CN104611313A

CN104611313A - 一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN104611313A
Application number: CN201510026295.4A
Authority: CN
Inventors: 赵林果; 解静聪; 赵东霞; 萧伟; 丁岗; 王振中
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2015-01-19
Filing date: 2015-01-19
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2035-01-19
Also published as: CN104611313B

Abstract

一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述β-葡萄糖苷酶热稳定性优异，能耐受高温；本发明所述β-葡萄糖苷酶具有较高β-1,6-糖苷键水解能力同时具有较强的α-1，6-阿拉伯吡喃糖苷键水解能力，对人参皂苷Rb1和Rb2的转化能力强，本发明所述β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1和Rb2孵育一定时间后，检测到人参皂苷Rb1或Rb2几乎完全转化为人参皂苷Rd；本发明所述TPEBGL1的制备方法不需要诱导剂IPTG即可高效表达。

Description

一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，尤其是酶法转化多组分人参皂苷Rb1和Rb2制备人参皂苷Rd的应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是一种多年生五茄科人参属药用植物，是我国传统名贵中药材，其显著的抗肿瘤、抗炎、抗衰老活性一直以来都是研究的热点。随着现代分离和分析技术的进步，人参皂苷中的活性成分也得到了深入的解析，已分离鉴定的人参皂苷单体有50余种。

近年来，人参皂苷Rd因其独特的药理活性受到广泛的关注，其独特的肾脏保护功能和特异性阻断受体依赖性钙离子通道功能是其它单体所没有的，同时人参皂苷Rd还具有较强的促进神经干细胞分化和保护神经系统功能，除此之外，还具有治疗心血管疾病、炎症等功能。因此，开发一种高效专一、低成本且绿色的人参皂苷Rd生产工艺具有迫切的现实需要同时也具有重要的实际应用价值。

人参皂苷Rd相对于多组分人参皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Re和Rg1)在人参中含量显著偏低，从人参中直接提取回收率低，无法应用于大规模生产；因其结构的复杂性，使得化学合成人参皂苷Rd更为困难，然而根据人参皂苷Rd在结构方面与多组分人参皂苷Rb1、Rb2的相比发现(图1)，它们都具有相同的达玛烷骨架，仅在碳20位相差一个糖基(吡喃葡萄糖基和阿拉伯吡喃糖基)。因此去除该20位的相应糖基即可得到所需产物人参皂苷Rd，而相比反应条件剧烈的物理及化学方法，生物酶法所适用的反应条件相对温和且高效专一，几乎不产生废弃物因此无污染，绿色环保。

针对目前已有的对转化人参皂苷Rd方面的研究及相关专利，发现其中存在的局限有：(1)大部分生物转化人参皂苷所用方式是微生物转化，但微生物转化所得产物品质难以控制，对产品的纯度及得率有较大影响，而酶处理专一性强，副产物少，因此发掘单一高效的糖苷水解酶能达到提高产物得率及纯度的目的；(2)在利用生物酶转化制备人参皂苷Rd研究中，可以通过β-葡萄糖苷酶催化人参皂苷Rb1来获得，但还没有通过微生物酶催化人参皂苷Rb2来获得，也没有发现能催化人参皂苷Rb2的β-葡萄糖苷酶。因此发掘高效转化人参皂苷Rb2的水解酶，特别是既能转化人参皂苷Rb1又能转化人参Rb2水解酶，对于制备人参皂苷Rd具有重大意义和应用前景。此外，提高制备Rd产量，对进一步转化Rd制备获得人参皂苷Rg3，Rh2和CK等更多活性物质也具有重要意义；(3)酶水解人参皂苷过程中的产物之一的葡萄糖对β-葡萄糖苷酶具有强烈的抑制作用，对酶活力有极大的影响，发掘耐糖能力优异的β-葡萄糖苷酶有利于提高酶催化的效率，该种性质对降低生产成本及能耗具有重要意义。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对上述局限性，本申请人提供一种具有较高阿拉伯吡喃糖苷酶活力的β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，并通过基因工程技术获得催化效率高，热稳定性优异，能耐受高温的重组β-葡萄糖苷酶TPEBGL1，该重组酶TPEBGL1对人参皂苷Rb1和Rb2都具有较强的催化能力。同时，能耐受较高浓度的葡萄糖。因而可降低产物反馈抑制对酶活力的影响，此外，还创立了一种不需IPTG诱导即可高效表达该重组酶TPEBGL1的酶制备方法，因此通过TPEBGL1转化制备人参皂苷Rd的方法是一种高效、便捷的方法。

技术方案：一种β-葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述β-葡萄糖苷酶的制备方法，将SEQ ID NO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌，以及其诱导表达条件和后续目的蛋白的纯化。

所述制备方法步骤如下：

1)、以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995基因组DNA为模板，用具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)、将得到的DNA分子和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，连接得到含有β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒；

3)、将步骤2)得到的重组质粒转化表达宿主菌JM109(DE3)，不加IPTG于37℃下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni²⁺亲和层析柱纯化即得。

包含所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸片段的重组质粒。

所述β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷Rd中的应用。

一种通过所述β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rb1和Rb2制备人参皂苷Rd的方法，所述β-葡萄糖苷酶在pH 4-8，温度30℃-95℃，酶解人参皂苷Rb1和Rb2制备得到人参皂苷Rd。pH优选为6.0，温度优选为90℃。

有益效果：

(1)本发明所述β-葡萄糖苷酶热稳定性优异，能耐受高温；

(2)本发明所述β-葡萄糖苷酶具有较高β-1,6-糖苷键水解能力同时具有较强的α-1，6-阿拉伯吡喃糖苷键水解能力，对人参皂苷Rb1和Rb2的转化能力强，本发明所述β-葡萄糖苷酶与人参皂苷Rb1和Rb2孵育一定时间后，检测到人参皂苷Rb1或Rb2几乎完全转化为人参皂苷Rd；

(3)本发明所述TPEBGL1的制备方法不需要诱导剂IPTG即可高效表达。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明所述β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rb1和Rb2生成人参皂苷Rd的水解线路图。

图2为实施例2纯化的β-葡萄糖苷酶的纯度鉴定结果图；其中泳道M为蛋白Marker(购自Thermo scientific公司，货号2661)，泳道1为纯酶蛋白；泳道2为诱导表达后全细胞裂解液；泳道3为PET-20b转化宿主菌空白对照的全细胞裂解液。

图3为实施例3本发明所述β-葡萄糖苷酶诱导表达结果图，其中纵坐标为相对酶活力，单位为％；横坐标为诱导条件的编号，其中1-6分别表示：1，37℃不加IPTG；2,30℃不加IPTG；3,30℃加IPTG至终浓度0.01mM；4，30℃加IPTG至终浓度0.05mM；5，30℃加IPTG至终浓度0.1mM；6，30℃加IPTG至终浓度0.5mM。

图4为实施例4本发明所述述β-葡萄糖苷酶的定性测定结果图，其中a为最适反应pH的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位％；b为最适反应温度的测定结果图，横坐标为温度，单位摄氏度(℃)，纵坐标为相对酶活力，单位％；c为pH稳定性的测定结果图，横坐标为pH，纵坐标为相对酶活力，单位％；d为温度稳定性的测定结果图，横坐标为保温时间，单位小时(min)，纵坐标为相对酶活力，单位％。

图5所示为实施例5本发明所述β-葡萄糖苷酶的耐糖系数Ki测定结果图。横坐标为反应体系中葡萄糖添加量，单位mM，纵坐标为相对酶活力，单位％。

图6系列所示实施例6不同反应时间下利用HPLC对人参皂苷Rb1和Rb2分别水解制备人参皂苷Rd转化情况进行检测的结果图，其中：

图6A为人参皂苷Rb1经TPEBGL1制备生成人参皂苷Rd的结果图；

图6B为不同反应时间下(0，10，20，30，40，50，60min)对人参皂苷Rb1酶水解生成人参皂苷Rd的组分变化情况进行HPLC分析结果图；

图6C为人参皂苷Rb2经TPEBGL1制备生成人参皂苷Rd的结果图；

图6D为不同反应时间下(0，5,10,30，50，70，80,90min)对人参皂苷Rb2酶水解生成人参皂苷Rd的组分变化情况进行HPLC分析结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种具有α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶活力的β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为TPEBGL1。

本发明也提供了编码本发明所述β-葡萄糖苷酶的DNA分子片段。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本发明提供了可以编码所述的β-葡萄糖苷酶TPEBGL1的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

为了制备本发明所述酶蛋白，本发明还提供了本发明所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法

在一些实施方案中，本发明所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，为获得本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子片段，将该DNA分子插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化表达宿主菌，不加IPTG于37℃下诱导表达，分离纯化即得。

本发明同时还提供了一种包含本发明所述的β-葡萄糖苷酶的DNA分子的重组质粒，所述的重组质粒为pET-TPEBGL1。

本发明所述转化表达宿主菌为大肠杆菌表达菌株，包括Rosetta系列和BL21、JM109系列菌株。在一个优选实施方案中，宿主细胞为JM109(DE3)菌株。

本发明所述β-葡萄糖苷酶的制备方法所述诱导表达分离纯化具体为不加IPTG于37℃下诱导培养含重组质粒的表达宿主菌，收集菌体超声波破碎，取上清亲和层析得到融合蛋白。

本发明还提供了一种制备人参皂苷Rd的方法，具体为本发明所述β-葡萄糖苷酶在下pH6.0，90℃条件下同时酶解人参皂苷Rb1和Rb2制备得到人参皂苷Rd。

本发明所述的β-葡萄糖苷酶具有多功能，包括β-葡萄糖苷酶活力和α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶活力，可以水解人参皂苷Rb1第20位C上β-1,6-糖苷键和Rb2第20位C上α-1,6-阿拉伯吡喃糖苷键，制备得到人参皂苷Rd。在反应5min后即有人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应40min后，人参皂苷Rb1几乎完全转化为人参皂苷Rd，人参皂苷Rd得率约为97％。对Rb2进行转化时同样随反应时间延长产物人参皂苷Rd的积累量逐渐增大，反应结束时转化率约为99％。因此本发明还提供了所述β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷Rd中的应用。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细阐述，其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到；如无特殊说明，实施例中涉及的具体操作参见《分子克隆实验指南第三版》。

实施例1：本发明所述β-葡萄糖苷酶基因的获得及重组质粒pET-TPEBGL1的构建

1.1Thermotoga petrophila DSM 13995的培养

Thermotoga petrophila DSM 13995购于DSMZ菌种保藏中心(www.dsmz.de)编号为13995，其培养基配方为：10g/L淀粉、5g/L胰蛋白胨、3g/L酵母提取物、5g/L肉浸液、10g/L 2-马啉乙磺酸、10mg/L七水合硫酸铁、1mg/L刃天青,调整pH为7.2。用注射器按照0.5％接种量接种，85℃静止培养24h，收集细胞。

1.2基因组DNA的提取

(1)静置培养Thermotoga petrophila DSM 13995约24小时，取30mL菌液4,000g离心10min收集细胞。

(2)用9.5mL TE缓冲液重悬菌体，加入0.5mL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)和50μL蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀，37℃保温1h。

(3)加入1.8mL 5mol/L NaCl，1.5mL十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)/NaCl，混匀，65℃温育20min。

(4)加入等体积氯仿/异戊醇，混匀，6,000g离心10min。

(5)为防止剪切力造成基因组DNA断裂，用粗口吸管将上清转入另一离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇混匀，6,000g离心10min。

(6)另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，轻轻晃动至白色丝状DNA沉淀清晰可见。

(7)用吸管将DNA缠绕其上，在70％酒精中清洗。

(8)用无菌牙签将DNA从吸管上刮下，转入1.5mL离心管中。

(9)室温下风干，加500μL TE缓冲液溶解。

(10)取50μL用核酸蛋白检测仪检测DNA浓度。

1.3重组质粒pET-BGL的构建

按照已知的Thermotoga petrophila DSM 13995耐高糖β-葡萄糖苷酶基因(登录号：YP_001244492.1)设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：

P1：CGCCATATGAACGTGAAAAAGTTCCC，下划线表示Nde I位点(SEQ ID NO.3)。

P2：CCGCTCGAGATCTTCCAGACTGTTGCTT，下划线表示Xho I位点，并去除终止密码子(SEQ ID NO.4)。

以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995的基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，扩增的条件是95℃，5min；暂停计时，加Pyrobest聚合酶，加40μL石蜡油密封；28次循环(94℃，30s；58℃，30s；72℃，1.5min)；72℃，10min；反应停止，4℃保温。通过凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物进行纯化。得到β-葡萄糖苷酶TPEBGL1的DNA分子。

将得到的β-葡萄糖苷酶TPEBGL1的DNA分子和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，并分别割胶回收，浓缩后16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有耐高温β-葡萄糖苷酶DNA分子的重组质粒pET-TPEBGL1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：本发明所述β-葡萄糖苷酶的制备

将重组质粒pET-TPEBGL1转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主菌(购自Novagen公司)，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度为0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，30℃培养6h，用高速冷冻离心机将培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体。

由于重组质粒pET-TPEBGL1中含有His-tag标签，通过His·Bind Purification Kit(购自Novagen公司)进行纯化，得到纯化的重组酶。具体操作过程：

A.样品的处理

(1)将洗涤过的菌体，用1×Binding Buffer 8mL重悬，超声波破壁。

(2)破壁后，13,000g离心30min，取上清即为样品。

B.处理柱子

(1)取1mL填料装柱。

(2)用3mL的无菌水洗柱子。

(3)用5mL的1×Charge Buffer洗柱子。

(4)用3mL的1×Binding Buffer洗柱子。

C.上样

(1)将样品加入柱子，控制流速约每分钟6滴。

(2)用3mL 1×Binding Buffer洗柱子，除去未结合的蛋白质。

(3)用4mL含有20mM咪唑的洗脱液洗柱子，除去杂蛋白。

(4)用80mmol/L咪唑的洗脱液洗柱子，将目的蛋白洗脱下来。

(5)用4mL 1×Strip Buffer洗柱子。

通过此过程得到纯化的β-葡萄糖苷酶，通过SDS-PAGE电泳后染色鉴定β-葡萄糖苷酶的纯度，结果如图2所示。

由图2结果可见，TPEBGL1基因在宿主菌JM109(DE3)中表达量较高，目的蛋白通过HisTag标签纯化后，其洗脱液中β-葡萄糖苷酶TPEBGL1纯度较高，在55kDa处有单一的条带，达到电泳纯级别。

实施例3：本发明所述β-葡萄糖苷酶优选制备方法

将重组质粒pET-TPEBGL1转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主菌(购自Novagen公司)，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板(LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 5g/L，琼脂15g/L)上经过37℃培养过夜，挑转化子到200mL的LB培养基中(50μg/mL氨苄青霉素)37℃，200rpm振荡培养至OD600为0.6时，加入终浓度分别为0mM,0.01mM,0.05mM，0.1mM，0.5mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导剂，30℃培养7h；以及不加诱导剂IPTG在37℃培养7h，用高速冷冻离心机分别将2mL培养液在4℃下，以13,000rpm离心15min，收集菌体。在菌体中加入一定体积缓冲溶液，重悬后，超声波破碎细胞，获得全细胞裂解液，去一定体积全细胞裂解液以13,000rpm离心15min，获得上清液可溶性蛋白溶液，沉淀即为不溶性蛋白—包涵体。我们通过测定上清液中β-葡萄糖苷酶活力来评价不同表达条件的效果，结果如图3所示。

图3所示1-6分别表示：0，37℃不加IPTG；1,30℃不加IPTG；2,30℃加IPTG至终浓度0.01mM；30℃加IPTG至终浓度0.05mM；30℃加IPTG至终浓度0.1mM；30℃加IPTG至终浓度0.5mM。由图3可见，在30℃下诱导产酶时，IPTG添加浓度越大，酶产率越低，在30℃诱导下，不加IPTG时，重组酶含量较高，在提高培养温度至37℃时，重组酶与30℃培养条件下比较又有较大提高，可达到32U/mL。由此可见，本发明所述表达具有α-L-阿拉伯吡喃糖苷酶活力的β-葡萄糖苷酶的基因重组菌只需在最适生长条件(37℃)下培养无需诱导剂IPTG即可达到高效表达。

实施例4：本发明所述β-葡萄糖苷酶的定性测定

1、酶活的测定方法

反应体系100μL，5μL 20mmol/L对硝基苯β-D葡萄糖苷(pNPG)中加入85μL 100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 6.0)，先在90℃孵育3min，再加入10μL酶液(稀释到合适的倍数)反应10min，显色后再加入1mol/L的碳酸钠溶液600μL终止反应。在405nm下测定吸光值。酶活力单位(U)定义为：在测定条件下，每分钟产生1μmol p-硝基苯酚所需要的酶量为1个酶活力单位。

2、最适反应pH的测定

在不同的pH(3.0-7，100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；7.5-9，100mmol/L巴比妥-盐酸缓冲溶液)条件下，90℃分别测定酶活，结果如图4中a所示。

由图4中a结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶的最适反应pH为6.0。

3、最适反应温度的测定

在60-100℃范围内，每隔5℃，分别测定酶活。缓冲为100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，pH 6.0，结果如图4中b所示。

由图4中b结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为90℃。

4、pH稳定性的测定

将纯化的重组酶TPEBGL1在不同的pH(3.0-7，100mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；7.5-9,100mmol/L巴比妥-盐酸缓冲溶液)下70℃处理1h，与不保温酶的酶相比，结果如图4中c所示。

由图4中c结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶在pH3.5－9.0条件下75℃保温1h后仍能具有80％以上的残余酶活力。

5、温度稳定性的测定

在pH 6.0下，使酶在70℃，80℃，90℃温度下分别保温不同的时间(0，10，30，60，90，120min)，再测定相对酶活，以未保温(4℃保存)的酶活性为100％，结果如图4中d所示：正方形表示90℃；菱形表示80℃；三角形表示70℃。

由图4中d结果可见，本发明所述β-葡萄糖苷酶在70℃下保温2h残余酶活力高于90％。

实施例5：本发明所述β-葡萄糖苷酶对葡萄糖耐受能力测定。

测定方法：在相同的反应体系(100μL,10mM pNPG,50mM pH6.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；)中加入葡萄糖至不同浓度,在最适反应条件下测定本发明所述β-葡萄糖苷酶活力，结果如图5所示。

由图5可知本专利所述β-葡萄糖苷酶TPEBGL1在葡萄糖终浓度400mM的反应体系中，有近50％的残余酶活力，其Ki系数为400mM，且该β-葡萄糖苷酶在反应体系中葡萄糖终浓度为0-200mM之间时，具有明显的激活作用，即在催化反应开始后酶活力逐渐提高，同时，在葡萄糖添加量50mM时达到最高，其酶活力为对照组(0mM葡萄糖)的1.4倍。

实施例6：本发明所述β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rb1和Rb2制备Rd

人参皂苷Rb1标准品、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc标准品和人参皂苷Rd标准品均购自成都曼斯特生物科技有限公司。

HPLC检测条件为:Agilent 1260Infinity；DAD检测器检测波长为203nm，柱温为30℃，流动相流速为1.2mL/min(A:水，B:乙腈；0min，A:B为70:30；10min，A:B为55:45；15min，A:B为40:60；18min，A:B为40:60；20min A:B为70:30；23min A:B为70:30)。

1.酶转化Rb1生成Rd。

酶转化反应体系为50μL，其中Rb1浓度为30g/L，酶添加量约为1.2U/mL，反应在pH 6.0，90℃下进行，分别对不同反应时间(0，5，10，15，20，25，30，50min)的样品利用HPLC进行成分检测，结果见图6A,6B。由图6B检测结果可见，在反应5min后即检出有人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应50min后，人参皂苷Rb1几乎完全转化为人参皂苷Rd，人参皂苷Rd得率约为97％。

2.酶转化Rb2生成Rd。

酶转化反应体系为50μL，其中Rb1浓度为10g/L，酶添加量约为4U/mL，反应在pH 6.0，90℃下进行，分别对不同反应时间(0，5，10，30，50，70，80，90min)的样品利用HPLC进行成分检测，结果见图6C,6D。由图6D检测结果可见，在反应5min后即检出有人参皂苷Rb2转化为人参皂苷Rd，且随着反应时间的延长，转化率提高。在反应90min后，人参皂苷Rb2几乎完全转化为人参皂苷Rd，人参皂苷Rd得率约为99％。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn Val Lys Lys Phe Pro Glu Gly Phe Leu Trp Gly Val Ala Thr

1 5 10 15

Ala Ser Tyr Gln Ile Glu Gly Ser Pro Leu Ala Asp Gly Ala Gly Met

20 25 30

Ser Ile Trp His Thr Phe Ser His Thr Pro Gly Asn Val Lys Asn Gly

35 40 45

Asp Thr Gly Asp Val Ala Cys Asp His Tyr Asn Arg Trp Lys Glu Asp

50 55 60

Ile Glu Ile Ile Glu Lys Leu Gly Val Lys Ala Tyr Arg Phe Ser Ile

65 70 75 80

Ser Trp Pro Arg Ile Leu Pro Glu Gly Thr Gly Arg Val Asn Gln Lys

85 90 95

Gly Leu Asp Phe Tyr Asn Arg Ile Ile Asp Thr Leu Leu Glu Lys Gly

100 105 110

Ile Thr Pro Phe Val Thr Ile Tyr His Trp Asp Leu Pro Phe Ala Leu

115 120 125

Gln Leu Lys Gly Gly Trp Ala Asn Arg Glu Ile Ala Asp Trp Phe Ala

130 135 140

Glu Tyr Ser Arg Val Leu Phe Glu Asn Phe Gly Asp Arg Val Lys Asn

145 150 155 160

Trp Ile Thr Leu Asn Glu Pro Trp Val Val Ala Ile Val Gly His Leu

165 170 175

Tyr Gly Val His Ala Pro Gly Met Arg Asp Ile Tyr Val Ala Phe Arg

180 185 190

Ala Val His Asn Leu Leu Arg Ala His Ala Lys Ala Val Lys Val Phe

195 200 205

Arg Glu Thr Val Lys Asp Gly Lys Ile Gly Ile Val Phe Asn Asn Gly

210 215 220

Tyr Phe Glu Pro Ala Ser Glu Lys Glu Glu Asp Ile Arg Ala Ala Arg

225 230 235 240

Phe Met His Gln Phe Asn Asn Tyr Pro Leu Phe Leu Asn Pro Ile Tyr

245 250 255

Arg Gly Asp Tyr Pro Glu Leu Val Leu Glu Phe Ala Arg Glu Tyr Leu

260 265 270

Pro Glu Asn Tyr Lys Asp Asp Met Ser Glu Ile Gln Glu Lys Ile Asp

275 280 285

Phe Val Gly Leu Asn Tyr Tyr Ser Gly His Leu Val Lys Phe Asp Pro

290 295 300

Asp Ala Pro Ala Lys Val Ser Phe Val Glu Arg Asp Leu Pro Lys Thr

305 310 315 320

Ala Met Gly Trp Glu Ile Val Pro Glu Gly Ile Tyr Trp Ile Leu Lys

325 330 335

Lys Val Lys Glu Glu Tyr Asn Pro Pro Glu Val Tyr Ile Thr Glu Asn

340 345 350

Gly Ala Ala Phe Asp Asp Val Val Ser Glu Asp Gly Arg Val His Asp

355 360 365

Gln Asn Arg Ile Asp Tyr Leu Lys Ala His Ile Gly Gln Ala Trp Lys

370 375 380

Ala Ile Gln Glu Gly Val Pro Leu Lys Gly Tyr Phe Val Trp Ser Leu

385 390 395 400

Leu Asp Asn Phe Glu Trp Ala Glu Gly Tyr Ser Lys Arg Phe Gly Ile

405 410 415

Val Tyr Val Asp Tyr Ser Thr Gln Lys Arg Ile Ile Lys Asp Ser Gly

420 425 430

Tyr Trp Tyr Ser Asn Val Val Lys Ser Asn Ser Leu Glu Asp

435 440 445

<210> 2

<211> 1341

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaacgtga aaaagttccc tgaaggattc ctctggggtg ttgcaacagc ttcctaccag 60

atcgagggtt ctcccctcgc agacggagct ggtatgtcta tctggcacac cttctcccat 120

actcctggaa atgtaaagaa cggtgacacg ggagatgtgg cctgcgacca ctacaacaga 180

tggaaagagg acattgaaat catagagaaa ctcggagtaa aggcttacag attttcaatc 240

agctggccaa gaatacttcc ggaaggaaca ggaagggtga atcagaaagg actggatttt 300

tacaacagga tcatagacac cctgctggaa aaaggtatca caccctttgt gaccatctat 360

cactgggatc ttcccttcgc tcttcagttg aaaggaggat gggcgaacag agaaatagcg 420

gattggttcg cagaatactc aagggttctc tttgaaaatt tcggcgaccg tgtgaagaac 480

tggatcacct tgaacgaacc gtgggttgtt gccatagtgg ggcatctgta cggagtccac 540

gctcctggaa tgagagatat ttacgtggct ttccgagctg ttcacaatct cttgagggca 600

cacgccaaag cggtgaaagt gttcagggaa actgtgaaag atggaaagat cggaatagtt 660

ttcaacaatg gatatttcga acctgcgagt gaaaaagagg aggacatcag agcggcgaga 720

ttcatgcatc agttcaacaa ctatcctctc tttctcaatc cgatctacag aggagattat 780

ccggagctcg ttctggaatt tgccagagag tatctaccgg agaattacaa agatgacatg 840

tccgagatac aggaaaagat cgactttgtt ggattgaact attactccgg tcatttggtg 900

aagttcgatc cagatgcacc agctaaggtc tctttcgttg aaagggatct tccaaaaaca 960

gccatgggat gggagatcgt tccagaagga atctactgga tcctgaagaa ggtgaaagaa 1020

gaatacaacc caccagaggt ttacatcaca gagaatgggg ctgcttttga cgacgtagtt 1080

agtgaagatg gaagagttca cgatcaaaac agaatcgatt atttgaaggc ccacattggt 1140

caggcatgga aggccataca ggagggagtg ccgcttaaag gttacttcgt ctggtcgctc 1200

ctcgacaatt tcgaatgggc agagggatat tccaagagat ttggtattgt gtacgtggac 1260

tacagtactc aaaaacgcat cataaaagac agtggttact ggtactcgaa cgtggtcaaa 1320

agcaacagtc tggaagattg a 1341

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgccatatga acgtgaaaaa gttccc 26

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccgctcgaga tcttccagac tgttgctt 28

Claims

1.一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于将SEQ ID NO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌，以及其诱导表达条件和后续目的蛋白的纯化。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤如下：

1）、以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995基因组DNA为模板，用具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2）、将得到的DNA分子和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，连接得到含有β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒；

3）、将步骤2）得到的重组质粒转化表达宿主菌JM109(DE3)，不加IPTG于37℃下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni²⁺亲和层析柱纯化即得。

5.包含权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶的核苷酸片段的重组质粒。

6.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷Rd中的应用。

7.一种通过权利要求1所述β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rb1和Rb2制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于所述β-葡萄糖苷酶在pH 4-8，温度30℃-95℃，酶解人参皂苷Rb1和Rb2制备得到人参皂苷Rd。

8.根据权利要求7所述β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷Rb1和Rb2制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于pH为6.0，温度为90℃。