL的无菌水洗柱子。

（3）用5mL的1×Charge Buffer洗柱子。

（4）用3mL的1×Binding Buffer洗柱子。

C.上样

（1）将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。

（2）用3 mL 1×Binding Buffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。

（3）用4 mL含有20 mM咪唑的洗脱液洗柱子，除去杂蛋白。

（4）用80 mmol/L咪唑的洗脱液洗柱子，将目的蛋白洗脱下来。

（5）用4 mL 1×Strip Buffer洗柱子。

通过此过程得到纯化的α-鼠李糖苷酶，通过SDS-PAGE电泳后染色鉴定α-鼠李糖苷酶的纯度，结果如图1所示。

由图1结果可见，TPERha基因在宿主菌JM109(DE3)中表达量较高，目的蛋白通过HisTag标签纯化后，其洗脱液中α-鼠李糖苷酶TPERha纯度较高，在55kDa处有单一的条带，达到电泳纯级别。

实施例3：本发明所述α-鼠李糖苷酶的定性测定

1、酶活的测定方法

反应体系100 μL，5 μL 20 mmol/L 对硝基苯-α-L-鼠李糖苷（pNPR）中加入85 μL100 mmol/L 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（pH 6.0），先在90℃孵育3 min，再加入10 μL酶液（稀释到合适的倍数）反应10 min，显色后再加入1 mol/L的碳酸钠溶液600 μL终止反应。在405 nm下测定吸光值。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1 μmol p-硝基苯酚所需要的酶量为1个酶活力单位。

2、最适反应pH的测定

在不同的pH（3.5-7.5，100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液）条件下，90℃分别测定酶活，结果如图2-a所示。

由图2-a结果可见，本发明所述α-鼠李糖苷酶的最适反应pH为4.5。

3、最适反应温度的测定

在60-100℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲溶液为100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 4.5，结果如图2-b所示。

由图2-b结果可见，本发明所述α-鼠李糖苷酶的最适反应温度为90℃。

4、pH稳定性的测定

将纯化的重组酶TPERha在不同的pH（3.5-7.5，100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液）下70℃处理1 h，与不保温酶的酶相比，结果如图2-c所示。

由图2-c结果可见，本发明所述α-鼠李糖苷酶在pH3.5-7.5条件下75℃保温1h后仍能具有80%以上的残余酶活力。

5、温度稳定性的测定

在pH 6.0下，使酶在70℃，80℃，90℃温度下分别保温不同的时间（0，10，30，60，90，120 min），再测定相对酶活，以未保温（4℃保存）的酶活性为100%，结果如图2-d所示：菱形表示70℃；正方形表示80℃；三角形表示90℃。

由图2-d结果可见，本发明所述α-鼠李糖苷酶在70℃下保温2h残余酶活力高于85%。

6、与黑曲霉来源的α-鼠李糖苷酶最适温度及温度稳定性比较

黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶的最适温度：分别研究了20℃到45℃条件下的相对酶活。结果如图2-e所示：黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶的最适温度为35℃。该酶在30℃到35℃的范围之间相对酶活均在50%以上，但当温度高于40℃时酶的活力就急剧下降。

将黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶在30℃、40℃的温度下孵育不同的时间后，测定该酶的剩余的酶活力。结果如图2-f所示：黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶在30℃表现出较高的稳定性，孵育2h后仍有80%以上的相对酶活力；在40℃时，酶的活性急剧下降。

从以上结果可知，本发明所述α-鼠李糖苷酶最适反应温度显著高于黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶的最适温度，也是国内外至目前报导的α-L-鼠李糖苷酶最高的最适反应温度；本发明所述α-鼠李糖苷酶温度稳定性显著高于黑曲霉来源的重组α-L-鼠李糖苷酶的温度稳定性。

实施例4：本发明所述α-鼠李糖苷酶优选制备方法

将重组质粒pET-TPERha转化大肠杆菌JM109(DE3) 宿主菌（购自Novagen公司），在含有卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板（LB培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl5 g/L，琼脂 15 g/L）上经过37℃培养过夜，挑转化子到200 mL的LB培养基中（50 μg/mL 卡那霉素）37℃，200 rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度分别为0mM, 0.01 mM, 0.05mM，0.1 mM，0.5 mM 异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导剂，30℃培养7 h；以及不加诱导剂IPTG在30℃培养7h，用高速冷冻离心机分别将2mL培养液在4℃下，以13,000 rpm离心15 min，收集菌体。在菌体中加入一定体积缓冲溶液，重悬后，超声波破碎细胞，获得全细胞裂解液，去一定体积全细胞裂解液以13,000 rpm离心15 min，获得上清液可溶性蛋白溶液，沉淀即为不溶性蛋白—包涵体。我们通过测定上清液中α-鼠李糖苷酶活力来评价不同表达条件的效果，结果如图3所示。

图3所示1-5分别表示： 1, 30℃不加IPTG; 2, 30℃加IPTG至终浓度0.01mM; 3,30℃加IPTG至终浓度0.05mM；4, 30℃加IPTG至终浓度0.1mM；5, 30℃加IPTG至终浓度0.5mM。由图3可见，在30℃诱导下，不加IPTG时，重组酶几乎无表达；但是随着IPTG添加浓度越大，酶产率越低，可能是高浓度的诱导剂对菌体生长造成影响。由此可见，本发明所述表达α-鼠李糖苷酶的基因重组菌在30℃下加入0.01mM诱导剂IPTG即可达到高效表达。

实施例5：本发明所述α-鼠李糖苷酶的产酶曲线。

将实施例2中所述，转化后得到的带有表达质粒的重组菌转化子转接到30mL含有卡那霉素50 μg/mL的LB培养基中，经过37℃，180prm培养过夜，以此作为种子液，接种到50mL含有卡那霉素50 μg/mL的LB培养基至OD₆₀₀ 0.1左右，37℃，180prm培养至OD₆₀₀0.8，加入诱导剂IPTG至0.01mM，之后每2h取样一次，收集菌体，破碎测定酶活力。

结果如图4所示，重组菌在诱导表达前期酶活力偏低，一直到诱导至6h后，其α-鼠李糖苷酶活力达到最高，至4.5U/mL，继续延长诱导时间至8h后酶活力开始下降，可能是培养时间延长之后菌体生长环境变化导致其对异源蛋白的表达能力减弱，所以诱导6h较优。

实施例6：本发明所述α-鼠李糖苷酶对橘皮苷的水解

取纯化后的α-L-鼠李糖苷酶0.5U，加入100 μL 100 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，10μL 50 mmoL/L的橘皮苷（甲醇溶解），添加去离子水至200μL，在90℃条件下孵育30min，取出12000rpm 离心2min，加入200 μL甲醇（分析纯）混匀，经0.22 μm的有机滤膜过滤到色谱瓶中，使用HPLC分析，分析条件为：柱温，30℃；流速，1.0 mL/min；进样量，5 μL；检测波长，270 nm；流动相，甲醇：超纯水=50:50 (V:V) 。结果如图5所示。

图5-a是灭活的重组α-L-鼠李糖苷酶酶液处理的橘皮苷的HPLC图谱。结果表明，本发明所述α-鼠李糖苷酶能在高温条件下水解橘皮苷等含α-1,6-鼠李糖苷键的黄酮类化合物。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种α-鼠李糖苷酶及其制备方法和应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 876

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ile Gln Ala Cys Asp Leu Arg Cys Glu Tyr Leu Thr Ser Pro Val

1 5 10 15

Leu Gly Leu Asp Val Ile Pro Arg Phe Ser Trp Arg Leu Lys Gly Asn

20 25 30

Gly Lys Lys Gln Thr Arg Tyr Lys Ile Ile Val Ser Asp Asn Phe Asp

35 40 45

Asp Ile Glu Arg Gly Ile Gly Asn Val Trp Glu Ser Glu Lys Asp Ser

50 55 60

Ser Lys Asn Leu Asn Ile Glu Tyr Glu Gly Pro Lys Leu Lys Ala Tyr

65 70 75 80

Lys Gly Tyr Tyr Trp Arg Val Lys Leu Trp Asp Glu Lys Glu Asn Gly

85 90 95

Pro Trp Ser Glu Thr Ala Tyr Phe Glu Met Gly Pro Leu Glu Asp Trp

100 105 110

Arg Gly Lys Trp Ile Thr Met Pro Ser Pro Leu Ser Phe Lys Asp Pro

115 120 125

Ala His Arg His Glu Leu Phe Tyr Ala Met Tyr Phe Arg Lys Glu Phe

130 135 140

Leu Leu Asn Lys Glu Val Glu Lys Ala Arg Val Tyr Val Ser Gly Leu

145 150 155 160

Gly Val Tyr Glu Leu His Leu Asn Gly Lys Arg Val Gly Asn Asn Val

165 170 175

Leu Asp Pro Ala Pro Thr Asp Tyr Asn Lys Val Ala Leu Tyr Ser Thr

180 185 190

Tyr Asp Val Thr Gln Tyr Leu Thr Thr Gly Lys Asn Thr Ile Gly Val

195 200 205

Ile Leu Gly Asn Gly Arg His Ile Arg Asp Tyr Gly Tyr Ser Lys Pro

210 215 220

Lys Leu Tyr Leu Gln Leu Leu Val Phe Tyr Lys Asp Gly Ser Arg Glu

225 230 235 240

Phe Ile Cys Ser Asp Glu Thr Trp Lys Val Ser His Gly Pro Leu Lys

245 250 255

Glu Asn Gly Ile Tyr Phe Gly Glu Val Tyr Asp Ala Arg Asp Glu Ile

260 265 270

Ser Gly Trp Asp Ser Pro Gly Phe Asp Asp Arg Asn Trp Ser Glu Val

275 280 285

Glu Ile Val Glu Gly Pro Ser Leu Lys Ala Gln Leu Ile Pro Val Ile

290 295 300

Arg Val Cys Glu Val Ile Lys Pro Lys Arg Leu Trp Leu Ser Ser Arg

305 310 315 320

Gly Thr Phe Ile Val Asp Phe Gly Lys Asn Ile Ser Gly Trp Val Lys

325 330 335

Leu Arg Val Asn Asn Gly Lys Arg Gly Glu Lys Ile Ile Ile Arg Tyr

340 345 350

Ala Glu Val Leu Asp Pro Ser Met Asp Arg Leu Asp Thr Arg Asn Leu

355 360 365

Arg Leu Ala Arg Ala Thr Asp Glu Tyr Ile Leu Lys Gly Gln Gly Val

370 375 380

Glu Ile Tyr Glu Pro Arg Phe Thr Tyr His Gly Phe Arg Tyr Val Glu

385 390 395 400

Val Glu Asp Tyr Pro Gly Thr Leu Thr Ser Asp Asn Ile Glu Ala Met

405 410 415

Phe Val His Thr Asp Val Glu Lys Val Gly Asp Phe Ala Cys Ser Ser

420 425 430

Glu Leu Leu Asn Lys Ile His Ser Cys Val Val Asn Ser Gln Leu Ala

435 440 445

Asn Leu Met Gly Ile Pro Thr Asp Cys Pro Gln Arg Asp Glu Arg Met

450 455 460

Gly Trp Leu Gly Asp Ala Gln Leu Thr Val Glu Glu Ala Met Tyr Asn

465 470 475 480

Phe Asp Met Ala Ala Phe Tyr Thr Lys Tyr Leu Met Asp Ile Lys Leu

485 490 495

Ser Gln Lys Glu Asp Gly Ser Ile Ser Asp Val Ala Pro Pro Tyr Trp

500 505 510

Lys Arg Tyr Pro Ser Asp Pro Ala Trp Gly Thr Ala Tyr Ala Thr Ile

515 520 525

Leu Trp Tyr Leu Tyr Phe Phe Tyr Glu Asp Arg Arg Val Leu Glu Glu

530 535 540

His Tyr Asp Ser Leu Lys Arg Tyr Val Glu Phe Leu Arg Lys Asn Ser

545 550 555 560

Pro Asn His Leu Thr Lys Leu Gly Gln His Gly Asp Trp Cys Pro Pro

565 570 575

Gly Asp Lys Phe Pro Lys Arg Thr Pro Leu Ile Leu Thr Ser Thr Trp

580 585 590

Tyr Tyr Tyr His Asp Thr Leu Ile Leu Ser Glu Ile Ala Lys Ile Leu

595 600 605

Gly Lys Lys Glu Asp Glu His Glu Tyr Arg Lys Leu Ala Gly Glu Ile

610 615 620

Lys Glu Ala Phe Asn Arg His Phe Leu Arg Lys Val Glu Asp His Thr

625 630 635 640

Gly Arg Ile Val Cys Phe Tyr Arg Gly Ile Lys Leu Ser Pro Lys Asp

645 650 655

Arg Ile Pro Thr Thr Gln Thr Cys Asn Val Leu Pro Leu Trp Asn Lys

660 665 670

Met Val Pro Glu Glu Cys Arg Glu Asp Val Phe Lys Val Leu Glu Arg

675 680 685

Leu Ile Glu Val Asp Asn Asp Thr His Phe Asp Thr Gly Ile Val Gly

690 695 700

Thr Arg Tyr Ile Leu Glu Val Leu Ser Glu Asn Gly Arg Lys Asp Leu

705 710 715 720

Ala Leu Lys Leu Leu Leu Lys Glu Asp Tyr Pro Ser Phe Gly Tyr Met

725 730 735

Ile Lys Asn Gly Ala Thr Thr Leu Trp Glu Arg Trp Glu Lys Leu Glu

740 745 750

Gly Thr Gly Met Asn Ser His Asn His Val Met Leu Gly Ser Val Asp

755 760 765

Thr Trp Phe Tyr Lys Tyr Leu Ser Gly Ile Lys Pro Val Ala Pro Gly

770 775 780

Trp Lys Lys Ile Arg Ile Glu Pro Tyr Phe Ala Asp Gln Ile Asp Phe

785 790 795 800

Val Ser Ala Lys Ile Lys Thr Pro Asn Gly Ser Leu Glu Val Ser Trp

805 810 815

Lys Lys Gln Asn Lys Glu Tyr Glu Ile Gln Ile Ile Ile Pro Val Asn

820 825 830

Thr Val Gly Ile Phe Ala Val Pro Glu Ser Phe Lys Val Ser Ala Ile

835 840 845

Asn Ser Lys Gln Val Ser Tyr Pro Ser Glu Phe Glu Leu Glu Pro Gly

850 855 860

Ala Tyr Asn Ile Val Leu Glu Arg Val Arg Glu Cys

865 870 875

<210> 2

<211> 2631

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgatacagg cctgtgatct tcgctgtgaa tatttgacgt ctcctgtcct tggactcgat 60

gtgattcctc gattttcttg gagattaaag ggtaatggaa agaaacaaac acgatacaaa 120

attatcgttt cggacaattt cgatgatatc gaaagaggaa taggaaatgt gtgggagagc 180

gaaaaagatt cttcaaaaaa cctgaacata gaatatgaag ggccaaaatt gaaagcttac 240

aagggctact attggcgcgt gaaactttgg gatgaaaaag aaaatggacc gtggagtgag 300

acagcttact tcgaaatggg ccctttagag gattggagag gaaaatggat aaccatgcct 360

tctccgctct cttttaagga tccagcccat cgccatgaac tcttctacgc tatgtacttt 420

cgaaaggagt ttctcttaaa caaagaggta gaaaaagcac gggtttatgt gagcgggctg 480

ggagtctatg aactccattt gaacggaaaa agagtgggaa acaatgttct cgatcctgca 540

ccaacggatt acaacaaggt agcactctat tcaacatacg atgtcacaca atatctaaca 600

acgggaaaaa atacaatagg tgtgattctt ggtaacggcc gccatatcag agattatggg 660

tattcaaaac caaaacttta tcttcaactg cttgtgttct acaaagatgg atcgcgggaa 720

ttcatttgct ccgacgaaac atggaaggtt tcacatggac ctctgaagga aaatggcatc 780

tattttggcg aagtctacga tgcccgcgac gaaatatctg gatgggattc acccggtttc 840

gacgatagga actggtcaga agtagaaatc gtagaaggtc cttctctgaa agcacaactg 900

attcctgtca tacgtgtttg tgaggttatt aaaccaaaga ggttgtggtt gtcttccaga 960

ggaactttca tagttgattt tggcaaaaat atttccgggt gggtgaagct gagagtaaat 1020

aacggtaaaa gaggggagaa aattatcata cgctatgcgg aagtactgga tccctccatg 1080

gatcggctgg atacgagaaa tcttcgtcta gcacgtgcta cagacgaata cattctgaag 1140

ggacagggag tggaaatcta cgaaccaaga ttcacatacc atgggtttcg ttatgtcgaa 1200

gtggaagact atcctggcac tttaacctcc gataacatag aagcaatgtt tgtccacaca 1260

gatgttgaaa aagttggaga ttttgcctgc tcgagtgaac ttttgaacaa aatccactca 1320

tgtgttgtga acagtcagtt agctaacctg atgggaattc ctacagattg cccccagaga 1380

gatgaaagaa tgggatggtt gggtgatgcc caattaacgg ttgaagaggc gatgtacaac 1440

ttcgacatgg cagctttcta cacgaaatat ctcatggaca taaagctttc ccagaaagaa 1500

gatggaagta tatcagatgt tgctcctccc tactggaaga gatacccgtc agatccagct 1560

tggggaaccg cctatgcgac gattttgtgg tatctctatt tcttctatga agacagaaga 1620

gtactggaag aacactatga ttcgctgaaa cgttacgtag agtttctcag aaagaattcc 1680

cctaatcatt taacaaaatt aggacagcat ggtgattggt gtcctccagg tgataaattc 1740

ccaaagcgca ctcctttgat tctaacttcc acatggtatt actatcacga taccctcatt 1800

ttgagcgaga tagcgaaaat actcggaaaa aaggaagacg aacatgagta tagaaaactt 1860

gccggagaaa taaaagaagc cttcaaccgt cattttctca ggaaagttga ggatcacacg 1920

ggtcggattg tgtgcttcta cagaggaata aagttgagcc ccaaagatag aattcccacc 1980

actcagacgt gtaatgttct gcctctctgg aacaagatgg ttccggaaga gtgtagagag 2040

gatgtgttca aagtccttga gagactgata gaagtggata acgatacgca ttttgacacc 2100

ggaatcgtgg gtactcgtta catactcgag gttttatcgg aaaatggcag gaaagacctt 2160

gcattgaaac ttcttttgaa agaagattat ccaagctttg gctacatgat aaagaacggt 2220

gcaacaacac tgtgggagag atgggagaag ctggaaggta ctggcatgaa ttcacataat 2280

catgtcatgc tgggtagcgt cgacacatgg ttctataagt atctttcggg aataaaaccg 2340

gttgctcccg gttggaagaa gataaggata gaaccatact tcgctgatca aatagatttc 2400

gtttcggcca aaataaaaac cccaaatgga tcacttgagg ttagttggaa aaagcagaat 2460

aaagaatatg aaatccagat tattataccg gtgaatacgg ttggtatttt cgctgttccg 2520

gaaagtttca aagtatctgc aataaacagc aaacaagtga gttatccttc tgagtttgaa 2580

cttgaaccag gtgcctacaa catcgttctc gaaagggtga gagaatgtta g 2631

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cggctagcat gatacaggcc tgtgatcttc gctgt 35

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tatagcggcc gcttagtggt ggtggtggtg gtgaca 36

Claims (1)

1.氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-鼠李糖苷酶在90℃选择性水解橘皮苷中鼠李糖的应用。