CN109371080A

CN109371080A - 一种酶法制备单糖基甘草次酸半乳糖苷衍生物的方法

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Publication number: CN109371080A
Application number: CN201811196680.3A
Authority: CN
Inventors: 冯旭东; 李春; 郜雅楠; 张良; 刘潇斐; 郭芳
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2018-10-15
Filing date: 2018-10-15
Publication date: 2019-02-22
Anticipated expiration: 2038-10-15
Also published as: CN109371080B

Abstract

本发明克隆了来自植物大豆的糖基转移酶基因GmSGT2，并在大肠杆菌中异源表达糖基转移酶GmSGT2。在pH 7.5、温度35℃条件下，以尿苷二磷酸半乳糖为糖基供体，GmSGT2可以转移1分子半乳糖到3‑O‑葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)和3‑O‑葡萄糖基甘草次酸(GLMG)，高效合成Gal‑GAMG和Gal‑GLMG。进一步克隆来自植物大豆的蔗糖合酶基因GmSusy和来自大肠杆菌的UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶基因GalE，并在大肠杆菌中异源表达蔗糖合酶GmSusy和UDP‑葡萄糖‑4‑差向异构酶GalE。以GmSGT2偶联GmSusy和GalE构建含有UDP循环的多酶体系，在pH 7.0、温度40℃条件下，以尿苷二磷酸及蔗糖为底物，可以转移1分子半乳糖到GAMG和GLMG，实现高效、低成本合成Gal‑GAMG和Gal‑GLMG。

Description

一种酶法制备单糖基甘草次酸半乳糖苷衍生物的方法

技术领域：

本发明涉及一种合成2-O-半乳糖基-3-O-葡萄糖醛酸基甘草次酸(Gal-GAMG)和2-O-半乳糖基-3-O-葡萄糖基甘草次酸(Gal-GLMG)的方法，属于生物工程与技术领域。

背景技术：

甘草次酸是来源于甘草的五环三萜化合物，主要来源于植物甘草的根茎。甘草次酸因具抗炎抗菌、抗肿瘤、抗病毒等诸多药理作用被广泛应用于医药行业，此外，甘草次酸能够作为药物靶向载体将药物运送到肝细胞膜等某些特定部位，甘草次酸与肝细胞结合还能够抑制肝脏细胞的坏死和凋亡。虽然甘草次酸具有众多良好的生理和药理活性，但长期服用也会对人体产生如假性醛固酮增多症、低钾血症以及高血压等副作用，表现为钠潴留、钾排泄量增加，引起水肿、高血压、四肢瘫痪和低血钾症等一系列症状。此外，甘草次酸在水溶液中的溶解性较差，且在高浓度时对正常细胞存在一定的毒性。因此，以甘草次酸为前体开发低毒性、高药效的甘草次酸衍生物类药物受到广泛关注。

糖基化修饰作为天然产物改性的重要手段被广泛应用，例如，经半乳糖基修饰的半乳糖苷衍生物的水溶性、药物靶向性和抗肿瘤、抗病毒等药理活性都优于母体化合物。目前利用糖基转移酶合成的甘草次酸糖苷衍生物多为单糖基修饰且修饰的糖基类型比较单一，如3-O-单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)和3-O-单葡萄糖基甘草次酸(GLMG)等，实现二糖及以上甘草次酸糖基化修饰的糖基转移酶十分少见，限制了甘草次酸糖苷衍生物的多样性。

现有的对甘草次酸的糖基化修饰多为化学法，先对甘草次酸和糖基先进行基团保护修饰，再通过有机合成方法合成含有糖配基的甘草次酸糖基衍生物。整个反应过程条件苛刻，步骤繁琐，耗时耗能且效率低下，并且使用和产生大量有毒有害试剂，造成环境污染。酶法合成甘草次酸糖苷衍生物有效克服了利用传统化学法合成的缺点，酶法催化效率高，反应条件温和及环境友好等特点，且酶法催化的定向性好，能够直接将糖基供体中的糖基连接至甘草次酸及其糖苷衍生物分子上，后期容易对产物进行分离。

此外，糖基转移酶多以昂贵且不易获得的尿苷二磷酸-糖(UDP-糖)为底物，这阻碍了糖基转移酶和甘草次酸糖苷衍生物的拓展及应用。目前合成UDP-糖的方法多为化学法，化学法工艺复杂，条件苛刻，效率低下，环境不友好且难以合成UDP-半乳糖等多种UDP-糖基供体，而酶法以其定向性好，反应条件温和，环境友好和产物多样等优点避免了传统化学法带来的问题。利用差向异构酶偶联蔗糖合酶以廉价的蔗糖为底物能够高效合成多种UDP-糖，进一步偶联蔗糖合酶构建UDP循环系统不仅能够大大降低甘草次酸糖苷衍生物的合成成本，同时能够有效移除反应过程中UDP的积累对糖基转移酶催化作用的抑制，从而显著提高催化反应效率。

目前通过酶法合成半乳糖基甘草次酸糖苷衍生物的糖基转移酶还未见发掘，利用UDP循环高效合成甘草次酸糖苷衍生物的方法还未见报道。

发明内容：

第一方面，本发明提供了一种转半乳糖基合成Gal-GAMG及Gal-GLMG的糖基转移酶及其编码的基因，该基因是来源于大豆Glycine max的糖基转移酶基因GmSGT2，该基因编码的糖基转移酶为GmSGT2蛋白。所述蛋白的基因序列为SEQ ID NO:1，氨基酸序列为SEQ IDNO:2。

第二方面，本发明提供了一种酶法催化合成Gal-GAMG及Gal-GLMG的方法，包括以下步骤：

1、构建糖基转移酶基因工程菌生产糖基转移酶GmSGT2；

2、在实际实施过程中，上述1步骤包含如下具体工艺：A构建生产糖基转移酶GmSGT2的基因工程菌；B利用基因工程菌生产糖基转移酶GmSGT2。

所述A构建生产糖基转移酶基因工程菌,可采用任何现有已知的表达载体和其相应表达宿主菌，按照常规的转化步骤或商品宿主菌的使用说明进行操作，构建含有所述的糖基转移酶体基因工程菌。本发明的一些实施例优选采用大肠杆菌作为表达宿主。包括以下步骤：

(1)从种植21天的大豆的cDNA中克隆得到糖基转移酶基因GmSGT2；该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1；

(2)将(1)克隆得到的糖基转移酶基因与大肠杆菌表达质粒pET28a相连接，获得重组质粒。

(3)用(2)重组质粒pET28a转化入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞。

(5)筛选得到大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-GmSGT2。

所述B发酵基因工程菌生产糖基转移酶GmSGT2，包括以下步骤：将大肠杆菌基因工程菌于37℃进行发酵，发酵结束后，将于16℃诱导20h后的大肠杆菌基因工程菌破碎收集上清液，即为含有糖基转移酶的粗酶液。

在实际实施过程中，上述2步骤包含如下具体工艺：在反应容器中分别添加3-O-葡萄糖醛酸基甘草次酸或3-O-葡萄糖基甘草次酸和尿苷二磷酸葡萄糖，加入发酵所得含有糖基转移酶的粗酶液进行反应。

所述反应在pH 5.5～9、25～55℃下反应2h。

所述反应产物通过HPLC检测。

第三方面，本发明提供了一种糖基转移酶偶联UDP循环再生系统多酶偶联催化合成Gal-GAMG及Gal-GLMG的方法，包括以下步骤：

1、构建糖基转移酶基因工程菌生产糖基转移酶GmSGT2、蔗糖合酶GmSusy、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE；

2、在实际实施过程中，上述1步骤包含如下具体工艺：A构建生产糖基转移酶GmSGT2、蔗糖合酶GmSusy、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE的基因工程菌；B利用基因工程菌生产糖基转移酶GmSGT2、蔗糖合酶GmSusy、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE。

(1)从种植21天的大豆的cDNA中克隆得到糖基转移酶基因GmSGT2和GmSusy；上述两个基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.3；从过夜培养的大肠杆菌中克隆得到UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因GalE；该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5。蔗糖合酶GmSusy和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE的氨基酸序列分别如SEQ ID No.4和SEQ ID No.6所示。

(2)将(1)克隆得到的糖基转移酶、蔗糖合酶和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的基因分别与大肠杆菌表达质粒pET28a相连接，获得重组质粒。

(5)筛选得到大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-GmSGT2、E.coli BL21(DE3)/pET28a-GmSusy、E.coli BL21(DE3)/pET28a-GalE。

所述B发酵基因工程菌生产糖基转移酶GmSGT2、蔗糖合酶GmSusy、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE，包括以下步骤：将大肠杆菌基因工程菌于37℃进行发酵，发酵结束后，将于16℃诱导20h后的大肠杆菌基因工程菌破碎收集上清液，即为含有上述三种酶的粗酶液。

在实际实施过程中，上述2步骤包含如下具体工艺：在反应容器中分别添加3-O-葡萄糖醛酸基甘草次酸或3-O-葡萄糖基甘草次酸和尿苷二磷酸，加入发酵所得含有糖基转移酶GmSGT2、蔗糖合酶GmSusy、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE的粗酶液进行反应。

所述反应在pH 5.5～9、30～60℃下反应2h。

所述反应产物通过高效液相色谱(HPLC)检测。

采用本发明具有催化效率高，成本较为低廉，反应条件温和，高效，绿色安全等优点。

附图说明:

图1本发明实施例4中糖基转移酶催化产生Gal-GAMG和Gal-GLMG的高效液相色谱图。

图2本发明实施例4中产物Gal-GAMG和Gal-GLMG的分子式。

图3本发明实施例6中糖基转移酶催化产生Gal-GAMG和Gal-GLMG的质谱图。

图4本发明实施例6中糖基转移酶催化产生Gal-GLMG的NaOH水解反应产物的高效液相色谱图。

图5本发明实施例7中糖基转移酶在25～55℃的相对活性。

图6本发明实施例8中糖基转移酶在pH 5.5～9.0的相对活性。

图7本发明实施例9中糖基转移酶偶联UDP循环再生系统催化合成Gal-GAMG和Gal-GLMG的高效液相色谱图。

图8本发明实施例10中糖基转移酶偶联UDP循环再生系统在pH 5.5～9.0的相对活性。

图9本发明实施例11中糖基转移酶偶联UDP循环再生系统在25～55℃的相对活性。

具体实施方式：

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实验例1：糖基转移酶、蔗糖合酶、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因的获得

A：糖基转移酶GmSGT2基因的获得

根据糖基转移酶GmSGT2的基因(GenBank：AB473730.1)序列，设计引物：

GmSGT2-F：5’>ATGGAGAAGAAGAAGGGTGAGCTAA<3’；

GmSGT2-R：5’>TTAAGGATTGGGTGCGGTCTCTTGA<3’；

以自贡冬豆的cDNA为模版，使用ExTaq酶进行PCR扩增，得到1488bp片段的GmSGT2基因，如SEQ ID No.1所示，克隆至pMD19-T载体，测序确定糖基转移酶基因的完整序列。SEQID No.1所示片段表达的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

B：蔗糖合酶GmSusy基因的获得

设计引物：

GmSusy-F：5’>ATGGCCACCGATCGTTTGACCCGGGTT<3’；

GmSusy-R：5’>TTACTCAGCAGCAAGGGGCACAGACT<3’；

以自贡冬豆的cDNA为模版，使用ExTaq酶进行PCR扩增，得到2415bp片段的GmSusy基因，如SEQ ID No.3所示，克隆至pMD19-T载体，测序确定糖基转移酶基因的完整序列。SEQID No.3所示片段表达的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

C：UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE基因的获得

设计引物：

GalE-F：5’>ATGAGAGTTCTGGTCACTGGTGGTA<3’；

GalE-R：5’>TTAATCGGGATATCCCTGTGGATGG<3’；

以大肠杆菌过夜培养的菌液为模版，使用ExTaq酶进行PCR扩增，得到1017bp片段的GalE基因，如SEQ ID No.5所示，克隆至pMD19-T载体，测序确定糖基转移酶基因的完整序列。SEQ ID No.5所示片段表达的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

实施例2：分别构建含有糖基转移酶、蔗糖合酶和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的大肠杆菌工程菌

构建含有糖基转移酶GmSGT2基因的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-GmSGT2，以糖基转移酶GmSGT2的基因片段(SEQ ID No.1所示)为模板，设计上下游引物并加入酶切位点BamHI、NotI和保护碱基：

Gm2-BamHI-F：5’>CGCGGATCCATGGAGAAGAAGAAGGGTGAGCTAA<3’；带有BamHI的酶切位点。

Gm2-NotI-R：5’>ATAAGAATGCGGCCGCTTAAGGATTGGGTGCGGTCTCTTGA<3’；带有NotI的酶切位点。

PCR反应体系为：模板1μL,上下游引物各2μL，25μL Primer star mix(宝生物公司)，用双蒸水补足50μL。PCR反应条件：98℃预变性1min，98℃变性10s、58℃退火5s、72℃延伸90s，循环30次，72℃10min，4℃保存。

将克隆得到的GmSGT2基因进行胶回收。分别用限制性内切酶BamHI和NotI进行双酶切，酶切体系：2μL BamHI，2μL NotI，5μL 10x digest buffer，DNA片段30μL，用双蒸水补足50μL的酶切体系,酶切条件为37℃、2h。酶切后回收酶切产物。

将酶切回收后的GmSGT2片段和载体pET28a用T₄DNA连接酶进行连接，连接体系7μLGmSGT2，载体1μL pET28a，1μL 10x ligase buffer，1μL T4DNA ligase。反应条件为16℃过夜连接。将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有100mg/L卡那霉素的固体LB培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，20g/L琼脂糖)平板上，37℃培养。

采用菌落PCR和测序方法鉴定转化子。菌落PCR体系：模板LB平板单菌落，T₇通用上下游引物各1μL，10μL 2x Taq mix(宝生物公司)，用双蒸水补足20μL。PCR条件：94℃预变性5min，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸90s，循环30次，72℃10min，4℃保存。经菌落PCR验证含有目标条带的转化子送DNA测序，确定大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-GmSGT2构建成功。

用同样的方法分别构建含有蔗糖合酶基因GmSusy和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因GalE的大肠杆菌工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-GmSusy和E.coli BL21(DE3)/pET28a-GalE。

所用引物为：

GmSusy-BamHI-F：5’>CGCGGATCCATGGCCACCGATCGTTTGACCCGGGTT<3’；带有BamHI的酶切位点。

GmSusy-NotI-R：5’>ATAAGAATGCGGCCGCTTACTCAGCAGCAAGGGGCACAGACT<3’；带有NotI的酶切位点。

GalE-BamHI-F：5’>CGCGGATCCATGAGAGTTCTGGTCACTGGTGGTA<3’；带有BamHI的酶切位点。

GalE-NotI-R：5’>ATAAGAATGCGGCCGCTTAATCGGGATATCCCTGTGGATGG<3’；带有NotI的酶切位点。

实施例3：大肠杆菌基因工程菌的发酵

(1)挑取鉴定正确的大肠杆菌工程菌接种于含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠)中过夜培养，培养条件37℃，170rpm。

(2)取过夜培养的菌液4ml接种于400ml含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中培养3-5h至OD600＝0.6，培养条件37℃，170rpm。

(3)加入诱导剂IPTG，使其终浓度为0.5mM/L,继续培养，培养条件变为16℃，170rpm，20h。

(4)将获得的发酵液于室温，12000rpm离心5min后，收集菌体。

(5)用20ml PBS(50mM，pH 7.0)缓冲液重悬菌体，用低温高压破碎机裂解菌体。

(6)将裂解的菌体在4℃，12000rpm离心10min，弃沉淀，收集上清，获得含有糖基转移酶GmSGT2的混合液。

用同样的方法分别发酵含有蔗糖合酶基因GmSusy和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶基因GalE的大肠杆菌工程菌获得含有蔗糖合酶和UDP-葡萄糖-4-差向异构酶的混合液。

实施例4：糖基转移酶催化合成Gal-GAMG和Gal-GLMG

将大肠杆菌工程菌获得的含有糖基转移酶GmSGT2的粗酶液中分别加入0.1μM 3-O-葡萄糖醛酸基甘草次酸或3-O-葡萄糖基甘草次酸，0.1μM尿苷二磷酸半乳糖进行反应，反应条件37℃，2h。

HPLC检测产物。取反应物100μL加入900μL的甲醇，用0.22μm超滤膜过滤，并进行HPLC分析。色谱条件如下：岛津HPLC色谱仪，岛津自动进样器，液相色谱柱为反向C18硅胶柱(4.6mm×250mm)，LC-10A紫外检测器，检测波长为254nm；流动相为0.6％冰醋酸水溶液和甲醇双相(V/V＝16:84)等浓度梯度洗脱，流速1mL min^-1；柱温40℃。经过糖基转移酶GmSGT2催化后检测如图1所示色谱图，其中峰Gal-GAMG和峰Gal-GLMG分别为Gal-GAMG和Gal-GLMG，分子式见图2。结果说明糖基转移酶GmSGT2能够催化合成Gal-GAMG和Gal-GLMG。

实施例5：产物的分离纯化

(1)将反应混合液15000rpm离心10min，分离上清和沉淀，将沉淀用10mL甲醇重悬涡旋振荡5min。

(2)将得到的反应液上清和甲醇复溶的沉淀用真空旋转蒸发浓缩至液体蒸干，用5-10ml甲醇溶解浓缩产物，12000rpm离心2min，取上清通过孔径为0.22μm的有机相滤膜将样品过滤。

(3)用岛津LC-20AR分析半制备色谱仪分离纯化产物，条件如下：

流动相：A：甲醇，B：0.6％冰醋酸水溶液；等浓度梯度洗脱；流动相A：流动相B＝80：20；流速：5mL/min；色谱柱：岛津C18反向色谱柱。

(4)将纯化得到的产物Gal-GAMG或Gal-GLMG，通过真空干燥仪进行浓缩干燥，得到白色粉末，室温保存。

实施例6：Gal-GAMG和Gal-GLMG的结构鉴定

(1)取1mg实施例5中纯化产物溶于200μL甲醇进行质谱分析。图3为Gal-GAMG和Gal-GLMG的质谱图。结果表明产物的分别为808和794，说明产物为GAMG和GLMG上分别连接了一个半乳糖分子。

(2)将实例4中于37℃反应2h的含有Gal-GLMG中加入100μL浓度为2M的NaOH水溶液，于80℃进行4h皂化水解反应。结果表明产物不能被NaOH水解(图4)，产物的苷元部分上的酯键没有断裂，说明产物是在GLMG的葡萄糖分子上连接了一个半乳糖分子。

(3)取10mg纯化产物与10mg 3-O-葡萄糖醛酸基甘草次酸和3-O-葡萄糖基甘草次酸，用氘代甲醇溶解，使用Bruker Ascend 700M核磁共振波谱仪进行¹H谱和¹³C谱分析，并分析确定结构信息。表1为纯化产物与甘草次酸的H谱数据。H谱数据表明葡萄糖分子连接到甘草次酸分子上，并且葡萄糖分子与甘草次酸是通过β糖苷键的方式连接。

表1：甘草次酸和单葡萄糖甘草次酸1H NMR数据

实施例7：糖基转移酶催化反应最适温度

在48μL pH 7.4的PBS缓冲液中加入50μL的糖基转移酶GmSGT2、1μL底物糖基供体和1μL底物糖基受体，将总体积为100μL的反应液分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃的水浴中反应2h，取样用HPLC测定酶活。由图5可知糖基转移酶GmSGT2催化生成Gal-GAMG和Gal-GLMG的最适温度均为35℃。

实施例8：糖基转移酶催化反应的最适pH

分别在50μL pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9.0的PBS缓冲液中加入48μL的糖基转移酶GmSGT2、1μL底物糖基供体和1μL底物糖基受体，将总体积为100μL的反应液置于35℃的水浴锅中反应2h，取样用HPLC测定酶活。由图5可知，糖基转移酶GmSGT2催化生成Gal-GAMG和Gal-GLMG的最适pH均为7.5。

实施例9：糖基转移酶偶联UDP循环再生系统催化合成Gal-GAMG和Gal-GLMG

构建200μL反应体系：糖基转移酶GmSGT2、UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE和蔗糖合酶GmSusy粗酶液分别为68μL、20μL和10μL，蔗糖(2M)、尿苷二磷酸(200mM)、3-O-葡萄糖醛酸基甘草次酸(200mM)分别为100μL、1μL和1μL，37℃水浴2h，加入800μL的甲醇中止反应，通过孔径为0.22μm的有机相滤膜将样品过滤至液相小瓶用HPLC检测反应产物，色谱条件如下：岛津HPLC色谱仪，岛津自动进样器，液相色谱柱为反向C18硅胶柱(4.6mm×250mm)，LC-10A紫外检测器，检测波长为254nm；流动相为0.6％冰醋酸水溶液和甲醇双相(V/V＝16:84)等浓度梯度洗脱，流速1mL min^-1；柱温40℃。

用同样的方法催化合成并检测产物Gal-GLMG。

经过糖基转移酶偶联UDP循环再生系统催化后的产物检测如图6所示色谱图，其中峰Gal-GAMG和峰Gal-GLMG分别为Gal-GAMG和Gal-GLMG。结果说明糖基转移酶偶联UDP循环再生系统能够催化合成Gal-GAMG和Gal-GLMG。

实施例10：糖基转移酶偶联UDP循环再生系统催化反应的最适pH

分别在187μL pH 5.5、pH 6.0、pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9.0的PBS缓冲液中加入40μL的糖基转移酶GmSGT2、10μL的蔗糖合酶GmSusy、10μL的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE、50μL蔗糖(2M)、2μL UDP(0.2M)和1μL 3-O-葡萄糖醛酸基甘草次酸(0.2M)或3-O-葡萄糖基甘草次酸(0.2M)，将总体积为300μL的反应液置于37℃的水浴锅中反应60min，取样用HPLC测定结果。由图7可知，糖基转移酶GmSGT2偶联UDP循环再生系统催化反应的最适pH为7.0。

实施例11：糖基转移酶偶联UDP循环再生系统催化反应的最适温度

在37μL 2M的蔗糖中加入40μL的糖基转移酶GmSGT2、10μL的蔗糖合酶GmSusy、10μL的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE、2μL UDP(0.2M)和1μL 3-O-葡萄糖醛酸基甘草次酸(0.2M)或3-O-葡萄糖基甘草次酸(0.2M)，将总体积为100μL的反应液分别置于25、℃30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、和55℃的水浴中反应60min，取样用HPLC测定结果。由图7可知，基转移酶GmSGT2偶联UDP循环再生系统催化反应的最适温度为40℃。

序列表

<110> 北京理工大学

<120> 一种酶法制备单糖基甘草次酸半乳糖苷衍生物的方法

<141> 2018-10-08

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 1

atggagaaga agaagggtga gctaaagtca attttccttc ctttcctttc cactagtcac 60

ataatcccgc tagtggacat ggccagactc ttcgccttgc acgacgtcga cgtcaccatc 120

atcaccaccg cacataacgc caccgttttc caaaagtcca tcgatttaga tgcgagtcgc 180

ggtcgcccca tcagaacgca cgttgtcaac ttccccgccg cacaagtggg tctccccgtt 240

gggatcgaag ccttcaacgt cgatacgcct cgggaaatga cccccagaat ctacatgggc 300

ctatcccttc tccaacaagt cttcgaaaaa ctcttccatg acttgcaacc ggatttcatc 360

gtcaccgaca tgttccaccc ttggagtgtc gatgctgctg ctaaactcgg cattccgagg 420

atcatgttcc acggcgcaag ttatctcgct cgctccgctg cgcactccgt tgaacagtac 480

gcaccccact tggaagcaaa attcgacacc gacaagttcg tgttacctgg gttacccgat 540

aacttggaga tgacgcgctt gcagttgccg gattggctta ggtctccgaa tcagtacact 600

gaactgatga ggacgattaa gcagtcagag aaaaagagtt acggttcact ttttaatagt 660

ttttatgacc tcgagagtgc ttactacgag cattacaaga gcatcatggg aactaagagt 720

tggggaattg gaccggtttc gttgtgggcg aaccaggatg ctcaagataa agctgcacga 780

gggtatgcta aagaagaaga agagaaagaa gggtggctta agtggctcaa ctccaaagca 840

gagagctctg ttttgtatgt gagttttggg agcatgaaca agttccctta ctctcagctc 900

gttgaaatag cacgtgcgct tgaagattcg gggcatgatg ttatctgggt ggtgaggaaa 960

aacgatgggg gtgaaggaga taactttttg gaggagtttg agaagagaat gaaggaaagt 1020

aacaaaggat atttaatatg gggttgggcc ccacagttgt tgatactgga gaatcctgcg 1080

attggagggt tggttactca ctgtggttgg aacacggtgg tggaaagcgt gaacgcgggg 1140

ttgccgatgg cgacgtggcc tctgtttgcg gagcattttt tcaacgagaa gctggtggtg 1200

gatgtgttga agattggggt gccggtgggg gcgaaagagt ggaggaactg gaacgagttt 1260

gggagtgagg tggtgaaacg ggaggagatt ggaaacgcga ttgcttcgtt gatgagtgag 1320

gaagaagaag atggaggaat gaggaagaga gccaaggagc taagcgttgc ggcgaagagt 1380

gctataaagg ttggtggatc ttcgcacaac aacatgaagg aattgattcg ggagctcaag 1440

gagatcaagc tttccaagga ggctcaagag accgcaccca atccttaa 1488

<210> 2

<211> 494

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2

Met Glu Lys Lys Lys Gly Glu Leu Lys Ser Ile Phe Leu Pro Phe Leu

1 5 10 15

Ser Thr Ser His Ile Ile Pro Leu Val Asp Met Ala Arg Leu Phe Ala

20 25 30

Leu His Asp Val Asp Val Thr Ile Ile Thr Thr Ala His Asn Ala Thr

35 40 45

Val Phe Gln Lys Ser Ile Asp Leu Asp Ala Ser Arg Gly Arg Pro Ile

50 55 60

Arg Thr His Val Val Asn Phe Pro Ala Ala Gln Val Gly Leu Pro Val

65 70 75 80

Gly Ile Glu Ala Phe Asn Val Asp Thr Pro Arg Glu Met Thr Pro Arg

85 90 95

Ile Tyr Met Gly Leu Ser Leu Leu Gln Gln Val Phe Glu Lys Leu Phe

100 105 110

His Asp Leu Gln Pro Asp Phe Ile Val Thr Asp Met Phe His Pro Trp

115 120 125

Ser Val Asp Ala Ala Ala Lys Leu Gly Ile Pro Arg Ile Met Phe His

130 135 140

Gly Ala Ser Tyr Leu Ala Arg Ser Ala Ala His Ser Val Glu Gln Tyr

145 150 155 160

Ala Pro His Leu Glu Ala Lys Phe Asp Thr Asp Lys Phe Val Leu Pro

165 170 175

Gly Leu Pro Asp Leu Glu Met Thr Arg Leu Gln Leu Pro Asp Trp Leu

180 185 190

Arg Ser Pro Asn Gln Tyr Thr Glu Leu Met Arg Thr Ile Lys Gln Ser

195 200 205

Glu Lys Lys Ser Tyr Gly Ser Leu Phe Asn Ser Phe Tyr Asp Leu Glu

210 215 220

Ser Ala Tyr Tyr Glu His Tyr Lys Ser Ile Met Gly Thr Lys Ser Trp

225 230 235 240

Gly Ile Gly Pro Val Ser Leu Trp Ala Asn Gln Asp Ala Gln Asp Lys

245 250 255

Ala Ala Arg Gly Tyr Ala Lys Glu Glu Glu Glu Lys Glu Gly Trp Leu

260 265 270

Lys Trp Leu Asn Ser Lys Ala Glu Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe

275 280 285

Gly Ser Met Asn Lys Phe Pro Tyr Ser Gln Leu Val Glu Ile Ala Arg

290 295 300

Ala Leu Glu Asp Ser Gly His Asp Val Ile Trp Val Val Arg Lys Asn

305 310 315 320

Asp Gly Gly Glu Gly Asp Asn Phe Leu Glu Glu Phe Glu Lys Arg Met

325 330 335

Lys Glu Ser Asn Lys Gly Tyr Leu Ile Trp Gly Trp Ala Pro Gln Leu

340 345 350

Leu Ile Leu Glu Asn Pro Ala Ile Gly Gly Leu Val Thr His Cys Gly

355 360 365

Trp Asn Thr Val Val Glu Ser Val Asn Ala Gly Leu Pro Met Ala Thr

370 375 380

Trp Pro Leu Phe Ala Glu His Phe Phe Asn Glu Lys Leu Val Val Asp

385 390 395 400

Val Leu Lys Ile Gly Val Pro Val Gly Ala Lys Glu Trp Arg Asn Trp

405 410 415

Asn Glu Phe Gly Ser Glu Val Val Lys Arg Glu Glu Ile Gly Asn Ala

420 425 430

Ile Ala Ser Leu Met Ser Glu Glu Glu Glu Asp Gly Gly Met Arg Lys

435 440 445

Arg Ala Lys Glu Leu Ser Val Ala Ala Lys Ser Ala Ile Lys Val Gly

450 455 460

Gly Ser Ser His Asn Asn Met Lys Glu Leu Ile Arg Glu Leu Lys Glu

465 470 475 480

Ile Lys Leu Ser Lys Glu Ala Gln Glu Thr Ala Pro Asn Pro

485 490

<210> 3

<211> 2418

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 3

atggccaccg atcgtttgac ccgggttcac agtctccgtg agaggcttga tgaaaccctc 60

actgccaaca ggaatgaaat tttggccctt ctgtcaagga tcgaagccaa gggcaagggc 120

atcctgcaac accaccaggt cattgctgag tttgaggaaa tccctgagga gaacagacag 180

aagctcactg atggtgcctt tggagaagtc ttgagatcta cacaggaagc catagttttg 240

ccaccatggg ttgctctggc tgttcgtcca agacctggtg tgtgggagta cctgagagtg 300

aatgtgcacg ctcttgttgt tgaggagttg caacctgctg agtacctgca cttcaaggaa 360

gaacttgttg acggaagttc taatggcaac tttgtgcttg agttggactt tgaaccattc 420

aatgcagcct tcccccgccc aactcttaac aagtcaattg gaaatggtgt gcaattcctc 480

aaccgtcacc tttctgccaa actcttccac gacaaggaga gcttgcaccc acttttggag 540

ttcctcaggc ttcacagcgt caagggaaag actttgatgt tgaatgacag aattcaaaac 600

ccagatgcac tccaacatgt tctgaggaaa gctgaggagt atctgggcac agtgcctcct 660

gaaactccct actcagaatt tgagcacaag ttccaggaga ttggtttgga gagagggtgg 720

ggtgacaacg cggagcgtgt ccttgagtca attcaacttc tcttggatct tcttgaggcc 780

cctgacccgt gcacccttga gactttcctt ggaagaatcc ctatggtgtt caatgttgtt 840

attctttctc cccatggtta ctttgcccaa gataatgtct tgggataccc tgacactggt 900

ggccaggttg tttacatctt ggatcaagtt cgtgctttgg agaatgagat gctccatcgc 960

attaagcaac aaggattgga cattgttcct cgtattctca ttatcacccg tcttctcccc 1020

gatgcagtag gaactacttg tggccaacgt cttgagaagg tgttcggaac tgagcactcc 1080

cacattcttc gagttccctt tagaactgag aagggaattg ttcgcaagtg gatctcaaga 1140

ttcgaagtct ggccctactt ggaaacttac actgaggatg ttgcccacga gcttgccaaa 1200

gagttgcaag gcaagccaga tctgattgtt ggaaactaca gtgatggaaa cattgtcgct 1260

tctttgttgg cacataaatt aggtgtcact cagtgtacca ttgctcacgc acttgagaag 1320

accaaatacc ccgaatccga catttactgg aaaaaattgg aagagagata ccacttctct 1380

tgccaattca cagctgatct atttgccatg aaccacacag atttcattat caccagtacc 1440

ttccaggaga ttgctggaag caaggacact gttggacagt acgaatctca cacagccttc 1500

acccttcctg gactctaccg cgttgtgcat ggtattgatg tctttgatcc aaaattcaac 1560

attgtctccc ctggagctga tcaaaccatt tacttccccc acactgaaac cagccgtagg 1620

ttgacatcct tccaccctga aatcgaagaa ctcctttaca gctcagtgga gaatgaagaa 1680

cacatatgtg tgctgaagga ccgcagcaag ccaattatct tcaccatggc aaggttggat 1740

cgagtgaaga acatcacagg acttgtggag tggtacggta agaacgcgaa gctgagggag 1800

ctggtgaacc ttgtggttgt tgctggagac aggaggaagg agtcaaagga cttggaagaa 1860

aaggccgaga tgaagaagat gtacggcctg atcgagacct acaagttgaa cggccaattc 1920

agatggattt catcgcagat gaaccgtgtg aggaatggag agctctaccg cgtgatctgc 1980

gacaccaggg gtgctttcgt gcagcctgct gtatacgagg cttttggttt gacagtggtt 2040

gaggccatga cttgcggctt gccaacattc gccacatgca atggtggtcc tgctgagatc 2100

attgtgcacg gcaagtctgg cttccacatt gacccttacc atggtgaccg tgctgctgat 2160

ctccttgttg acttctttga gaagtgcaag cttgacccaa ctcactggga caagatctca 2220

aaggctggtc tccagcgtat tgaagagaag tacacatggc aaatttactc tcagaggctt 2280

ctcactctca ccggtgtcta tggcttctgg aagcatgtgt ctaaccttga ccgccgtgag 2340

agccgccgct atctcgagat gttctatgct ctcaagtacc gcaaattggc tgagtctgtg 2400

ccccttgctg ctgagtaa 2418

<210> 4

<211> 805

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 4

Met Ala Thr Asp Arg Leu Thr Arg Val His Ser Leu Arg Glu Arg Leu

1 5 10 15

Asp Glu Thr Leu Thr Ala Asn Arg Asn Glu Ile Leu Ala Leu Leu Ser

20 25 30

Arg Ile Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln His His Gln Val Ile

35 40 45

Ala Glu Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Asn Arg Gln Lys Leu Thr Asp

50 55 60

Gly Ala Phe Gly Glu Val Leu Arg Ser Thr Gln Glu Ala Ile Val Leu

65 70 75 80

Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val Trp Glu

85 90 95

Tyr Leu Arg Val Asn Val His Ala Leu Val Val Glu Glu Leu Gln Pro

100 105 110

Ala Glu Tyr Leu His Phe Lys Glu Glu Leu Val Asp Gly Ser Ser Asn

115 120 125

Gly Asn Phe Val Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn Ala Ala Phe

130 135 140

Pro Arg Pro Thr Leu Asn Lys Ser Ile Gly Asn Gly Val Gln Phe Leu

145 150 155 160

Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His Asp Lys Glu Ser Leu His

165 170 175

Pro Leu Leu Glu Phe Leu Arg Leu His Ser Val Lys Gly Lys Thr Leu

180 185 190

Met Leu Asn Asp Arg Ile Gln Asn Pro Asp Ala Leu Gln His Val Leu

195 200 205

Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Gly Thr Val Pro Pro Glu Thr Pro Tyr

210 215 220

Ser Glu Phe Glu His Lys Phe Gln Glu Ile Gly Leu Glu Arg Gly Trp

225 230 235 240

Gly Asp Asn Ala Glu Arg Val Leu Glu Ser Ile Gln Leu Leu Leu Asp

245 250 255

Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys Thr Leu Glu Thr Phe Leu Gly Arg

260 265 270

Ile Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His Gly Tyr Phe

275 280 285

Ala Gln Asp Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Gln Val Val

290 295 300

Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Asn Glu Met Leu His Arg

305 310 315 320

Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asp Ile Val Pro Arg Ile Leu Ile Ile Thr

325 330 335

Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Gln Arg Leu Glu

340 345 350

Lys Val Phe Gly Thr Glu His Ser His Ile Leu Arg Val Pro Phe Arg

355 360 365

Thr Glu Lys Gly Ile Val Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe Glu Val Trp

370 375 380

Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Val Ala His Glu Leu Ala Lys

385 390 395 400

Glu Leu Gln Gly Lys Pro Asp Leu Ile Val Gly Asn Tyr Ser Asp Gly

405 410 415

Asn Ile Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr Gln Cys

420 425 430

Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Glu Ser Asp Ile

435 440 445

Tyr Trp Lys Lys Leu Glu Glu Arg Tyr His Phe Ser Cys Gln Phe Thr

450 455 460

Ala Asp Leu Phe Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr Ser Thr

465 470 475 480

Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Asp Thr Val Gly Gln Tyr Glu Ser

485 490 495

His Thr Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val His Gly Ile

500 505 510

Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala Asp Gln

515 520 525

Thr Ile Tyr Phe Pro His Thr Glu Thr Ser Arg Arg Leu Thr Ser Phe

530 535 540

His Pro Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Ser Ser Val Glu Asn Glu Glu

545 550 555 560

His Ile Cys Val Leu Lys Asp Arg Ser Lys Pro Ile Ile Phe Thr Met

565 570 575

Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Ile Thr Gly Leu Val Glu Trp Tyr

580 585 590

Gly Lys Asn Ala Lys Leu Arg Glu Leu Val Asn Leu Val Val Val Ala

595 600 605

Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp Leu Glu Glu Lys Ala Glu Met

610 615 620

Lys Lys Met Tyr Gly Leu Ile Glu Thr Tyr Lys Leu Asn Gly Gln Phe

625 630 635 640

Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asn Arg Val Arg Asn Gly Glu Leu Tyr

645 650 655

Arg Val Ile Cys Asp Thr Arg Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala Val Tyr

660 665 670

Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly Leu Pro

675 680 685

Thr Phe Ala Thr Cys Asn Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Val His Gly

690 695 700

Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His Gly Asp Arg Ala Ala Asp

705 710 715 720

Leu Leu Val Asp Phe Phe Glu Lys Cys Lys Leu Asp Pro Thr His Trp

725 730 735

Asp Lys Ile Ser Lys Ala Gly Leu Gln Arg Ile Glu Glu Lys Tyr Thr

740 745 750

Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Arg Leu Leu Thr Leu Thr Gly Val Tyr Gly

755 760 765

Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu Asp Arg Arg Glu Ser Arg Arg Tyr

770 775 780

Leu Glu Met Phe Tyr Ala Leu Lys Tyr Arg Lys Leu Ala Glu Ser Val

785 790 795 800

Pro Leu Ala Ala Glu

805

<210> 5

<211> 1125

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 5

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccgaattcat gagagttctg 120

gtcactggtg gtagcggtta cattggaagt catacctgcg tgcaattact gcaaaacggt 180

catgatgtca tcattcttga taacctctgt aacagtaagc gcagcgtact gcctgttatc 240

gagcgtttag gcggcaaaca tccaacgttt gttgaaggcg atattcgtaa cgaagcgttg 300

atgaccgaga tcctgcacga tcacgctatc gacaccgtga tccacttcgc cgggctgaaa 360

gccgttggcg aatcggtaca aaaaccgctg gaatattacg acaacaatgt caacggcact 420

ctgcgcctga ttagcgccat gcgcgccgct aacgtcaaaa actttatttt tagctcctcc 480

gccaccgttt atggcgatca gcccaaaatt ccatacgttg aaagcttccc gaccggcaca 540

ccgcaaagcc cttatggcaa aagcaaattg atggtggaac agatcctcac cgacctgcaa 600

aaagcccagc cggactggag cattgccctg ctgcgctact tcaacccggt tggcgcgcat 660

ccgtcgggcg atatgggcga agatccgcaa ggcattccga ataacctgat gccatacatc 720

gcccaggttg ctgtaggccg tcgcgactcg ctggcgattt ttggtaacga ttatccgacc 780

gaagatggta ctggcgtacg cgattacatc cacgtaatgg atctggcgga cggtcacgtc 840

gtggcgatgg aaaaactggc gaacaagcca ggcgtacaca tctacaacct cggtgctggc 900

gtaggcagca gcgtgctgga cgtggttaat gccttcagca aagcctgcgg caaaccggtt 960

aactatcatt ttgcaccgcg tcgcgaaggc gaccttccgg cctactgggc ggacgccagc 1020

aaagccgacc gtgaactgaa ctggcgcgta acgcgcacac tcgatgaaat ggcgcaggac 1080

acctggcact ggcagtcacg ccatccacag ggatatcccg attaa 1125

<210> 6

<211> 374

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 6

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Glu Phe Met Arg Val Leu Val Thr Gly Gly Ser Gly Tyr Ile

35 40 45

Gly Ser His Thr Cys Val Gln Leu Leu Gln Asn Gly His Asp Val Ile

50 55 60

Ile Leu Asp Asn Leu Cys Asn Ser Lys Arg Ser Val Leu Pro Val Ile

65 70 75 80

Glu Arg Leu Gly Gly Lys His Pro Thr Phe Val Glu Gly Asp Ile Arg

85 90 95

Asn Glu Ala Leu Met Thr Glu Ile Leu His Asp His Ala Ile Asp Thr

100 105 110

Val Ile His Phe Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser Val Gln Lys

115 120 125

Pro Leu Glu Tyr Tyr Asp Asn Asn Val Asn Gly Thr Leu Arg Leu Ile

130 135 140

Ser Ala Met Arg Ala Ala Asn Val Lys Asn Phe Ile Phe Ser Ser Ser

145 150 155 160

Ala Thr Val Tyr Gly Asp Gln Pro Lys Ile Pro Tyr Val Glu Ser Phe

165 170 175

Pro Thr Gly Thr Pro Gln Ser Pro Tyr Gly Lys Ser Lys Leu Met Val

180 185 190

Glu Gln Ile Leu Thr Asp Leu Gln Lys Ala Gln Pro Asp Trp Ser Ile

195 200 205

Ala Leu Leu Arg Tyr Phe Asn Pro Val Gly Ala His Pro Ser Gly Asp

210 215 220

Met Gly Glu Asp Pro Gln Gly Ile Pro Asn Asn Leu Met Pro Tyr Ile

225 230 235 240

Ala Gln Val Ala Val Gly Arg Arg Asp Ser Leu Ala Ile Phe Gly Asn

245 250 255

Asp Tyr Pro Thr Glu Asp Gly Thr Gly Val Arg Asp Tyr Ile His Val

260 265 270

Met Asp Leu Ala Asp Gly His Val Val Ala Met Glu Lys Leu Ala Asn

275 280 285

Lys Pro Gly Val His Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gly Val Gly Ser Ser

290 295 300

Val Leu Asp Val Val Asn Ala Phe Ser Lys Ala Cys Gly Lys Pro Val

305 310 315 320

Asn Tyr His Phe Ala Pro Arg Arg Glu Gly Asp Leu Pro Ala Tyr Trp

325 330 335

Ala Asp Ala Ser Lys Ala Asp Arg Glu Leu Asn Trp Arg Val Thr Arg

340 345 350

Thr Leu Asp Glu Met Ala Gln Asp Thr Trp His Trp Gln Ser Arg His

355 360 365

Pro Gln Gly Tyr Pro Asp

370

Claims

1.一种糖基转移酶在体外合成2-O-半乳糖基-3-O-葡萄糖醛酸基甘草次酸(Gal-GAMG)和2-O-半乳糖基-3-O-葡萄糖基甘草次酸(Gal-GLMG)中的应用，其特征在于，所述糖基转移酶是来源于大豆的GmSGT2(GenBank:AB473730.1)基因编码的糖基转移酶，命名为GmSGT2蛋白，编码该蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1，氨基酸序列为SEQ ID No.2。

2.一种合成Gal-GAMG和Gal-GLMG的方法，其特征在于使用糖基转移酶作为催化剂，以温和、高效、绿色的方法直接催化3-O-葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)3-O-葡萄糖基甘草次酸(GLMG)和尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)分别合成Gal-GAMG和Gal-GLMG。

3.一种糖基转移酶偶联UDP循环再生系统多酶催化合成Gal-GAMG和Gal-GLMG的方法，其特征在于使用糖基转移酶GmSGT2(GenBank:AB473730.1)、来源大豆的蔗糖合酶GmSusy和来源大肠杆菌的UDP-葡萄糖-4-差向异构酶GalE构建UDP循环体系，利用三种酶级联催化，以温和、绿色、更加高效的方法直接催化GAMG或GLMG、用更为廉价的尿苷二磷酸(UDP)和蔗糖分别合成Gal-GAMG和Gal-GLMG。上述方法较权利要求2中提供的方法更为高效、成本更加低廉。

4.根据权利要求2中所述的方法，所述催化反应最适pH为7.5，所述催化反应最适温度为35℃。

5.根据权利要求3中所述的方法，所述催化反应最适pH为7.0，所述催化反应最适温度为40℃。