CN114107255B

CN114107255B - 一种竹节参皂苷糖苷水解酶及其在生产姜状三七皂苷r1中的应用

Info

Publication number: CN114107255B
Application number: CN202111383009.1A
Authority: CN
Inventors: 王如锋; 杨小林; 王峥涛
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2023-08-25
Anticipated expiration: 2041-11-22
Also published as: CN114107255A

Abstract

本发明公开了竹节参皂苷糖苷水解酶及其在生产姜状三七皂苷R1中的应用。所述的糖苷水解酶为具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。本发明的实验证明，本发明的竹节参皂苷糖苷水解酶具有高效转化人参皂苷Ro生成姜状三七皂苷R1的作用。本发明的实验同时证明，本发明的竹节参皂苷糖苷水解酶还具有高效转化竹节参皂苷IVa生成金盏花苷E的作用和高效转化竹节参皂苷IV生产龙牙楤木皂苷VI的作用，以及高效转化伪人参皂苷RT1生成对应的C‑28脱葡萄糖基产物的作用。

Description

一种竹节参皂苷糖苷水解酶及其在生产姜状三七皂苷R1中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种糖苷水解酶及其在生产姜状三七皂苷R1中的应用。

背景技术

五加科人参属植物(如人参Panax ginseng、三七Panax notoginseng、竹节参Panax japonicus等)具有极高的医药价值和悠久的临床应用历史。现代化学与药理学研究表明，三萜皂苷类化合物是人参属药用植物的主要化学成分之一(统称为“人参皂苷”)，其具有十分显著的药理活性和潜在的新药开发价值，如预防或治疗心脑血管、高血脂等方面的疾病(Chem.Rev.2012，112：3329-3355；J.Pharm.Pharmacol.2006，58：1007-1019)。

按照皂苷元分类，人参皂苷可主要分为达玛烷型皂苷和齐墩果烷型皂苷。该类成分的化学多样性主要是由于皂苷元母核上的糖基修饰存在各种各样的差异，如苷元所连糖基的位置、个数或种类不同。不同的化学成分在药用植物中含量千差万别，有些成分在药材中含量低，严重限制了这些稀有成分的获取，从而进一步阻碍了相关药理活性的评价与新药开发。作为稀有人参皂苷类成分之一的姜状三七皂苷R1，主要分布于、人参、竹节参、姜状三七等药用植物中，其结构式如下所示。姜状三七皂苷R1是竹节参皂苷V(又称“人参皂苷Ro”)的C28位上葡萄糖脱落后形成的齐墩果酸型皂苷。鉴于该化合物的分离制备困难，一定程度上导致了与其相关的药理活性研究相对空白。

姜状三七皂苷ZR1结构式

现已有通过碱处理人参皂苷Ro获得姜状三七皂苷R1的研究报道，但酸碱等化学方法修饰人参皂苷具有一定的局限性。在糖苷水解的同时，往往会伴随着苷元发生脱水、环合、双键位移和构型变化，不易直接得到目标产物。生物酶催化剂用于化学成分的特定结构修饰，具有催化效率高、反应条件温和、易于廉价制备等优点，并符合从末端治理向源头控制转化的新型“低碳环保”生产模式(Bioresource Technol，2012，115：237-243；Curr OpinChem Biol，2008，19(6)：597-605)。由于生物催化剂具有显著的底物特异性，故尽管均属于同一类酶，但其可催化的底物和所形成的产物则千差万别。甚至有时虽然具有糖苷水解活性，但一旦底物发生改变，糖苷水解酶有可能出现失活或者水解不同位置、不同个数糖苷键的现象。因此，这不能仅仅单纯依靠化合物结构相似或酶的序列相近的推论就可以断定不同的酶具有相似或相同的作用，而是需要经过大量的实验筛选和验证，才可能最终获得目标的生物催化剂。故通过实验研究，获得显著的结构部位专一和高转化效率的生物催化剂至关重要。目前，尚未见本发明所涉及的蛋白相关功能的实验验证与报道，更未见任何利用该酶以人参皂苷Ro为底物，通过生物酶催化剂转化制备姜状三七皂苷R1的相关报道。

发明内容

针对背景技术所提出的技术问题，本发明的目的在于提供一种竹节参皂苷糖苷水解酶及其应用，尤其是在生产姜状三七皂苷R1中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种蛋白质PlGH03，是如下(1)～(4)中任意一项所示的蛋白质：

(1)具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质；

(2)在如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

(3)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

(4)与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

编码上述蛋白质的基因同样在本发明保护的范围之内。作为一种优选技术方案，该基因是如下(1)～(3)中任意一项所述的DNA分子：

(1)具有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的DNA分子；

(2)与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列互补的DNA分子；

(3)与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

含有上述基因的重组载体、表达盒、野生菌株、转基因细胞系或转基因重组菌同属本发明的保护范围。

作为一种优选技术方案，上述的重组载体是将上述的基因通过分子克隆构建插入到表达载体中，得到的表达上述蛋白的重组表达载体。在一个优选例中，具体为将如SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列插入到大肠杆菌载体pET-28a(+)的BamHI和HindIII识别位点间，得到的表达所述蛋白的重组表达载体。

上述的蛋白质作为糖苷水解酶，上述的基因或上述的重组载体、表达盒、野生菌株、转基因细胞系或转基因工程菌在以下(1)～(5)中至少一种的应用：

(1)转化人参皂苷Ro生产姜状三七皂苷R1；

(2)转化竹节参皂苷IVa生产金盏花苷E；

(3)转化伪人参皂苷RT1生产对应的C-28位脱葡萄糖基产物；

(4)转化竹节参皂苷IV生产对应的龙牙楤木皂苷VI；

(5)转化竹节参总皂苷提取物生产对应的C-28位脱葡萄糖基产物。

一种生产糖苷水解酶的方法，对上述的转基因重组菌进行发酵培养获得糖苷水解酶。

一种高效生物转化生产特定目的皂苷的方法，以上述的蛋白质作为糖苷水解酶或以上述的转基因重组菌进行发酵获得的发酵产物作为糖苷水解酶进行以下(1)～(5)中至少一种的反应：

(1)转化人参皂苷Ro生产姜状三七皂苷R1；

(2)转化竹节参皂苷IVa生产金盏花苷E；

(3)转化伪人参皂苷RT1生产对应的C-28位脱葡萄糖基产物；

(4)转化竹节参皂苷IV生产龙牙楤木皂苷VI；

优选的，上述反应条件为：在温度为10-70℃和pH 4.0-11.0缓冲液中进行。

以上述的转基因重组菌进行发酵获得的发酵产物作为糖苷水解酶进行反应的过程，具体包括如下步骤：

(1)发酵所述的转基因重组菌，培养、收集发酵液、离心收集菌体、破碎菌体后离心收集上清液或冷冻干燥上清液，分离纯化蛋白；

(2)将所述上清液或上清液冻干粉或纯化蛋白与人参皂苷Ro或含有人参皂苷Ro的粗提物在缓冲液中反应，经萃取或分离纯化得到姜状三七皂苷R1。

(3)将所述上清液或上清液冻干粉或纯化蛋白与竹节参皂苷IVa或含有竹节参皂苷IVa粗提物在缓冲液中反应，经萃取或分离纯化得到金盏花苷E。

(4)将所述上清液或上清液冻干粉或纯化蛋白与伪人参皂苷RT1或含有伪人参皂苷RT1的粗提物在缓冲液中反应，经萃取或分离纯化得到伪人参皂苷RT1的C-28位脱葡萄糖基产物。

(5)将所述上清液或上清液冻干粉或纯化蛋白与竹节参皂苷IV或含有竹节参皂苷IV的粗提物在缓冲液中反应，经萃取或分离纯化得到龙牙楤木皂苷VI。

(6)将所述上清液或上清液冻干粉或纯化蛋白与竹节参总皂苷提取物或含有竹节参总皂苷的粗提物在缓冲液中反应，经萃取或分离纯化得到对应的C-28位脱葡萄糖基产物。

所述的发酵为在IPTG诱导下进行或不诱导直接发酵。

所述反应的条件为：在温度为10-70℃和pH 4.0-11.0缓冲液中进行。

本发明的实验证明，本发明的竹节参皂苷糖苷水解酶具有高效转化人参皂苷Ro生成姜状三七皂苷R1的作用。

本发明的实验同时证明，本发明的竹节参皂苷糖苷水解酶还具有高效转化竹节参皂苷IVa生成金盏花苷E的作用和高效转化竹节参皂苷IV生成龙牙楤木皂苷VI以及高效转化伪人参皂苷RT1生成对应的C-28脱葡萄糖基产物的作用。

附图说明

图1为人参皂苷Ro水解产物(姜状三七皂苷R1)的高分辨质谱图。

图2为竹节参皂苷IV水解产物(龙牙楤木皂苷VI)的高分辨质谱图。

图3为竹节参皂苷IVa水解产物(金盏花苷E)的高分辨质谱图。

图4为伪人参皂苷RT1水解产物(C-28位脱葡萄糖基产物)的高分辨质谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

预实验1、竹节参皂苷糖苷水解酶及其编码基因的获得和表达

提取若干种野生细菌的基因组，设计并合成相应引物，以各自基因组DNA为模板，对目的基因进行基因克隆、载体构建、蛋白表达，表1仅列举了除本发明报道外的若干种菌中的5种菌的名称和相关引物。

经大量的预实验可知，从筛选的若干种菌中，仅只从乳酸类芽孢杆菌Paenibacillus lactis(可市场购买获得)的基因组中成功的获得了具有催化人参皂苷Ro专一生成姜状三七皂苷R1的酶及其编码基因。这表明，从Paenibacillus lactis的基因组中获得皂苷水解酶及其编码基因并不是显而易见的，本领域技术人员并不是简简单单地便可从众多预测的具有糖苷水解酶功能的基因序列中获得能够蛋白表达好且具有催化人参皂苷Ro专一生成姜状三七皂苷R1的酶。因此，本发明选择了Paenibacillus lactis的基因组DNA为模版来获得目标蛋白酶。

表1基因组来源及引物设计

实施例1、竹节参皂苷糖苷水解酶及其编码基因的克隆

以提取Paenibacillus lactis的基因组DNA为模版，以5′-CGCGGATCCATGAGAAACCATACTTTAGATACG-3′(Forward)和5′-CCCAAGCTT TCAGCTTCTACGGTATCTCTTC-3′(Reverse)为引物进行聚合酶链式反应PCR扩增。

PCR体系为：2×Taq Mixture 12.5μL，上下游引物(10μm)各0.5μL，基因组0.5μL和ddH₂O 11.5μL。

PCR条件为：先95℃预变性3min，然后95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，割胶并用试剂盒回收目的条带。

用限制性内切酶BamHI和HindIII分别将回收产物与pET-28a(+)载体进行双酶切(37℃，6h)；用试剂盒纯化回收酶切产物，并用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单克隆，PCR验证阳性，获得重组菌。

提取重组菌的质粒测序验证，该PCR产物的基因命名为Pl3，其核苷酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1，该序列与Paenibacillus lactis的基因组中预测的具有糖苷酶功能的基因序列一致，证明克隆正确，该基因编码的蛋白命名为PlGH03，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO.2。将含有该PCR产物的质粒命名为pET-28a(+)-Pl3，该质粒为将序列表中的SEQ ID NO.1插入pET-28a(+)载体的BamHI和HindIII双酶切位点间得到的载体。

实施例2、重组PlGH03的表达与纯化

将上述获得的BL21(DE3)/pET-28a(+)-Pl3的单菌落接种于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃培养12h，取1mL菌液加入到100mL新鲜的LB液体培养基中(含终浓度为50μg/mL的卡那霉素)，37℃培养至OD₆₀₀达到0.4时，再在培养基中加入IPTG(终浓度为0.2mM)，16℃继续诱导培养24h。收集发酵液，8000rpm离心5min收集菌体。用50mL生理盐水洗涤2次，离心收集菌体。

用10mL A液(10mM的pH7.4的磷酸钠盐缓冲液，含20mM咪唑，500mM NaCl)重悬菌体。在冰水浴中，用超声波破碎机破碎细菌细胞(400W，工作4s暂停6s，工作99次)，4℃下12000rpm离心40min，2次离心，上清液即为粗酶液。

将镍柱装于蛋白纯化仪AKTA上，用A液以5mL/min流速冲洗10个柱体积；尽量保持相同流速(约4mL/min)用1mL注射器将粗酶蛋白注入镍柱，用4倍柱体积的A液冲洗镍柱以除去未结合蛋白。

以A液为初始液并不断增加B液(10mM的pH7.4磷酸钠盐缓冲液，含500mM咪唑，500mM NaCl)体积，总体积为100mL(此时洗脱液全部为B液)，收集相应洗脱液(5mL/管)，继续用20mL B液进行洗脱以除去未洗脱完全的蛋白。

洗脱液经蛋白电泳分析后合并目的蛋白，置于30kD的超滤管中，4℃下2800rpm离心若干分钟，待蛋白溶液剩余约2mL时，加入20mL C液(10％甘油(w/v，g/100ml)的pH 7.0的20mM磷酸钠盐缓冲液)继续超滤，重复2次，于-80℃迅速冻存。

实施例3、重组酶PlGH03的最适温度

取一定量的重组酶PlGH03和终浓度为2mM的对硝基苯-β-D-葡萄糖苷，加入pH8.050mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液至体积为0.5mL，于25-55℃水浴反应5min后，再加入0.5mL 1mM的Na₂CO₃溶液终止反应，测定405nm处的吸光值，以最高活力为100％，相对活力结果如表2所示，该酶在50℃时具有最高的反应活性。

表2重组酶PlGH03的最适温度

实施例4、重组酶PlGH03的热稳定性

在不同温度下，将终浓度为0.2mg/mL的蛋白在30℃、40℃和50℃的pH 8.0的50mM磷酸钠盐缓冲液中保温，不同时间点取样。

取一定量保温后的重组PlGH03酶和终浓度为2mM的对硝基苯-β-D-葡萄糖苷，加入pH 8.0 50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液至体积为0.5mL，37℃水浴反应5min后，再加入0.5mL 1mM的Na₂CO₃溶液终止反应，测定405nm处的吸光值，测定残余活力，将相对残余活力数值取对数后与时间进行拟合，并计算失活速率常数(k_D)和半衰期(t1/2)。结果表明，终浓度为0.2mg/mL重组PlGH03蛋白在30℃、40℃和50℃下的半衰期分别为163.85h、79.88h和6.04h。

实施例5、重组酶PlGH03的最适pH

取一定量的重组PlGH03酶和终浓度为2mM的对硝基苯-β-D-葡萄糖苷，分别加入50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0-5.0)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(6.0-8.0)、甘氨酸-氢氧化钠溶液(pH 9.0-10.0)、碳酸氢钠-氢氧化钠(pH 10.0-11.0)至体积为0.5mL；37℃水浴反应5min后，加入0.5mL 1mM的Na₂CO₃溶液终止反应，测定405nm处的吸光值，最适pH结果如表3所示，该酶在pH 7-10之间都有较好的催化活力，pH 8.0时反应活力最高，而在pH5和pH 11时活力明显下降。

表3重组酶PlGH03的最适pH

实施例6、重组酶PlGH03的pH稳定性

取一定体积的终浓度为0.2mg/mL的重组酶PlGH03和终浓度为2mM的对硝基苯-β-D-葡萄糖苷，分别加入50mM的醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0-5.0)、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(6.0-8.0)、甘氨酸-氢氧化钠溶液(pH 9.0-10.0)、碳酸氢钠-氢氧化钠(pH 10.0-11.0)至体积为0.5mL，在4℃下保温24h。

取一定量保温后的重组酶PlGH03和终浓度为2mM的对硝基苯-β-D-葡萄糖苷，加入pH 8.0 50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液至体积为0.5mL，37℃水浴反应5min后，加入0.5mL 1mM的Na₂CO₃溶液终止反应，测定405nm处的吸光值，该酶的pH稳定性如表4所示，其在pH 5-11之间较稳定，pH 7时最稳定性。

表4重组酶PlGH03的pH稳定性

pH	相对残余活力(％)
		4.0	58.9±1.9
5.0	79.3±2.9
		6.0	82.1±3.3
7.0	100.0±2.6
		8.0	88.3±1.4
9.0	85.0±2.4
		10.0	78.7±2.5
11.0	76.2±3.5

实施例7、重组酶PlGH03在转化人参皂苷Ro生成姜状三七皂苷R1中的应用

在0.2mL pH 8.0的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入终浓度为0.2mg/mL纯化后的重组酶PlGH03和终浓度为4mM的人参皂苷Ro，37℃反应12h时间后，以等体积正丁醇终止反应并萃取，萃取2次，取正丁醇层，氮吹挥干，以500μl液相乙腈溶解，高速离心30min，取上清约0.2mL作为液相分析供试品。

采用高效液相色谱进行样品分析。超高效液相色谱检测条件为：ZORBAX SB-C18(4.6×250mm 5μm)，进样体积为10μl，流动相为(A)乙腈和(B)0.05％磷酸，柱温为30℃，流速为1.0mL/min。

洗脱条件以A所含体积为依据，0～20min 23％～40％；20～30min 40％～75％；30～32min 75％～90％；32～45min 90％。

液相色谱仪分析结果表明(如图1所示)，人参皂苷Ro保留时间为18.872min，姜状三七皂苷R1保留时间为27.218min。1h时重组酶PlGH03已将人参皂苷Ro完全转化为姜状三七皂苷R1。

实施例8、重组酶PlGH03在转化竹节参皂苷IVa生成金盏花苷E中的应用

在0.2mL pH 8.0的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入终浓度为0.2mg/mL纯化后的重组酶PlGH03和终浓度为4mM的竹节参皂苷IVa，37℃反应12h时间后，以等体积正丁醇终止反应并萃取，萃取2次，取正丁醇层，氮吹挥干，以500μl液相乙腈溶解，高速离心30min，取上清约0.2mL作为液相分析供试品。

液相色谱仪分析结果表明(如图3所示)，人参皂苷Ro保留时间为22.437min，金盏花苷E保留时间为30.392min。1h后重组酶PlGH03已将竹节参皂苷IVa完全转化为金盏花苷E。

实施例9、重组酶PlGH03在伪人参皂苷RT1生成伪人参皂苷RT1的C-28位脱葡萄糖基产物中的应用

在0.2mL pH 8.0的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入终浓度为0.2mg/mL纯化后的重组酶PlGH03和终浓度为4mM的伪人参皂苷RT1，37℃反应12h时间后，以等体积正丁醇终止反应并萃取，萃取2次，取正丁醇层，氮吹挥干，以500μl液相乙腈溶解，高速离心30min，取上清约0.2mL作为液相分析供试品。

液相色谱仪分析结果表明(如图4所示)，伪人参皂苷RT1保留时间为20.381min，伪人参皂苷RT1 C-28位脱葡萄糖基产物的保留时间为28.300min。1h时重组酶PlGH03已将伪人参皂苷RT1完全转化为伪人参皂苷RT1的C-28位脱葡萄糖基产物。

实施例10、重组酶PlGH03在转化竹节参皂苷IV生成龙牙楤木皂苷VI中的应用

在0.2mL pH 8.0的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入终浓度为0.2mg/mL纯化后的重组酶PlGH03和终浓度为4mM的竹节参皂苷IV，37℃反应12h时间后，以等体积正丁醇终止反应并萃取，萃取2次，取正丁醇层，氮吹挥干，以500μl液相乙腈溶解，高速离心30min，取上清约0.2mL作为液相分析供试品。

液相色谱仪分析结果表明(如图2所示)，竹节参皂苷IV保留时间为20.881min，竹节参皂苷IV C-28位脱葡萄糖基产物的保留时间为29.022min。1h时重组酶PlGH03已将竹节参皂苷IV完全转化为龙牙楤木皂苷VI。

实施例11、重组酶PlGH03在转化竹节参总皂苷提取物中的应用

在0.2mL pH 8.0的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，加入10mg PlGH03冻干酶粉和终浓度为5mg/mL的竹节参总皂苷60％甲醇提取物，37℃反应12h时间后，以等体积正丁醇终止反应并萃取，萃取2次，取正丁醇层，氮吹挥干，以500μl液相乙腈溶解，高速离心30min，取上清约0.2mL作为液相分析供试品。

液相色谱仪分析结果表明，人参皂苷Ro、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷IVa均已转化为其对应的C-28位脱葡萄糖基产物。

序列表

<110> 上海中医药大学

<120> 一种竹节参皂苷糖苷水解酶及其在生产姜状三七皂苷R1中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2280

<212> DNA

<213> 乳酸类芽孢杆菌(Paenibacillus lactis)

<400> 1

atgagaaacc atactttaga tacgattaat aagacagaag aaaccgttcg atatgtacaa 60

aatcccggcg gccccacgct gggctacagc gaggaatcgg gcgtgggcat catcgagcag 120

gacggcttgt tcttcaagga tttaagccgt gacggcaagc tggacaacta tgaggactgg 180

cggctgacgc cggaggagcg ggcgaaagac ctggcctcga aaatgacggt cgagcagatt 240

gccggcctga tgctgtacag ccgccatcag tcgattcccg cgctcagtag cggctggttt 300

gcaggcacgt acggcgggaa gacgtatgag gagagcggag cgaagccctg ggaactgacc 360

gatgagcaga tcgcattttt gaccaaagac catgtgcggc acgtgcttgt aaccacggtg 420

gaaagcccgg aggtcgcggc gcgctggaac aataaaatcc aggcgtttgc cgaaggcacc 480

ggtctcggga ttccggcgaa caacagctcc gatccccggc acgcttcgga ttcaagctcc 540

gaattcaacg cgggtgcggg cggccatatc tccatgtggc ccgagacgct gggcctagcg 600

gcgaccttcg atccggagat cacgaagaag ttcgggatga tcgcttcccg ggaatatcgc 660

gcgttagggc tggcaaccgc cctgtctccg caaatcgata tcgccacgga gccgcgctgg 720

ttccggttta acggcacgtt cggcgaagat tcgaagctcg ccgccgatat ggcccgcgct 780

tatgtcgacg gcttccagac ttccgaaggc gaacgggaaa tcgccgacgg ttggggttac 840

gacagcgtga atgcgatggt gaagcattgg ccgggaggag gctcgggcga ggccggaagg 900

gacgcccatt acagctgcgg gaagtatgcg gtgtatccgg gcaacaactt tgacgagcat 960

ttggtacctt ttactgaagg ggcattcaag ctggacggca aaacagggaa ggcgtcagcc 1020

gtcatgccgt attacacgat ctccctcggc caggacaccg taaacggcga aaatgtcggc 1080

aactcctata actcgtacct gattcgggat ttgctgcgcg ggaaatacgg gtatgacggc 1140

gtcgtatgca cggactggat gatcacggcc gacgtctccg gtcccaagga ttcttttctg 1200

agcggaaaac catggggcgt ggaggatttg accgtgggcg agcgccacta caagctgcaa 1260

atggctggcg ttgaccaatt cggcggcaat aatgagatcg agccggtgct ggaggcttac 1320

aagatcgggg ttcgcgagca cggtgaagcc tatatgcggg aacgcttcga gcaatcggcc 1380

gtccggctgc tgaaaaatat gttccgcctc ggcttgtttg agaatccgta cctcgaccca 1440

caggagagtg ccacactggt cgggaacccc gaatttatgc gggaaggtta cgaagcacag 1500

cttaaatcga tcgtcatgct caaaaacaaa aacggggtgc tcccgcttcg cgcgaaaagc 1560

aaggtttaca tcccgaaacg ttttcttccg ccgggaaaag actggttcgg caatccgacg 1620

ccggagagct atgattatcc ggtcaacctg gaggttgtct cgaaatattt cgaagtcacc 1680

gaccaaccgg acgaagcgga attcggcctt gtctttatca catcaccgaa gtccggcacc 1740

ggctacagcc aagaggacga ggagcggggc gggaacggtt atgtgccgat cagcctgcag 1800

tacaagccgt atacggcgga gcatgcacgg gaaatcagcc tggccggcga cgaacacggg 1860

aatgagccgc gaaatcgttc ttataaagga aaaaccgtca ttccgcataa tacgacggat 1920

ttaaacatgg tgctggagac gaaggagaaa atgaaaggca aacccgtcat cgtctccatg 1980

ctgttgtgca accccacggt cgtttcggaa tttgaagcgg aagtggacgc cattctggcg 2040

aacttcggcg ttcaggatca ggcgatgatg gaggtattga cgggagcagc ggagccgtcc 2100

ggtctgctgc cgatgcaaat gcccgcccat atgcgcaccg tcgaagagca gttggaagat 2160

gtcgcgcacg atatggaatg ccatgtcgat tcggagaagc atgtatatga ctttgctttc 2220

gggatgaact ggggcggcgt gatcgaggat gagcgaacga agagataccg tagaagctga 2280

<210> 2

<211> 759

<212> PRT

<213> 乳酸类芽孢杆菌(Paenibacillus lactis)

<400> 2

Met Arg Asn His Thr Leu Asp Thr Ile Asn Lys Thr Glu Glu Thr Val

1 5 10 15

Arg Tyr Val Gln Asn Pro Gly Gly Pro Thr Leu Gly Tyr Ser Glu Glu

20 25 30

Ser Gly Val Gly Ile Ile Glu Gln Asp Gly Leu Phe Phe Lys Asp Leu

35 40 45

Ser Arg Asp Gly Lys Leu Asp Asn Tyr Glu Asp Trp Arg Leu Thr Pro

50 55 60

Glu Glu Arg Ala Lys Asp Leu Ala Ser Lys Met Thr Val Glu Gln Ile

65 70 75 80

Ala Gly Leu Met Leu Tyr Ser Arg His Gln Ser Ile Pro Ala Leu Ser

85 90 95

Ser Gly Trp Phe Ala Gly Thr Tyr Gly Gly Lys Thr Tyr Glu Glu Ser

100 105 110

Gly Ala Lys Pro Trp Glu Leu Thr Asp Glu Gln Ile Ala Phe Leu Thr

115 120 125

Lys Asp His Val Arg His Val Leu Val Thr Thr Val Glu Ser Pro Glu

130 135 140

Val Ala Ala Arg Trp Asn Asn Lys Ile Gln Ala Phe Ala Glu Gly Thr

145 150 155 160

Gly Leu Gly Ile Pro Ala Asn Asn Ser Ser Asp Pro Arg His Ala Ser

165 170 175

Asp Ser Ser Ser Glu Phe Asn Ala Gly Ala Gly Gly His Ile Ser Met

180 185 190

Trp Pro Glu Thr Leu Gly Leu Ala Ala Thr Phe Asp Pro Glu Ile Thr

195 200 205

Lys Lys Phe Gly Met Ile Ala Ser Arg Glu Tyr Arg Ala Leu Gly Leu

210 215 220

Ala Thr Ala Leu Ser Pro Gln Ile Asp Ile Ala Thr Glu Pro Arg Trp

225 230 235 240

Phe Arg Phe Asn Gly Thr Phe Gly Glu Asp Ser Lys Leu Ala Ala Asp

245 250 255

Met Ala Arg Ala Tyr Val Asp Gly Phe Gln Thr Ser Glu Gly Glu Arg

260 265 270

Glu Ile Ala Asp Gly Trp Gly Tyr Asp Ser Val Asn Ala Met Val Lys

275 280 285

His Trp Pro Gly Gly Gly Ser Gly Glu Ala Gly Arg Asp Ala His Tyr

290 295 300

Ser Cys Gly Lys Tyr Ala Val Tyr Pro Gly Asn Asn Phe Asp Glu His

305 310 315 320

Leu Val Pro Phe Thr Glu Gly Ala Phe Lys Leu Asp Gly Lys Thr Gly

325 330 335

Lys Ala Ser Ala Val Met Pro Tyr Tyr Thr Ile Ser Leu Gly Gln Asp

340 345 350

Thr Val Asn Gly Glu Asn Val Gly Asn Ser Tyr Asn Ser Tyr Leu Ile

355 360 365

Arg Asp Leu Leu Arg Gly Lys Tyr Gly Tyr Asp Gly Val Val Cys Thr

370 375 380

Asp Trp Met Ile Thr Ala Asp Val Ser Gly Pro Lys Asp Ser Phe Leu

385 390 395 400

Ser Gly Lys Pro Trp Gly Val Glu Asp Leu Thr Val Gly Glu Arg His

405 410 415

Tyr Lys Leu Gln Met Ala Gly Val Asp Gln Phe Gly Gly Asn Asn Glu

420 425 430

Ile Glu Pro Val Leu Glu Ala Tyr Lys Ile Gly Val Arg Glu His Gly

435 440 445

Glu Ala Tyr Met Arg Glu Arg Phe Glu Gln Ser Ala Val Arg Leu Leu

450 455 460

Lys Asn Met Phe Arg Leu Gly Leu Phe Glu Asn Pro Tyr Leu Asp Pro

465 470 475 480

Gln Glu Ser Ala Thr Leu Val Gly Asn Pro Glu Phe Met Arg Glu Gly

485 490 495

Tyr Glu Ala Gln Leu Lys Ser Ile Val Met Leu Lys Asn Lys Asn Gly

500 505 510

Val Leu Pro Leu Arg Ala Lys Ser Lys Val Tyr Ile Pro Lys Arg Phe

515 520 525

Leu Pro Pro Gly Lys Asp Trp Phe Gly Asn Pro Thr Pro Glu Ser Tyr

530 535 540

Asp Tyr Pro Val Asn Leu Glu Val Val Ser Lys Tyr Phe Glu Val Thr

545 550 555 560

Asp Gln Pro Asp Glu Ala Glu Phe Gly Leu Val Phe Ile Thr Ser Pro

565 570 575

Lys Ser Gly Thr Gly Tyr Ser Gln Glu Asp Glu Glu Arg Gly Gly Asn

580 585 590

Gly Tyr Val Pro Ile Ser Leu Gln Tyr Lys Pro Tyr Thr Ala Glu His

595 600 605

Ala Arg Glu Ile Ser Leu Ala Gly Asp Glu His Gly Asn Glu Pro Arg

610 615 620

Asn Arg Ser Tyr Lys Gly Lys Thr Val Ile Pro His Asn Thr Thr Asp

625 630 635 640

Leu Asn Met Val Leu Glu Thr Lys Glu Lys Met Lys Gly Lys Pro Val

645 650 655

Ile Val Ser Met Leu Leu Cys Asn Pro Thr Val Val Ser Glu Phe Glu

660 665 670

Ala Glu Val Asp Ala Ile Leu Ala Asn Phe Gly Val Gln Asp Gln Ala

675 680 685

Met Met Glu Val Leu Thr Gly Ala Ala Glu Pro Ser Gly Leu Leu Pro

690 695 700

Met Gln Met Pro Ala His Met Arg Thr Val Glu Glu Gln Leu Glu Asp

705 710 715 720

Val Ala His Asp Met Glu Cys His Val Asp Ser Glu Lys His Val Tyr

725 730 735

Asp Phe Ala Phe Gly Met Asn Trp Gly Gly Val Ile Glu Asp Glu Arg

740 745 750

Thr Lys Arg Tyr Arg Arg Ser

755

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcca tgagaaacca tactttagat acg 33

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagcttt cagcttctac ggtatctctt c 31

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccggaattca cagataaaca ccccaggct 29

<210> 6

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaagcttt tatttccttt tgaactccga tat 33

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccggaattca tggcatttcc caaagatctt gc 32

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cccaagcttt cacccctgcc gatgcg 26

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcggatcca tggaaaggat cgatgaaatt c 31

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cccaagcttt catggtttga atctcttctc tc 32

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgcggatccc cggctaccgc tgccac 26

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccaagcttt cagtcttcca gtgcagtgaa gg 32

Claims

1.一种蛋白质作为糖苷水解酶在以下(1)～(5)中至少一种的应用：

(1)转化人参皂苷Ro生产姜状三七皂苷R1；

(2)转化竹节参皂苷IVa生产金盏花苷E；

(3)转化伪人参皂苷RT1生产对应的C-28位脱葡萄糖基产物；

(4)转化竹节参皂苷IV生产龙牙楤木皂苷VI；

(5)转化竹节参总皂苷提取物生产对应的C-28位脱葡萄糖基产物，所述的竹节参总皂苷提取物含有人参皂苷Ro、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷Iva；

所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种生物转化生产特定目的皂苷的方法，其特征在于：以氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质作为糖苷水解酶进行以下(1)～(5)中至少一种的反应：

(1)转化人参皂苷Ro生产姜状三七皂苷R1；

(2)转化竹节参皂苷IVa生产金盏花苷E；

(3)转化伪人参皂苷RT1生产对应的C-28位脱葡萄糖基产物；

(4)转化竹节参皂苷IV生产龙牙楤木皂苷VI；

(5)转化竹节参总皂苷生产对应的C-28位脱葡萄糖基产物，所述的竹节参总皂苷含有人参皂苷Ro、伪人参皂苷RT1、竹节参皂苷IV和竹节参皂苷Iva。