CN111893158A

CN111893158A - 一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

Info

Publication number: CN111893158A
Application number: CN202010817259.0A
Authority: CN
Inventors: 袁其朋; 程磊雨; 梁浩; 魏斌; 刘旭东; 石晔; 张军杰; 孙志强
Original assignee: Weihai Baihe Biotechnology Co ltd; Beijing University of Chemical Technology
Current assignee: Weihai Baihe Biotechnology Co ltd; Beijing University of Chemical Technology
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2040-08-14
Also published as: CN111893158B

Abstract

本发明涉及生物转化技术领域，具体涉及一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。本发明的方法是以黄芪甲苷为底物，利用木糖苷酶和葡萄糖苷酶双酶复合后，经过一步水解断裂底物C₃位置的木糖苷键和C₆位置的葡萄糖苷键得到环黄芪醇的方法。本发明得到的环黄芪醇的纯度能够达到98％以上，并且该方法操作简单，无污染，反应温度更温和，酶转化机理明确以及酶的底物适应性更宽，适合工业化生产。

Description

一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

技术领域

本发明涉及生物转化技术领域，尤其涉及一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。

背景技术

黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分，环黄芪醇(CA)为黄芪甲苷的苷元。环黄芪醇能够通过激活端粒酶来延长端粒，从而达到抵抗衰老，提高细胞增殖能力的效果。

环黄芪醇的化学式为C₃₀H₅₀O₅、相对分子质量为490.71，是一种无色针状结晶，易溶于甲醇、正丁醇等。天然植物中环黄芪醇的含量极少，因此环黄芪醇的生产主要是通过水解黄芪甲苷C₃位置的木糖苷键和C₆位置的葡萄糖苷键实现。

目前制备环黄芪醇的方法有多种，但是都存在一定的缺陷。如：化学法水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，由于环黄芪醇的三元环结构易在化学法的极端条件下开环，形成副产物黄芪醇，因此，即使通过氧化还原的方法避免了副产物的产生，但是操作步骤极其繁琐，且氧化剂和还原剂的使用增加了生产成本，无法实现规模生产；此方法制备环黄芪醇时还产生大量的废水，造成环境污染。水解酶复合的形式水解黄芪甲苷制备环黄芪醇，由于过程中涉及的酶的种类多，水解活性以及专一性差，酶作用机制也不明确。酶解法转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，由于酶的反应条件相差巨大，不能在同一体系中实现黄芪甲苷的转化，操作步骤繁琐，且分离纯化步骤较复杂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，解决了现有环黄芪醇制备方法中污染环境、步骤繁琐、能耗高、酶底物耐受性低、酶作用机理不明确、酶效率低，分离纯化效率低等不足。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，包括如下步骤：

(1)将木糖苷酶Xyl-G9和葡萄糖苷酶Bgcm混合得到复合酶；

(2)将黄芪甲苷和复合酶混合后调节pH，得到反应体系，进行转化反应，生成环黄芪醇。

作为优选，所述木糖苷酶Xyl-G9和葡萄糖苷酶Bgcm的质量比为1.5～2.5:0.5～1.5。

作为优选，所述木糖苷酶Xyl-G9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

作为优选，所述木糖苷酶Xyl-G9的制备方法为：

(1)将重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9进行培养，得到培养的重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9；

(2)诱导培养的重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9进行产酶发酵；

(3)离心取上清得到木糖苷酶Xyl-G9。

作为优选，所述葡萄糖苷酶Bgcm的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

作为优选，所述葡萄糖苷酶Bgcm的制备方法为：

(1)将重组大肠杆菌BL21-Bgcm进行培养，得到培养的重组大肠杆菌BL21-Bgcm；

(2)诱导培养的重组大肠杆菌BL21-Bgcm进行产酶发酵；

(3)离心取上清得到葡萄糖苷酶Bgcm。

作为优选，所述反应体系的pH值为5.5～7.5。

作为优选，所述转化反应的温度为40～55℃，时间为12～48h。

作为优选，所述反应体系中黄芪甲苷的质量浓度为10～120g/L。

作为优选，所述反应体系中复合酶的浓度为0.3～4.8g/L。

本发明提供了一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。本发明的制备方法具有以下优点：

1、木糖苷酶和葡萄糖苷酶的复合酶制剂的底物耐受性更高、底物转化率更高以及反应温度更温和，适合应用于工业化生产。

2、酶转化机理明确，木糖苷酶断裂水解木糖苷键，葡萄糖苷酶断裂水解葡萄糖苷键。

3、酶的底物适应性更宽，本发明中涉及到的葡萄糖苷酶不仅可以水解黄芪甲苷的葡萄糖苷键，而且还能水解6-O-葡萄糖-环黄芪醇上的葡萄糖键；木糖苷酶不仅可以水解3-O-木糖-环黄芪醇上的木糖苷键，也能水解黄芪甲苷上的木糖苷键，可以实现复合酶更高效利用。

4、本发明中分离纯化组合工艺简单，分离纯化效率更高，产品收率更高。

附图说明

图1为木糖苷酶Xyl-G9纯酶电泳图。

图2为木糖苷酶Xyl-G9转化黄芪甲苷以及3-O-木糖-环黄芪醇路径图。

图3为葡萄糖苷酶Bgcm纯酶电泳图。

图4为葡萄糖苷酶Bgcm转化黄芪甲苷以及6-O-葡萄糖-环黄芪醇路径图。

图5为环黄芪醇产品液相检测图谱。

图6为环黄芪醇产品色谱图。

图7为环黄芪醇产品图。

具体实施方式

(1)将木糖苷酶Xyl-G9和葡萄糖苷酶Bgcm混合得到复合酶；

在本发明中，所述木糖苷酶Xyl-G9和葡萄糖苷酶Bgcm的质量比为1.5～2.5:0.5～1.5，优选为2:1。

在本发明中，所述木糖苷酶Xyl-G9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明中，所述木糖苷酶Xyl-G9是用于黄芪甲苷以及3-O-木糖-环黄芪醇C₃位置木糖苷键的水解，底物适应性更宽，转化路径见图2。

在本发明中，所述木糖苷酶Xyl-G9的制备方法为：

(2)诱导培养的重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9进行产酶发酵；

(3)离心取上清得到木糖苷酶Xyl-G9。

在本发明中，所述培养重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9的培养基为BMMG培养基。

在本发明中，所述重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9的培养温度为29～31℃，优选为30℃。

在本发明中，所述重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9培养的转速为210～230r/min，优选为220r/min。

在本发明中，所述重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9培养时间为10～14h，优选为12h。

在本发明中，所述诱导表达重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9产酶发酵的诱导剂为甲醇。

在本发明中，所述诱导表达重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9产酶发酵的诱导剂的添加时机为每隔24h添加一次，每次添加量为发酵液体积的1vt％，产酶发酵5d。

本发明优选对离心后得到的木糖苷酶Xyl-G9进行纯化。

在本发明中，所述纯化木糖苷酶Xyl-G9的方法为镍柱纯化。

在本发明中，所述纯化木糖苷酶Xyl-G9的温度为43～47℃，优选为45℃。

在本发明中，所述纯化木糖苷酶Xyl-G9的pH为5.3～5.7，优选为5.5。

在本发明中，所述葡萄糖苷酶Bgcm的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明中，所述葡萄糖苷酶Bgcm是用于黄芪甲苷以及中间产物6-O-葡萄糖-环黄芪醇C₆位置葡萄糖苷的水解，而不仅只水解6-O-葡萄糖-环黄芪醇，底物适应性更宽，转化路径如图4。

在本发明中，所述葡萄糖苷酶Bgcm的制备方法为：

(2)诱导培养的重组大肠杆菌BL21-Bgcm进行产酶发酵；

(3)离心取上清得到葡萄糖苷酶Bgcm。

在本发明中，所述培养重组大肠杆菌BL21-Bgcm的培养基为LB培养基。

在本发明中，所述培养重组大肠杆菌BL21-Bgcm的培养温度为19～21℃，优选为20℃。

在本发明中，所述诱导表达重组大肠杆菌BL21-Bgcm进行产酶发酵的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IpTG。

在本发明中，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IpTG的添加量为体积分数的1‰。

在本发明中，所述诱导重组大肠杆菌BL21-Bgcm产酶的温度为15～25℃，优选为20℃。

在本发明中，所述诱导重组大肠杆菌BL21-Bgcm产酶的时间为12～36h，优选为24h。

本发明优选对离心后得到的葡萄糖苷酶Bgcm进行纯化。

在本发明中，所述纯化葡萄糖苷酶Bgcm的方法为镍柱纯化。

在本发明中，所述纯化葡萄糖苷酶Bgcm的温度为48～52℃，优选为50℃。

在本发明中，所述纯化葡萄糖苷酶Bgcm的pH为7.3～7.7，优选为7.5。

得到复合酶后，本发明将黄芪甲苷和复合酶混合后调节pH，得到反应体系，进行转化反应，生成环黄芪醇。

在本发明中，所述反应体系的pH值为5.5～7.5，优选为6～7，进一步优选为6.5。

在本发明中，所述反应体系的pH值采用盐酸或氢氧化钠进行调节。

在本发明中，所述转化反应的温度为40～55℃，优选为45～50℃，进一步优选为47.5℃。

在本发明中，所述转化反应的时间为12～48h，优选为18～42h，进一步优选为24～36h，再优选为30h。

在本发明中，所述反应体系中黄芪甲苷的质量浓度为10～120g/L，优选为30～100g/L，进一步优选为50～80g/L，再优选为65g/L。

在本发明中，所述反应体系中复合酶的浓度为0.3～4.8g/L，优选为1.2～3.9g/L，进一步优选为2.1～3.0g/L，再优选为2.55g/L。

在本发明中，所述环黄芪醇的分离纯化步骤为先使用大孔吸附树脂初步分离纯化，再用制备色谱进行环黄芪醇的精制。

在本发明中，所述环黄芪醇的分离纯化避免了饱和正丁醇萃取纯化过程中酶变性导致的溶液变粘和乳化现象，避免了重结晶法制备环黄芪醇的步骤繁琐问题。

在本发明中，所述大孔吸附树脂分离纯化的条件为1倍柱体积上样，10vt％的乙醇水溶液以2倍柱体积洗脱杂质，70vt％乙醇水溶液以3倍柱体积洗脱产品。

在本发明中，所述大孔吸附树脂的型号为Sp700。

在本发明中，所述色谱法纯化的条件为流动相为甲醇：水为65:35、流速为10mL/min。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1木糖苷酶Xyl-G9的制备

将整合有Xyl-G9基因SEQ ID NO.3的重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9，接入1L的BMMG培养基中，于30℃、220r/min条件下培养12h；然后将富集的菌体洗净接入5LBMMY培养基中于30℃、220r/min条件下培养，每隔24h添加1％体积分数的甲醇进行诱导产酶。培养5天后，将发酵液过滤去除菌体，将得到的发酵上清液进行镍柱纯化，得到100mL纯重组木糖苷酶Xyl-G9。经过电泳检测得到150KDa的产物。电泳结果见图1。

实施例2葡萄糖苷酶Bgcm的制备

将含有Bgcm基因的重组大肠杆菌BL21-Bgcm，接种至1L的LB培养基中，在20℃下，在含有1‰体积分数的IpTG中诱导发酵24h。发酵结束后6000r/min收集重组细胞，并使用200mL的20mM pH 6.0的磷酸缓冲液将细胞重悬，然后通过超声破碎并离心得到200mL葡萄糖苷酶Bgcm粗酶液，再通过镍柱纯化得到50mL的纯葡萄糖苷酶Bgcm。经过电泳检测得到78KDa的产物。电泳结果见图3。

实施例3复合酶的制备

将100mL纯重组木糖苷酶Xyl-G9和50mL的纯葡萄糖苷酶Bgcm分别进行冷冻干燥，得到252mg粉状重组木糖苷酶Xyl-G9和356mg粉状重组木糖苷酶Bgcm。然后取200mg上述粉状木糖苷酶Xyl-G9和100mg上述粉状葡萄糖苷酶Bgcm混合，制得300mg复合酶。

实施例4环黄芪醇的制备和纯化

向15mL试管中加入1g质量含量为10％的黄芪甲苷粉末以及10mL100mM的磷酸缓冲液。将底物和溶液充分混合后加入3mg复合酶制剂，调节pH至5.5，在搅拌转速为200r/min、45℃条件下充分反应48h。

酶解反应结束后将酶解液直接进行Sp700大孔吸附树脂纯化，纯化条件为：1倍柱体积上样，体积百分比浓度为10％的乙醇水溶液以2倍柱体积洗脱杂质，体积百分比浓度为70％的乙醇水溶液3倍柱体积洗脱产品，得到洗脱液30mL。将洗脱液经旋干后得到环黄芪醇粗制品58mg，液相检测计算纯度为62.5％。将粗制品溶于5mL甲醇，通过制备色谱进一步提高产品纯度，制备色谱条件为：流动相为甲醇：水为65:35、流速为10mL/min、进样量为5mL。收集含有环黄芪醇的馏分，经旋干后并称重，经计算得到98.6％纯度环黄芪醇52mg产品。环黄芪醇粗制品液相检测结果见图5；色谱纯化结果见图6；环黄芪醇产品见图7。

实施例5环黄芪醇的制备和纯化

向15mL三角瓶中加入1g质量含量为10％的黄芪甲苷粉末以及10mL100 mM的磷酸缓冲液。将底物和溶液充分混合后加入3mg复合酶制剂，调节pH至6.5，在搅拌转速为200r/min、45℃条件下充分反应12h。

按实施例4的纯化条件进行纯化。经大孔树脂吸附洗脱后，得到洗脱液30mL，环黄芪醇粗制品57mg，液相检测计算纯度为60.9％。将粗制品溶于5mL甲醇，经色谱条件纯化后，得到纯度98.1％的环黄芪醇53mg产品。

实施例6环黄芪醇的制备和纯化

向15mL三角瓶中加入1g质量含量为10％的黄芪甲苷粉末以及10mL100 mM的磷酸缓冲液。将底物和溶液充分混合后加入3mg复合酶制剂，调节pH至7.5，在搅拌转速为200r/min、45℃条件下充分反应40h。

酶解反应结束后，按实施例4的条件进行纯化环黄芪醇。经大孔树脂吸附洗脱后，得到洗脱液30mL，环黄芪醇粗制品58.4mg，液相检测计算纯度为58.9％。将粗制品溶于5mL甲醇，经色谱条件纯化后得到纯度98.5％的环黄芪醇54.2mg的产品。

实施例7环黄芪醇的制备和纯化

向15mL三角瓶中加入1g质量含量为10％的黄芪甲苷粉末以及10mL100 mM的磷酸缓冲液。将底物和溶液充分混合后加入3mg复合酶制剂，调节pH至6.5，在搅拌转速为200r/min、40℃条件下充分反应20h。

酶解反应结束后，按实施例4的纯化条件纯化环黄芪醇。经大孔树脂吸附洗脱后，得到洗脱液30mL，环黄芪醇粗制品58.1mg，液相检测计算纯度为60.7％。将粗制品溶于5mL甲醇，经过色谱条件纯化后，得到纯度为98.2％的环黄芪醇54.2mg产品。

实施例8环黄芪醇的制备和纯化

向15mL三角瓶中加入1g质量含量为10％的黄芪甲苷粉末以及10mL100 mM的磷酸缓冲液。将底物和溶液充分混合后加入3mg复合酶制剂，调节pH至6.5，在搅拌转速为200r/min、55℃条件下充分反应24h。

酶解反应结束后，按实施例4的纯化条件纯化环黄芪醇。经大孔树脂吸附洗脱后，得到洗脱液30mL，环黄芪醇粗制品58.1mg，液相检测计算纯度为60.7％。将粗制品溶于5mL甲醇，经过色谱条件纯化后，得到纯度为98.2％的环黄芪醇54.3mg产品。

实施例9环黄芪醇的制备和纯化

向15mL三角瓶中加入2g质量含量为40％的黄芪甲苷粉末以及10mL100 mM的磷酸缓冲液。将底物和溶液充分混合后加入36mg复合酶制剂，调节pH至6.5，在搅拌转速为200r/min、45℃条件下充分反应12h。

酶解反应结束后，按实施例4的纯化条件纯化环黄芪醇。经大孔树脂吸附洗脱后，得到洗脱液240mL，环黄芪醇粗制品456mg，液相检测计算纯度为60.4％。将粗制品溶于40mL甲醇，经过色谱条件纯化后，得到纯度为98％的环黄芪醇432.1mg产品。

实施例10环黄芪醇的制备和纯化

向15mL三角瓶中加入3g质量含量为40％的黄芪甲苷粉末以及10mL100 mM的磷酸缓冲液。将底物和溶液充分混合后加入48mg复合酶制剂，调节pH至6.5，在搅拌转速为200r/min、45℃条件下充分反应48h。

酶解反应结束后，实施例4的纯化条件纯化环黄芪醇。经大孔树脂吸附洗脱后，得到洗脱液360mL，环黄芪醇粗制品695.1mg，液相检测计算纯度为59.2％。将粗制品溶于60mL甲醇，经过色谱条件纯化后，得到纯度为98.2％的环黄芪醇648.4mg产品。

由以上实施例可知，本发明提供了一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。本发明中的木糖苷酶酶和葡萄糖苷酶催化效率高，分别水解断裂的是C₃位置的木糖苷键和C₆位置的葡萄糖苷键，酶转化机理明确。两种酶最适反应条件相近，可在同一体系中同时发挥作用，无需分步水解，操作简单易行。酶转化过程中底物的糖苷键断裂没有先后之分，只有水解断裂的糖苷键类型之别，提高了酶的转化效率，降低了酶成本，适合工业化生产。复合酶的反应温度低于55℃，反应温度温和，利于工业化生产。本发明中的复合酶为重组酶，可自制，相对于昂贵的商品化酶，酶的成本大大降低，可节省工业化生产成本。本发明中的环黄芪醇分离纯化组合避免了饱和正丁醇萃取过程中酶变性导致的溶液变粘和乳化现象，降低了后续分离纯化过程的难度，提高了环黄芪醇分离纯化的效率。因此，本发明的特点是利用双酶复合转化黄芪甲苷制备高纯度环黄芪醇的方法。解决了现有技术中制备环黄芪醇过程污染严重、副产物多、步骤繁琐、能耗高、酶底物耐受性低、酶作用机理不明确、酶效率低，分离纯化效率低等不足。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 威海百合生物技术股份有限公司

<120> 一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 884

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Lys Phe Leu Ser Trp Ser Val Leu Leu Gln Gly Val Ser Tyr

1 5 10 15

Thr Leu Ala Ala Pro Gln Gln Gly Lys Cys Leu Pro Ala Val Asn Val

20 25 30

Gly Tyr Ala Ala Asn Ile Thr Phe Val Gly Cys Tyr Thr Asp Asn Ser

35 40 45

Thr Arg Ile Leu Gln Gly Gly Ser Thr Val Pro Pro Asn Gly Asn Asp

50 55 60

Pro Gln Ser Cys Ala Asp Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ala

65 70 75 80

Gly Val Glu Tyr Gly Ser Gln Cys Tyr Cys Gly Ser Thr Ile Leu Ser

85 90 95

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100 105 110

Asn Ser Ser Glu Ile Cys Gly Gly Thr Trp Leu Val Asp Ile Tyr Gln

115 120 125

Ile Ser Asn Pro Ser Ser Thr Pro Val Pro Leu Ser Gly Ala Val Lys

130 135 140

Pro Asn Cys Thr Ala Asp Pro Leu Cys Ser Asn Pro Val Cys Asn Ala

145 150 155 160

Ala Leu Asp Pro Leu Thr Arg Ala Lys Gly Leu Val Asp Ala Leu Thr

165 170 175

Phe Asp Glu Lys Ile Gln Asn Thr Gln Asn Gly Ser Pro Gly Ser Ala

180 185 190

Arg Leu Gly Leu Pro Gly Tyr Gln Trp Trp Ser Glu Ala Leu His Gly

195 200 205

Val Ala Ser Ser Pro Gly Val Thr Phe Gln Thr Gly Asn Phe Ser Tyr

210 215 220

Ala Thr Ser Phe Pro Gln Pro Ile Leu Met Ser Ala Ala Phe Asp Asp

225 230 235 240

Ala Leu Ile Gln Gln Val Gly Thr Val Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala

245 250 255

Phe Ser Asn Tyr Gly Asn Ala Gly Leu Asp Phe Trp Thr Pro Asn Ile

260 265 270

Asn Pro Phe Arg Asp Pro Arg Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly

275 280 285

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290 295 300

Leu Gln Asn Gly Ile Gly Pro Thr Asn Pro Arg Val Val Ala Thr Cys

305 310 315 320

Lys His Phe Ala Gly Tyr Asp Ile Glu Asp Trp Glu Gly Asn Ala Arg

325 330 335

Tyr Gly Phe Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gln Asp Leu Ser Glu Tyr Tyr

340 345 350

Leu Pro Pro Phe Lys Ser Cys Ala Arg Asp Ala Lys Val Asp Ala Ile

355 360 365

Met Cys Ser Tyr Asn Ala Val Asn Gly Ile Pro Thr Cys Ala Asp Ser

370 375 380

Tyr Leu Leu Asp Thr Ile Leu Arg Asp His Trp Asn Trp Asn Gln Thr

385 390 395 400

Gly Arg Trp Val Thr Ser Asp Cys Asp Ala Ile Gly Asn Ile Phe Thr

405 410 415

Asp His His Tyr Thr Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu

420 425 430

Asn Ala Gly Thr Asn Leu Asp Cys Gly Thr Thr Met Ser Asn Asn Leu

435 440 445

Ala Ala Ala Ser Ala Gln Asp Leu Phe Gln Asn Ala Thr Leu Asp Thr

450 455 460

Ala Leu Thr Tyr Leu Tyr Ser Ser Leu Val Arg Leu Gly Trp Phe Asp

465 470 475 480

Glu Glu Thr Ser Pro Tyr Arg Ser Leu Asp Trp Ser Asp Val Gly Thr

485 490 495

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Leu Leu Lys Asn Asp Lys Thr Lys Val Leu Pro Leu Ser Ser His Arg

515 520 525

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530 535 540

Gln Gly Asn Tyr Ala Gly Val Ala Glu Tyr Ile Arg Thr Leu Val Trp

545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

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Glu Lys Val Asn Ala Ile Leu Trp Ala Gly Tyr Pro Ser Gln Ala Gly

660 665 670

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675 680 685

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705 710 715 720

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725 730 735

Tyr Thr Ser Phe Asp Val Ser Trp Ala Ser Lys Lys Leu Gly Pro Tyr

740 745 750

Asn Thr Ala Ser Leu Gly His Val Ser Lys Ser Gln Tyr Pro Asp Thr

755 760 765

Ala Ala Phe Asp Thr Phe His Ile Asp Val Lys Asn Thr Gly Lys Val

770 775 780

Thr Ser Asp Tyr Val Ala Leu Leu Phe Ala Ser Thr Lys Asn Ala Gly

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Pro Ala Pro Tyr Pro Ile Lys Thr Leu Val Gly Tyr Ala Arg Ala Pro

805 810 815

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820 825 830

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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1 5 10 15

Phe Arg Asp Leu Asp Gly Asp Gly Val Met Ala Pro Tyr Glu Asp Pro

20 25 30

Arg Leu Ser Pro Glu Glu Arg Thr Ala Asp Leu Val Gly Arg Leu Ser

35 40 45

Leu Ala Glu Lys Ala Gly Leu Met Phe Gln Thr Val Ile Glu Val Gly

50 55 60

Ala Asp Gly Glu Leu Lys Glu Glu Pro Gly Ala Ile Ser Lys Ser Gly

65 70 75 80

Thr Thr Glu Val Val Val Gly Lys Ala Met Asn His Phe Asn Val His

85 90 95

Glu Ile Arg Thr Ala Arg Gln Ala Ala Arg Trp Ser Asn Arg Leu Gln

100 105 110

Glu Leu Ala Glu Ser Thr Pro His Gly Ile Pro Val Thr Val Ser Thr

115 120 125

Asp Pro Arg His Ala Phe Val Glu Asn Ala Gly Val Ala Phe Ser Ala

130 135 140

Gly Pro Phe Ser Gln Trp Pro Glu Ala Leu Gly Leu Ala Ala Leu Asp

145 150 155 160

Asp Val Asp Ala Ile Arg Ala Phe Ala Asp Ala Ala Arg Gln Glu Tyr

165 170 175

Val Ala Val Gly Ile Arg Ala Ala Leu His Pro Gln Ile Asp Leu Ala

180 185 190

Thr Glu Pro Arg Trp Gly Arg Gln Ala Gln Thr Leu Gly His Asp Ala

195 200 205

Asp Arg Val Ala Glu Phe Thr Ala Ala Tyr Leu Gln Gly Phe Gln Gly

210 215 220

Asp Glu Leu Gly Ser Ala Ser Val Ala Cys Thr Thr Lys His Phe Pro

225 230 235 240

Gly Gly Gly Pro Gln Lys Asp Gly Glu Asp Ala His Phe Pro Tyr Gly

245 250 255

Arg Glu Gln Val Tyr Pro Gly Gly Met Phe Glu Tyr His Leu Arg Pro

260 265 270

Phe Arg Glu Ala Ile Glu Arg Gly Thr Ala Ala Met Met Pro Tyr Tyr

275 280 285

Gly Met Pro Glu Gly Leu Val Arg Asp Gly Glu Ala Ile Glu Pro Val

290 295 300

Gly Phe Gly Phe Asn Arg Gln Val Ile Thr Gly Leu Leu Arg Glu Glu

305 310 315 320

Leu Gly Tyr Asp Gly Val Val Val Thr Asp Trp Glu Leu Val Asn Asp

325 330 335

Asn His Val Gly Asp Gln Val Leu Pro Ala Arg Ala Trp Gly Val Glu

340 345 350

Glu Leu Thr Pro His Glu Arg Met Glu Arg Ile Ile Glu Ala Gly Cys

355 360 365

Asp Gln Phe Gly Gly Glu Glu Cys Val Asp Val Leu Leu Asp Leu Val

370 375 380

Ala Ser Gly Arg Val Ser Glu Ala Arg Ile Asp Glu Ser Val Arg Arg

385 390 395 400

Leu Leu Leu Val Lys Phe Arg Leu Gly Leu Phe Asp Asp Pro Tyr Val

405 410 415

Asp Glu Asp Ala Ala Glu Arg Ile Val Gly Arg Ala Asp Leu Arg Glu

420 425 430

Leu Gly Phe Arg Ala Gln Ala Ala Ser Val Thr Val Leu Glu Asn Arg

435 440 445

Glu Arg Asp Gly Arg Pro Thr Leu Pro Leu Pro Val Asp Gly Pro Arg

450 455 460

Leu Arg Val His Val Glu Gly Met Arg Pro Glu Ala Leu Asp Gly Trp

465 470 475 480

Ala Asp Pro Ala Ala Gly Pro Asp Asp Ala Asp Leu Ala Ile Val Arg

485 490 495

Leu Gly Ala Pro Phe Glu Pro Arg Ser Asp Leu Phe Leu Glu Ala Trp

500 505 510

Phe His Gln Gly Ser Leu Glu Phe Pro Pro Gly Leu Val His Arg Leu

515 520 525

Arg Arg Ile Ala Asp Arg Cys Pro Leu Val Val Val Val Asn Leu Asp

530 535 540

Arg Pro Ala Ile Met Thr Pro Leu Val Pro Phe Ala Ala Ala Leu Ala

545 550 555 560

Val Asp Tyr Gly Ser Ser Asp Ala Ala Val Leu Ala Ala Leu Thr Gly

565 570 575

Arg Ile Ala Pro Glu Gly Arg Leu Pro Val Glu Ile Pro Arg Ser Met

580 585 590

Asp Ala Val Arg Ala Ser Arg Thr Asp Val Pro Ser Asp Thr Glu Asp

595 600 605

Pro Val Tyr Pro Leu His His Gly Leu Arg Ile Arg Met Pro Arg Ser

610 615 620

Pro Arg Thr Leu Leu Thr Ala Pro Asp Gly Thr Arg Phe Arg Asp Leu

625 630 635 640

Asp Gly Asp Gly Val Met Ala Pro Tyr Glu Asp Pro Arg Leu Ser Pro

645 650 655

Glu Glu Arg Thr Ala Asp Leu Val Gly Arg Leu Ser Leu Ala Glu Lys

660 665 670

Ala Gly Leu Met Phe Gln Thr Val Ile Glu Val Gly Ala Asp Gly Glu

675 680 685

Leu Lys Glu Glu Pro Gly Ala Ile Ser Lys Ser Gly Thr Thr Glu Val

690 695 700

Val Val Gly Lys Ala Met Asn His Phe Asn Val His Glu Ile Arg Thr

705 710 715 720

Ala Arg Gln Ala Ala Arg Trp Ser Asn Arg Leu Gln Glu Leu Ala Glu

725 730 735

Ser Thr Pro His Gly Ile Pro Val Thr Val Ser Thr Asp Pro Arg His

740 745 750

Ala Phe Val Glu Asn Ala Gly Val Ala Phe Ser Ala Gly Pro Phe Ser

755 760 765

Gln Trp Pro Glu Ala Leu Gly Leu Ala Ala Leu Asp Asp Val Asp Ala

770 775 780

Ile Arg Ala Phe Ala Asp Ala Ala Arg Gln Glu Tyr Val Ala Val Gly

785 790 795 800

Ile Arg Ala Ala Leu His Pro Gln Ile Asp Leu Ala Thr Glu Pro Arg

805 810 815

Trp Gly Arg Gln Ala Gln Thr Leu Gly His Asp Ala Asp Arg Val Ala

820 825 830

Glu Phe Thr Ala Ala Tyr Leu Gln Gly Phe Gln Gly Asp Glu Leu Gly

835 840 845

Ser Ala Ser Val Ala Cys Thr Thr Lys His Phe Pro Gly Gly Gly Pro

850 855 860

Gln Lys Asp Gly Glu Asp Ala His Phe Pro Tyr Gly Arg Glu Gln Val

865 870 875 880

Tyr Pro Gly Gly Met Phe Glu Tyr His Leu Arg Pro Phe Arg Glu Ala

885 890 895

Ile Glu Arg Gly Thr Ala Ala Met Met Pro Tyr Tyr Gly Met Pro Glu

900 905 910

Gly Leu Val Arg Asp Gly Glu Ala Ile Glu Pro Val Gly Phe Gly Phe

915 920 925

Asn Arg Gln Val Ile Thr Gly Leu Leu Arg Glu Glu Leu Gly Tyr Asp

930 935 940

Gly Val Val Val Thr Asp Trp Glu Leu Val Asn Asp Asn His Val Gly

945 950 955 960

Asp Gln Val Leu Pro Ala Arg Ala Trp Gly Val Glu Glu Leu Thr Pro

965 970 975

His Glu Arg Met Glu Arg Ile Ile Glu Ala Gly Cys Asp Gln Phe Gly

980 985 990

Gly Glu Glu Cys Val Asp Val Leu Leu Asp Leu Val Ala Ser Gly Arg

995 1000 1005

Val Ser Glu Ala Arg Ile Asp Glu Ser Val Arg Arg Leu Leu Leu Val

1010 1015 1020

Lys Phe Arg Leu Gly Leu Phe Asp Asp Pro Tyr Val Asp Glu Asp Ala

1025 1030 1035 1040

Ala Glu Arg Ile Val Gly Arg Ala Asp Leu Arg Glu Leu Gly Phe Arg

1045 1050 1055

Ala Gln Ala Ala Ser Val Thr Val Leu Glu Asn Arg Glu Arg Asp Gly

1060 1065 1070

Arg Pro Thr Leu Pro Leu Pro Val Asp Gly Pro Arg Leu Arg Val His

1075 1080 1085

Val Glu Gly Met Arg Pro Glu Ala Leu Asp Gly Trp Ala Asp Pro Ala

1090 1095 1100

Ala Gly Pro Asp Asp Ala Asp Leu Ala Ile Val Arg Leu Gly Ala Pro

1105 1110 1115 1120

Phe Glu Pro Arg Ser Asp Leu Phe Leu Glu Ala Trp Phe His Gln Gly

1125 1130 1135

Ser Leu Glu Phe Pro Pro Gly Leu Val His Arg Leu Arg Arg Ile Ala

1140 1145 1150

Asp Arg Cys Pro Leu Val Val Val Val Asn Leu Asp Arg Pro Ala Ile

1155 1160 1165

Met Thr Pro Leu Val Pro Phe Ala Ala Ala Leu Ala Val Asp Tyr Gly

1170 1175 1180

Ser Ser Asp Ala Ala Val Leu Ala Ala Leu Thr Gly Arg Ile Ala Pro

1185 1190 1195 1200

Glu Gly Arg Leu Pro Val Glu Ile Pro Arg Ser Met Asp Ala Val Arg

1205 1210 1215

Ala Ser Arg Thr Asp Val Pro Ser Asp Thr Glu Asp Pro Val Tyr Pro

1220 1225 1230

Leu His His Gly Leu Arg Ile Arg

1235 1240

<210> 3

<211> 2652

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtctaaat ttttgtcttg gtctgttttg ttgcaaggtg tttcttatac tttggctgcc 60

ccacaacaag gtaaatgttt gcctgctgtt aacgttggat acgctgctaa cattactttt 120

gttggttgtt acactgacaa ctccactcgt attttgcaag gtggttccac tgttccacca 180

aacggtaacg acccacaatc ttgtgctgac tcctgtggtg cttctggttt cacctacgcc 240

ggtgttgagt acggttccca atgttactgt ggttctacca ttctgtcagg tgctcagcaa 300

caagccgatt ctgcttgtac catgacttgt tccggtaatt cttctgagat ttgtggtggt 360

acttggttgg ttgatatcta ccagatctct aacccttctt ctactccagt tccattgtct 420

ggtgctgtta agcctaattg tactgctgat cctttgtgtt ctaaccccgt ttgtaacgct 480

gcactggatc cattgactag agctaaggga ttagttgacg ctttgacttt tgacgaaaag 540

attcaaaaca cccagaacgg aagtcctggt tccgctcgtt tgggtttgcc aggttatcag 600

tggtggtctg aagctttgca cggagttgct tcttctccag gtgttacttt ccaaaccggt 660

aacttttcct acgctacttc tttcccacaa ccaattctta tgtccgctgc ttttgatgat 720

gctctgattc aacaagttgg tactgttgtt tcaattgaag gtagagcttt ctccaactac 780

ggtaacgccg gactggattt ttggactcct aacattaacc ctttccgtga tcctagatgg 840

ggtagaggtc aagaaactcc tggtgaggac cctttccaca ttgctcgtta cgtttacaat 900

ctggttgatg gtctgcaaaa cggtatcggt cctactaacc ctagagttgt tgctacctgt 960

aagcactttg ctggttacga cattgaggat tgggaaggta acgctagata cggttttaac 1020

gctattattt caactcaaga tttgtccgag tactacctgc ctccttttaa atcttgtgct 1080

agagacgcta aggttgacgc tattatgtgt tcttataatg ctgttaacgg tattcctacc 1140

tgtgctgact cctacttgtt ggacaccatt ttgagagatc attggaactg gaaccaaacc 1200

ggtagatggg tgacctctga ttgtgacgct attggtaata tcttcactga tcaccactac 1260

acttccactg ctgctgctgc tgccgcagat gctttgaatg ccggtaccaa cttggactgt 1320

ggtaccacca tgtctaacaa tcttgctgct gcttctgccc aggatctgtt ccaaaacgcc 1380

actctagaca ccgccttgac ttatttgtac tcgtctttgg ttcgtttggg ttggtttgac 1440

gaagaaacct ctccataccg atctttggat tggtctgacg tcggtactcc agcttcccag 1500

caactggcca tcagagccgc tgttgaaggt atcgttttgt tgaagaacga caaaactaag 1560

gttttgcctt tgtcatctca ccgtcaaacc atcgctctta ttggaccata cgctaacgct 1620

accactcaat tgcaaggtaa ctacgctggt gtcgctgaat acatcagaac tttggtttgg 1680

ggtgctgagc aagctggtta taacgttgaa tatgctttgg gtactgatat taattcaact 1740

gatacttctg gtttctctgc cgctgtcgca gctgctaacg cttctgatat catcatctac 1800

gctggtggta ttgataactc aatcgaggca gaggctatgg acagagatac tatctcttgg 1860

ccaggtaatc aattgcaatt ggttgatgaa ctttctcaag tcggtaaacc tttaattgtt 1920

cttcaattcg gaggtggaca acttgatgac tctgccttgt tggaaaatga gaaggttaac 1980

gctattcttt gggctggtta cccatcccaa gctggtggtc aagccgtttt tgatatcttg 2040

actggtaaat ccgctcctgc tggtagactg cctattaccc aataccctgc taactacacc 2100

aacgaaatcc caatgactga catggctttg agaccaaatg gtactaaccc aggtagaacc 2160

tatagatggt acgatgatgc tgtgattcct ttcggttacg gtttgcatta cactagtttc 2220

gacgtttctt gggcttccaa gaagttgggt ccatacaaca ccgcctcact gggtcacgtt 2280

tctaagtctc aataccctga taccgctgcc tttgacactt ttcatatcga cgtcaagaac 2340

actggtaaag ttactagtga ttacgtcgct ctgctgttcg cttctactaa gaacgctggt 2400

ccagcccctt accctatcaa gaccttggtc ggttatgcta gagccccatc aatcaagcca 2460

ggtgaaacta gatccgtctc cttggatgtt actttgggtg ctattgctag aactgctgaa 2520

aacggtgacc tggtcttgta cccaggaact tacaccttgg aggttgacgt cggtcaacac 2580

tacccaactg ctgagttcca ggtcaacggt cctgataagg tcttggattc tttcccacaa 2640

cctccatctt ct 2652

<210> 4

<211> 1860

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcctcgta gccctcgtac tctgctgacc gcacctgatg gtacgcgttt ccgtgatctg 60

gacggtgacg gtgtgatggc accttacgaa gacccgcgcc tgagcccaga agaacgtacc 120

gctgacctgg tcggtcgtct gagcctggct gaaaaggcag gtctgatgtt ccagaccgtc 180

atcgaggtcg gtgctgacgg tgagctgaaa gaggagccgg gtgcaatcag caaaagcggc 240

acgaccgagg tcgtggtcgg taaagcgatg aaccacttca acgtccacga gattcgcacc 300

gcgcgtcagg cggctcgttg gagcaaccgt ctgcaagaac tggcggagtc cacccctcac 360

ggtatcccag tcaccgtgtc cacggaccca cgtcatgcat tcgtggagaa cgcgggtgtg 420

gcattctccg caggtccatt ctcccagtgg ccagaagctc tgggcctggc agctctggat 480

gatgttgatg caatccgtgc cttcgcagac gcagcacgtc aggagtacgt ggcagtgggt 540

atccgtgctg cactgcaccc acagatcgac ctggctactg agccgcgttg gggtcgtcaa 600

gctcagaccc tgggtcatga tgcagatcgt gttgctgaat ttaccgccgc ttacctgcaa 660

ggtttccagg gtgatgaact gggttccgcc tctgtggcgt gcaccaccaa acacttcccg 720

ggtggcggcc cgcagaaaga cggtgaagac gcgcactttc cgtacggtcg tgaacaggtg 780

tacccgggcg gtatgttcga ataccacctg cgtccgttcc gtgaagcgat cgaacgtggc 840

accgcggcta tgatgccgta ctatggcatg ccggaaggcc tggtgcgcga tggtgaagcc 900

atcgaaccgg tgggtttcgg ctttaaccgt caggtgatca ctggcctgct gcgtgaagag 960

ctgggctatg acggcgtggt agtgaccgac tgggaactgg taaacgacaa ccacgttggt 1020

gaccaggtac tgccggcccg cgcgtggggt gtagaagaac tgactccgca cgaacgtatg 1080

gagcgtatca tcgaagccgg ctgcgaccag ttcggcggcg aggaatgtgt tgacgttctg 1140

ctggacctgg tagcgtctgg ccgcgtttct gaagcgcgta tcgacgaatc cgttcgtcgt 1200

ctgctgctgg ttaaattccg cctgggtctg ttcgacgacc cgtacgttga cgaagatgcg 1260

gcggaacgta ttgttggccg tgctgatctg cgcgaactgg gcttccgcgc tcaggctgct 1320

tctgtaacgg ttctggaaaa tcgtgaacgt gacggccgcc cgactctgcc gctgccggta 1380

gacggcccac gcctgcgcgt tcatgttgaa ggtatgcgtc cggaagcact ggacggctgg 1440

gccgatccgg ccgctggtcc ggatgatgcg gatctggcta ttgttcgcct gggcgcaccg 1500

tttgaaccgc gctctgacct gtttctggaa gcgtggttcc atcagggctc tctggaattt 1560

ccgccgggcc tggttcaccg cctgcgtcgt attgcggatc gttgtccgct ggtagttgta 1620

gttaatctgg atcgcccggc gattatgacc ccgctggttc cgtttgccgc cgctctggcg 1680

gtagattatg gtagctctga tgccgccgtt ctggcggcgc tgactggccg tattgctccg 1740

gaaggtcgcc tgccggttga aatcccgcgc tccatggatg cggttcgcgc gtctcgtact 1800

gacgttccgt ctgatactga agatccggta tatccgctgc accatggcct gcgcattcgc 1860

Claims

1.一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将木糖苷酶Xyl-G9和葡萄糖苷酶Bgcm混合得到复合酶；

2.根据权利要求1所述的一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，所述木糖苷酶Xyl-G9和葡萄糖苷酶Bgcm的质量比为1.5～2.5:0.5～1.5。

3.根据权利要求1或2所述的一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，所述木糖苷酶Xyl-G9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。

4.根据权利要求3所述的一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，所述木糖苷酶Xyl-G9的制备方法为：

(2)诱导培养的重组毕赤酵母GS115-Xyl-G9进行产酶发酵；

(3)离心取上清得到木糖苷酶Xyl-G9。

5.根据权利要求1或2所述的一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，所述葡萄糖苷酶Bgcm的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。

6.根据权利要求5所述的一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，所述葡萄糖苷酶Bgcm的制备方法为：

(2)诱导培养的重组大肠杆菌BL21-Bgcm进行产酶发酵；

(3)离心取上清得到葡萄糖苷酶Bgcm。

7.根据权利要求1所述的一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，所述反应体系的pH值为5.5～7.5。

8.根据权利要求1或7所述的一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，所述转化反应的温度为40～55℃，时间为12～48h。

9.根据权利要求8所述的一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，所述反应体系中黄芪甲苷的质量浓度为10～120g/L。

10.根据权利要求9所述的一种利用双酶复合转化黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法，其特征在于，所述反应体系中复合酶的浓度为0.3～4.8g/L。