CN113322219B

CN113322219B - 一种生物法催化合成姜黄素糖苷类化合物的方法

Info

Publication number: CN113322219B
Application number: CN202110188213.1A
Authority: CN
Inventors: 李艳; 贾红华; 余杰; 林磊; 孙萍; 徐娇娇
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2021-02-19
Filing date: 2021-02-19
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2041-02-19
Also published as: CN113322219A

Abstract

本发明公开了一种生物法催化合成姜黄素糖苷类化合物的方法。通过将糖基转移酶基因CaUGT2及蔗糖合成酶基因AtSUS1构建到表达载体上，导入到大肠杆菌中得到重组菌株，此重组菌株进行诱导表达后其可溶性表达量比其他植物来源糖基转移酶有所提高，可对底物姜黄素进行高效催化。所述重组质粒为pRSF‑CaUGT2‑AtSUS1，在Nco I和EcoR I插入蔗糖合成酶AtSUS1基因，在Xho I和NdeI插入糖基转移酶CaUGT2，构成共表达重组质粒pRSF‑CaUGT2‑AtSUS1，将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中得到重组菌株CaUGT2‑AtSUS1，重组菌株进行诱导表达后其糖基转移酶CaUGT2可溶性表达量比其他植物来源糖基转移酶有所提高，催化合成姜黄素糖苷类化合物转化率达到98%，催化姜黄素生成姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷，其水溶性优于姜黄素，解决姜黄素水溶性差的问题。底物姜黄素浓度75mM，催化底物浓度较高，更适用于工业化中食品及药品行业。

Description

一种生物法催化合成姜黄素糖苷类化合物的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种生物法催化合成姜黄素糖苷类化合物的方法。

背景技术

姜黄素是一种黄色素，最早在姜科植物中提取出，属于比较稀少的多酚类化合物。姜黄素的结晶为橙黄色，有苦味，不溶于水和乙醚，易溶于冰醋酸和碱溶液。姜黄素分子两端分别具有羟基，在碱性条件下，容易发生共轭效应，所以当 pH 大于 8 时，姜黄素会由黄变红。长期以来，姜黄素作为一种常用的天然植物染色素被广泛地研究和应用在食品工业中，主要广泛应用于食品罐头、肠类制品、酱油以及卤制品的加工染色。随着姜黄素研究的不断深入，研究人员发现姜黄素具有广泛的药理活性，比如抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗癌、抗动脉粥样硬化等。低浓度的姜黄素通过其抗氧化特性抑制炎症的发生，高浓度的姜黄素通过其促氧化活性促使癌细胞凋亡。姜黄素通过非氧化还原机制来控制编码抗氧化剂过氧化氢酶 A 和 SOD 酶的基因的 mRNA 水平，降低细胞内抗氧化酶的含量，这些酶的减少反过来引起 ROS(活性氧)的积累，激活相关细胞信号通路，诱导癌细胞凋亡，从而发挥其抗癌作用。传统医学使用姜黄素治疗关节炎、溃疡、黄疸等疾病，随着现代医学的发展，姜黄素被越来越多地用于治疗肝脏疾病、炎症、肿瘤等。但由于其结构不稳定、水溶性差，导致姜黄素生物利用度低，从而限制了其大规模应用。

通过官能团修饰提高姜黄素的水溶性和稳定性，以提高其生物利用度，改善药代动力学，或是化学法被姜黄素形成复合物以保护活性、促进吸收、增强其抗癌能力是当前姜黄素相关研究的主攻方向。

糖苷化是提升姜黄素水溶性的一个有效手段，Yasuhisa Kaminaga 等人研究了姜黄素糖苷化物的水溶性并与天然姜黄素对比，发现姜黄素单葡萄糖苷的水溶性提高了 230倍。相比之下，姜黄素环糊精复合物的水溶性相较于天然姜黄素的提升为 10 倍左右。因此，转化合成新的姜黄素糖苷化产物有望成为解决姜黄素水溶性差的问题的有效途径。

可以通过多种途径使姜黄素糖苷化:化学合成法、酶催化法(一锅法)、混合催化法等，其共同的难点在于控制反应的特异性和精确性。化学法采用基团保护策略以增加反应的精确性，需要耗费大量的成本与时间，且步骤繁琐。与之形成对比，使用酶催化反应具有更高的特异性以及更高的效率，且操作简单，易于自动化。

糖基转移酶(Glycosyltransferases, GTs)是催化化合物(如蛋白、核酸、脂类、糖类等)与糖残基(如糖核苷酸等)偶联的酶。糖基转移酶具有高选择性和高效性，可实现多聚糖和糖缀合物的立体和区域选择性延伸和分支。根据其催化特性，糖基转移酶被分为Leloir 型和 Non-Leloir 型。Leloir 型糖基转移酶通常以糖核苷酸为糖基供体(如UDPG)，Non-Leloir 型则常以糖-1-磷酸酯作为糖基供体。由于 UGT 需要以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)作为底物，而直接向工业反应器中添加价格较高的 UDPG 不符合大规模生产的经济性原则，因此糖基转移酶的大规模应用受到了限制。Sayaka Masada 等率先报道了偶联蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy)与糖基转移酶的方法，并提出了 UDP 循环利用的可行性。利用 SuSy 与 UGT，建立双酶偶联体系。双酶催化时，首先由蔗糖合酶催化蔗糖裂解生成 UDPG 和果糖。随后由糖基转移酶催化进行糖基化反应。而糖基化过程中生成的UDP 又可被蔗糖合酶利用，再次转化为 UDPG，从而实现循环利用，同时也避免了 UDP 的积累对酶活性的抑制。采用双酶偶联体系，只需添加廉价的蔗糖作为底物，而不需昂贵的UDPG，因此可以达到控制生产成本的目的。一般植物来源的糖基转移酶多以包涵体的形式存在，包涵体较多其破碎上清液中酶较少，导致其催化效果较差。

发明内容

本发明目的是针对目前姜黄素生物利用度低、水溶性差的问题，提供一种一种生物法催化合成姜黄素糖苷类化合物的方法，同时解决植物来源的糖基转移酶在大肠杆菌中表达产生大量包涵体的问题，提供一种含糖基转移酶与蔗糖合酶的重组菌，采用将目标基因构建到表达载体pRSFDuet1上，得到重组质粒pRSF-CaUGT2-AtSUS1，后转化到宿主细胞大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中得到重组菌CaUGT2-AtSUS1，重组菌进行诱导表达，经超声破碎后离心得上清液，得到最佳可溶性表达，最终高效催化底物姜黄素，提高其水溶性。

为了实现上述目的，本申请采用的技术方案为：

一种生物法催化合成姜黄素糖苷类化合物的方法，使用能表达蔗糖合成酶AtSUS1和糖基转移酶CaUGT2的重组菌催化姜黄素生成姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷，所述蔗糖合成酶AtSUS1基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述糖基转移酶CaUGT2基因序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的催化姜黄素的重组菌，在Nco I和EcoR I 插入蔗糖合成酶Atsus1基因，在Xho I和NdeI插入糖基转移酶基因CaUGT2，构建共表达重组质粒pRSF-CaUGT2-AtSUS1，后转化至宿主细胞大肠杆菌中得到重组菌。

一种催化姜黄素的重组菌，所述重组菌能共表达蔗糖合成酶AtSUS1和糖基转移酶CaUGT2，所述蔗糖合成酶AtSUS1基因（ACCESSION： NP_001031915.1），其优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示、氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述糖基转移酶CaUGT2基因（GenBank: BAD29722.1），其优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示、氨基酸序列SEQ IDNO:4所示，所述菌株能催化姜黄素生成姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷。

一种糖基转移酶与蔗糖合酶重组质粒，采用将目标基因构建到表达载体pRSFDuet1上，在Nco I和EcoR I 插入优化后的蔗糖合成酶基因AtSUS1，序列如SEQ ID NO:1所示；在Xho I和NdeI插入优化后的糖基转移酶基因CaUGT2，序列如SEQ ID NO:3所示，得到重组质粒pRSF-CaUGT2-AtSUS1。

所述重组质粒pRSF-CaUGT2-AtSUS1如图1所示。

重组质粒构建重组菌：将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将转化物涂布在含50 µg/L卡那霉素的LB固体平板（NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，琼脂20 g/L）上，置于37℃培养箱过夜恒温培养，得到含双酶共表达体系的重组菌株。

所述重组菌株进行诱导培养条件和催化条件为：

将重组菌株活化，转接到LB培养基中，放入摇床中于25～40°C、100～300rpm，至其OD₆₀₀达到0.4～0.8，添加诱导剂诱导培养，低温离心（2～8℃，4000～8000 rpm，5～15 min）并收集菌体，用磷酸钾缓冲液冲洗两遍。再加入适量磷酸钾缓冲液，放置在冰水混合物中，用超声破碎仪超声破碎菌体，参数设置为Ф6，300 W，10～30min。再用冷冻离心机离心，参数设置为2～8℃，4000～8000rpm，15～40 min，取上清即为粗酶液，放置4℃冰箱保存待用。

所述诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，用量为0.1～1.0mM，诱导时间为20～48h。

重组菌催化姜黄素的方法：在催化反应体系中加入1mM～100mM姜黄素，3mM～1M蔗糖和3g/L～10g/L粗酶液，反应5-30h，甲醇灭活，离心得上清即为姜黄素单糖苷curcuminmonoglucoside和姜黄素双糖苷curcumin diglucoside。姜黄素单糖苷curcuminmonoglucoside结构式如图3所示，姜黄素双糖苷curcumin diglucoside结构式如图4所示。随着催化时间的延长，底物姜黄素基本被全部消耗，反应产物方向朝着姜黄素双糖苷进行，也可以使产物姜黄素单糖苷继续进行糖基化反应。姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷其水溶性较高，更适用于工业化食品以及药品行业。

进一步优选地，在催化反应体系中加入75mM姜黄素，750mM蔗糖和5g/L粗酶液，反应42h，甲醇灭活，离心得上清即为姜黄素单糖苷curcumin monoglucoside和姜黄素双糖苷curcumin diglucoside。姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷其水溶性都要明显优于姜黄素本身，解决姜黄素水溶性差的问题，随着催化时间的增加，催化产物姜黄素双糖苷明显增加，姜黄素双糖苷具有更优的食品或药物功能。

本发明采用将蔗糖合成酶基因AtSUS1和糖基转移酶基因CaUGT2构建到表达载体pRSFDuet1上，得到重组质粒pRSF-CaUGT2-AtSUS1，将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中得到重组菌株CaUGT2-AtSUS1，重组菌株进行诱导表达后经超声破碎后离心得上清液，其蛋白可溶性表达比其他植物来源糖基转移酶（如：甜叶菊来源的pRSF-UGT76G1-StSUS1）有明显提高。

本发明中重组菌株CaUGT2-AtSUS1催化姜黄素得到姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷，反应21h后，转化率达到98%，为重组菌株UGT76G1-StSUS1的2.5倍。本实验姜黄素底物浓度为75mM，底物浓度较高，更适用于工业化生产中。

本发明生物法催化合成姜黄素糖苷类化合物的方法，催化得到的姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷其水溶性都要明显优于姜黄素本身，解决姜黄素水溶性差的问题，随着催化时间的增加，催化产物姜黄素双糖苷明显增加，姜黄素双糖苷具有更优的食品或药物功能。

有益效果：本发明构建了一株催化姜黄素的重组菌CaUGT2-AtSUS1，底物姜黄素浓度较高，更适用于工业化食品及药品行业生产。反应24h内其转化率达到98%，重组菌株CaUGT2-AtSUS1催化效率较高，反应42h其转化率依旧维持在98%，重组菌株CaUGT2-AtSUS1中糖基转移酶以及蔗糖合酶较稳定。

附图说明：

图1：重组质粒图；

图2：重组质粒CaUGT2-AtSUS1诱导培养表达的SDS-PAGE结果，M：Maker；泳道1:UGT76G1-StSUS1破碎沉淀；泳道2:UGT76G1-StSUS1破碎上清液；泳道3:UGT76G1-StSUS1破碎沉淀；泳道4:UGT76G1-StSUS1破碎上清液；泳道5:CaUGT2-AtSUS1破碎沉淀；泳道6:CaUGT2-AtSUS1破碎上清液；

图3:姜黄素单糖苷结构式；

图4:姜黄素双糖苷结构式；

图5: 重组菌CaUGT2-AtSUS1与UGT76G1-StSUS1催化姜黄素对比图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下面结合实例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护的范围不限于此。

实施例1 重组质粒的构建

选择双基因表达载体pRSFDuet-1，重组质粒为pRSF-CaUGT2-AtSUS1，在Nco I和EcoR I 插入优化后的蔗糖合成酶基因AtSUS1，序列如SEQ ID NO:1所示；在Xho I和NdeI插入优化后的糖基转移酶基因CaUGT2，序列如SEQ ID NO:3所示，得到重组质粒pRSF-CaUGT2-AtSUS1，构成共表达重组质粒pRSF-CaUGT2-AtSUS1。该重组质粒合成由南京金斯瑞公司进行。蔗糖合成酶AtSUS1其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，糖基转移酶CaUGT2其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

对比例：选择双基因表达载体pRSFDuet-1，重组质粒为pRSF-UGT76G1-StSUS1，在Nco I和EcoR I 插入蔗糖合成酶基因StSUS1，序列如SEQ ID NO:5所示，在Xho I和NdeI插入糖基转移酶基因UGT76G1，序列如SEQ ID NO:7所示，构成共表达重组质粒pRSF-UGT76G1-AtSUS1。该重组质粒合成由南京金斯瑞公司进行。蔗糖合成酶StSUS1其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，糖基转移酶UGT76G1其氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

实施例2 重组大肠杆菌菌株的获得

将上述重组质粒pRSF-CaUGT2-AtSUS1转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将转化物涂布在含50 µg/L卡那霉素的LB固体平板（NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20 g/L）上，置于37℃培养箱过夜恒温培养，得到含双酶共表达体系的重组菌CaUGT2-AtSUS1。

将上述重组质粒pRSF-UGT76G1-StSUS1转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将转化物涂布在含50 µg/L卡那霉素的LB固体平板（NaCl 10 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨10g/L，琼脂20 g/L）上，置于37℃培养箱过夜恒温培养，得到含双酶共表达体系的重组菌UGT76G1-StSUS1。

实施例3 重组菌株的诱导表达

将实施例2构建得到的两株重组菌株分别活化，转接到LB培养基中，放入摇床中于25～40°C、200rpm，至其OD₆₀₀达到0.6，添加0.1mM诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导培养，低温离心（4℃，7000 rpm，6 min）并收集菌体，用磷酸钾缓冲液冲洗两遍。再加入适量磷酸钾缓冲液，放置在冰水混合物中，用超声破碎仪超声破碎菌体，参数设置为Ф6，300 W，30min。再用冷冻离心机离心，参数设置为4℃，8000rpm，30 min，取上清液即为粗酶液，放置4℃冰箱保存待用。

实施例4 重组菌株粗酶液的酶活检测

糖基转移酶酶活测定方法为：在500 µL的酶催化反应体系中加入0.5 mM底物姜黄素，5 mM UDPG，粗酶0.5 mg，DMSO 10%，再用100 mM pH 7.2磷酸钾缓冲液补充。反应条件是37℃，200 rpm取样时间为0 min、10 min、20 min。样品处理：每个时间点取一管500 µL反应体系，加入500 µL甲醇终止反应，离心取上清，过有机滤膜（0.45 µm）放入样品瓶中，待HPLC检测。酶活定义（U）：1分钟内转化生成1 µmol产物所需的酶量为1个酶活单位。

蔗糖合酶的酶活测定方法：在3 mL的酶催化反应体系中加入500 mM底物蔗糖，10mM UDP·xNa，粗酶6 mg，再用100 mM pH 7.2磷酸钾缓冲液补充。反应条件是37℃，200rpm，取样时间为0 min、5min、30 min。样品处理：样品煮沸5 min，离心取500 µL，加入500 µL水，再加2 mL DNS，煮沸2 min，冷却后加入7 mL蒸馏水，测OD₅₄₀对照DNS标曲，计算果糖含量。酶活定义（U）：1分钟内转化生成1 µmol产物所需的酶量为1个酶活单位。

表1：糖基转移酶与蔗糖合酶酶活测定结果

CaUGT2-AtSUS1	比酶活（mU/mg）
		CaUGT2	13.8±0.10
AtSUS1	2.9±0.12
		UGT76G1-StSUS1	比酶活（mU/mg）
UGT76G1	6.9±0.15
		StSUS1	2.3±0.22

测定结果，重组菌株pRSF-CaUGT2-AtSUS1中糖基转移酶CaUGT2比酶活要比pRSF-UGT76G1-StSUS1中糖基转移酶UGT76G1比酶活高出2倍。

实施例5 重组菌株催化姜黄素反应

催化反应体系（5 mL）：底物姜黄素75 mM，蔗糖750 mM，粗酶液5 mg/mL，用100 mMpH 7.2磷酸钾缓冲补充。催化反应条件为30℃，200 rpm。按一定时间取样50 µL，样品经处理后，用高效液相色谱（HPLC）检测分析。样品处理：样品中加入450 µL，离心取上清液，过有机滤膜（0.45 µm）放入样品小瓶子，待HPLC检测分析。

姜黄素经催化后由最初淡黄色溶液变成橙红色溶液且溶解度明显增高，随着催化时间的延长，底物姜黄素基本被完全消耗，反应产物方向朝着姜黄素双糖苷进行，也可以使产物姜黄素单糖苷继续进行糖基化反应。重组菌CaUGT2-AtSUS1与UGT76G1-StSUS1催化姜黄素对比图见图5所示。从图中可以看出，重组菌CaUGT2-AtSUS1催化姜黄素的效果远远超过UGT76G1-StSUS1。

经过催化姜黄素反应体系，姜黄素能够在21h内被重组菌CaUGT2-AtSUS1基本全部转化，转化率达到98%，且随着时间的不断延长达到40h，其糖基转移酶酶活较高且稳定。然而对比重组菌UGT76G1-StSUS1催化姜黄素，在反应40h内催化姜黄素最高转化率不足40%，重组菌CaUGT2-AtSUS1是重组菌UGT76G1-StSUS1催化姜黄素转化率的2.5倍，证明重组菌CaUGT2-AtSUS1能够更优催化底物姜黄素。

序列表

<110> 南京工业大学

<120> 一种生物法催化合成姜黄素糖苷类化合物的方法

<141> 2021-02-18

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2430

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

atgggcgcga acgcggagcg tatgatcacc cgtgtgcaca gccagcgtga gcgtctgaac 60

gaaaccctgg ttagcgagcg taacgaagtg ctggcgctgc tgagccgtgt tgaagcgaaa 120

ggcaagggca ttctgcagca aaaccagatc attgcggagt tcgaagcgct gccggaacaa 180

acccgtaaga aactggaggg tggcccgttc tttgacctgc tgaaaagcac ccaggaagcg 240

attgttctgc cgccgtgggt tgcgctggcg gtgcgtccgc gtccgggtgt ttgggagtac 300

ctgcgtgtga acctgcacgc gctggttgtg gaggaactgc aaccggcgga gttcctgcac 360

tttaaagagg aactggttga tggtgtgaag aacggcaact tcaccctgga gctggacttc 420

gaaccgttta acgcgagcat tccgcgtccg accctgcaca aatacatcgg taacggcgtt 480

gatttcctga accgtcacct gagcgcgaaa ctgtttcacg acaaggagag cctgctgccg 540

ctgctgaagt ttctgcgtct gcacagccac cagggtaaaa acctgatgct gagcgaaaag 600

atccagaacc tgaacaccct gcaacacacc ctgcgtaaag cggaggaata tctggcggag 660

ctgaagagcg aaaccctgta cgaggagttc gaggcgaagt ttgaggaaat cggtctggaa 720

cgtggttggg gcgataacgc ggagcgtgtg ctggacatga ttcgtctgct gctggatctg 780

ctggaagcgc cggatccgtg caccctggag accttcctgg gtcgtgttcc gatggtgttt 840

aacgtggtta tcctgagccc gcacggttac ttcgcgcagg ataacgtgct gggctatccg 900

gacaccggtg gccaggtggt ttacatcctg gatcaagttc gtgcgctgga gatcgaaatg 960

ctgcaacgta ttaaacagca aggtctgaac attaagccgc gtatcctgat tctgacccgt 1020

ctgctgccgg atgcggtggg taccacctgc ggcgagcgtc tggaacgtgt ttacgatagc 1080

gaatattgcg acatcctgcg tgttccgttc cgtaccgaga aaggcatcgt gcgtaagtgg 1140

attagccgtt ttgaagtttg gccgtacctg gagacctata ccgaagatgc ggcggtggag 1200

ctgagcaaag aactgaacgg caagccggat ctgatcattg gtaactatag cgatggtaac 1260

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ctggagaaaa ccaagtaccc ggacagcgat atttattgga agaaactgga cgataagtac 1380

cacttcagct gccaatttac cgcggatatc ttcgcgatga accacaccga cttcatcatt 1440

accagcacct ttcaggagat tgcgggtagc aaagaaaccg ttggccaata tgagagccac 1500

accgcgttta ccctgccggg tctgtaccgt gtggttcacg gcattgacgt tttcgatccg 1560

aagtttaaca tcgtgagccc gggtgcggac atgagcattt acttcccgta taccgaggaa 1620

aaacgtcgtc tgaccaagtt tcacagcgaa atcgaggaac tgctgtatag cgatgttgag 1680

aacaaagaac acctgtgcgt gctgaaggac aagaaaaagc cgattctgtt cacgatggcg 1740

cgtctggatc gtgttaaaaa cctgagcggt ctggtggaat ggtacggcaa gaacacccgt 1800

ctgcgtgagc tggcgaacct ggtggttgtg ggtggcgatc gtcgtaaaga aagcaaggac 1860

aacgaggaaa aagcggagat gaaaaagatg tacgacctga tcgaggaata taagctgaac 1920

ggccagttcc gttggattag cagccaaatg gatcgtgtgc gtaacggcga gctgtaccgt 1980

tatatctgcg acaccaaagg cgcgttcgtt cagccggcgc tgtatgaagc gtttggtctg 2040

accgttgttg aagcgatgac ctgcggtctg ccgacctttg cgacctgcaa aggtggcccg 2100

gcggaaatca ttgtgcacgg taaaagcggc tttcacattg atccgtacca cggcgaccag 2160

gcggcggata ccctggcgga cttctttacc aaatgcaagg aagatccgag ccactgggac 2220

gagatcagca aaggtggcct gcaacgtatt gaggaaaagt acacctggca gatctatagc 2280

caacgtctgc tgaccctgac cggtgtttat ggcttctgga aacacgtgag caacctggac 2340

cgtctggaag cgcgtcgtta cctggagatg ttttacgcgc tgaagtatcg tccgctggcg 2400

caggcggttc cgctggcgca agacgattaa 2430

<210> 2

<211> 808

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

Met Ala Asn Ala Glu Arg Met Ile Thr Arg Val His Ser Gln Arg Glu

1 5 10 15

Arg Leu Asn Glu Thr Leu Val Ser Glu Arg Asn Glu Val Leu Ala Leu

20 25 30

Leu Ser Arg Val Glu Ala Lys Gly Lys Gly Ile Leu Gln Gln Asn Gln

35 40 45

Ile Ile Ala Glu Phe Glu Ala Leu Pro Glu Gln Thr Arg Lys Lys Leu

50 55 60

Glu Gly Gly Pro Phe Phe Asp Leu Leu Lys Ser Thr Gln Glu Ala Ile

65 70 75 80

Val Leu Pro Pro Trp Val Ala Leu Ala Val Arg Pro Arg Pro Gly Val

85 90 95

Trp Glu Tyr Leu Arg Val Asn Leu His Ala Leu Val Val Glu Glu Leu

100 105 110

Gln Pro Ala Glu Phe Leu His Phe Lys Glu Glu Leu Val Asp Gly Val

115 120 125

Lys Asn Gly Asn Phe Thr Leu Glu Leu Asp Phe Glu Pro Phe Asn Ala

130 135 140

Ser Ile Pro Arg Pro Thr Leu His Lys Tyr Ile Gly Asn Gly Val Asp

145 150 155 160

Phe Leu Asn Arg His Leu Ser Ala Lys Leu Phe His Asp Lys Glu Ser

165 170 175

Leu Leu Pro Leu Leu Lys Phe Leu Arg Leu His Ser His Gln Gly Lys

180 185 190

Asn Leu Met Leu Ser Glu Lys Ile Gln Asn Leu Asn Thr Leu Gln His

195 200 205

Thr Leu Arg Lys Ala Glu Glu Tyr Leu Ala Glu Leu Lys Ser Glu Thr

210 215 220

Leu Tyr Glu Glu Phe Glu Ala Lys Phe Glu Glu Ile Gly Leu Glu Arg

225 230 235 240

Gly Trp Gly Asp Asn Ala Glu Arg Val Leu Asp Met Ile Arg Leu Leu

245 250 255

Leu Asp Leu Leu Glu Ala Pro Asp Pro Cys Thr Leu Glu Thr Phe Leu

260 265 270

Gly Arg Val Pro Met Val Phe Asn Val Val Ile Leu Ser Pro His Gly

275 280 285

Tyr Phe Ala Gln Asp Asn Val Leu Gly Tyr Pro Asp Thr Gly Gly Gln

290 295 300

Val Val Tyr Ile Leu Asp Gln Val Arg Ala Leu Glu Ile Glu Met Leu

305 310 315 320

Gln Arg Ile Lys Gln Gln Gly Leu Asn Ile Lys Pro Arg Ile Leu Ile

325 330 335

Leu Thr Arg Leu Leu Pro Asp Ala Val Gly Thr Thr Cys Gly Glu Arg

340 345 350

Leu Glu Arg Val Tyr Asp Ser Glu Tyr Cys Asp Ile Leu Arg Val Pro

355 360 365

Phe Arg Thr Glu Lys Gly Ile Val Arg Lys Trp Ile Ser Arg Phe Glu

370 375 380

Val Trp Pro Tyr Leu Glu Thr Tyr Thr Glu Asp Ala Ala Val Glu Leu

385 390 395 400

Ser Lys Glu Leu Asn Gly Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser

405 410 415

Asp Gly Asn Leu Val Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr

420 425 430

Gln Cys Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Asp Ser

435 440 445

Asp Ile Tyr Trp Lys Lys Leu Asp Asp Lys Tyr His Phe Ser Cys Gln

450 455 460

Phe Thr Ala Asp Ile Phe Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr

465 470 475 480

Ser Thr Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Glu Thr Val Gly Gln Tyr

485 490 495

Glu Ser His Thr Ala Phe Thr Leu Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val His

500 505 510

Gly Ile Asp Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala

515 520 525

Asp Met Ser Ile Tyr Phe Pro Tyr Thr Glu Glu Lys Arg Arg Leu Thr

530 535 540

Lys Phe His Ser Glu Ile Glu Glu Leu Leu Tyr Ser Asp Val Glu Asn

545 550 555 560

Lys Glu His Leu Cys Val Leu Lys Asp Lys Lys Lys Pro Ile Leu Phe

565 570 575

Thr Met Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Leu Ser Gly Leu Val Glu

580 585 590

Trp Tyr Gly Lys Asn Thr Arg Leu Arg Glu Leu Ala Asn Leu Val Val

595 600 605

Val Gly Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp Asn Glu Glu Lys Ala

610 615 620

Glu Met Lys Lys Met Tyr Asp Leu Ile Glu Glu Tyr Lys Leu Asn Gly

625 630 635 640

Gln Phe Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asp Arg Val Arg Asn Gly Glu

645 650 655

Leu Tyr Arg Tyr Ile Cys Asp Thr Lys Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala

660 665 670

Leu Tyr Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly

675 680 685

Leu Pro Thr Phe Ala Thr Cys Lys Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Val

690 695 700

His Gly Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His Gly Asp Gln Ala

705 710 715 720

Ala Asp Thr Leu Ala Asp Phe Phe Thr Lys Cys Lys Glu Asp Pro Ser

725 730 735

His Trp Asp Glu Ile Ser Lys Gly Gly Leu Gln Arg Ile Glu Glu Lys

740 745 750

Tyr Thr Trp Gln Ile Tyr Ser Gln Arg Leu Leu Thr Leu Thr Gly Val

755 760 765

Tyr Gly Phe Trp Lys His Val Ser Asn Leu Asp Arg Leu Glu Ala Arg

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Ala Val Pro Leu Ala Gln Asp Asp

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<210> 3

<211> 1584

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 3

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

atggtaaatc aactacacat atttaacttc ccgttcatgg cgcaaggtca catgctccca 120

gcgctggaca tggcgaactt gtttaccagc cgtggggtca aagtgacgct gattaccacc 180

caccagcatg ttccgatgtt tacgaagagc atcgagcgct cgcgcaactc tggttttgat 240

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tctctggacc aggtttccgg tgatgacgaa atgctgccaa aatttatgcg tggtgtgaac 360

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gacatgttct tcccgtggac cactgaaagc gctgccaagt tcggcatccc gcgtctgctg 480

tttcatggtt cttgtagctt cgccttgagc gccgcggaat ctgttcgtcg taacaagccg 540

ttcgagaacg tgtctaccga taccgaagag ttcgttgtac cggacctgcc gcaccaaatc 600

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aaaatgctaa agaaagttcg tgacagcgaa tcaacgagct acggtgtggt ggttaactcg 720

ttctatgaac tggaaccgga ctacgcggac tattacatca acgtactggg ccgtaaggcg 780

tggcatatcg gccctttcct gctgtgtaat aaactgcagg cagaagataa agcacaacgt 840

ggcaaaaaaa gtgcgattga tgcagatgag tgcttaaatt ggctggatag caaacagccg 900

aacagcgtca tctatctgtg ctttggtagc atggcgaatc tgaacagcgc tcaactgcac 960

gaaattgcca ccgcgttgga gtccagcggc cagaatttta tatgggttgt gcgcaagtgc 1020

gttgatgagg agaactcttc caaatggttt ccggaaggtt tcgaggagcg taccaaagaa 1080

aaaggcctca tcattaaagg ttgggcaccg cagaccttaa tcctggagca cgagtccgtg 1140

ggtgcgtttg tcactcactg cggttggaac agcaccttgg aaggcatttg tgcaggcgtg 1200

ccgctggtta cctggccgtt cttcgcggaa caatttttca acgaaaagct gatcactgag 1260

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atcaagggcg aggcgatcgc caatgcaatt aaccgcgtga tggttggcga cgaggcagtt 1380

gagatgagaa accgtgcgaa ggaccttaag gagaaagcgc gtaaggctct ggaggaagac 1440

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<210> 4

<211> 487

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 4

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Val Lys Val Thr Leu Ile Thr Thr His Gln His Val Pro Met Phe Thr

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Lys Ser Ile Glu Arg Ser Arg Asn Ser Gly Phe Asp Ile Ser Ile Gln

50 55 60

Ser Ile Lys Phe Pro Ala Ser Glu Val Gly Leu Pro Glu Gly Ile Glu

65 70 75 80

Ser Leu Asp Gln Val Ser Gly Asp Asp Glu Met Leu Pro Lys Phe Met

85 90 95

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Ser Arg Pro His Cys Leu Leu Ser Asp Met Phe Phe Pro Trp Thr Thr

115 120 125

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130 135 140

Cys Ser Phe Ala Leu Ser Ala Ala Glu Ser Val Arg Arg Asn Lys Pro

145 150 155 160

Phe Glu Asn Val Ser Thr Asp Thr Glu Glu Phe Val Val Pro Asp Leu

165 170 175

Pro His Gln Ile Lys Leu Thr Arg Thr Gln Ile Ser Thr Tyr Glu Arg

180 185 190

Glu Asn Ile Glu Ser Asp Phe Thr Lys Met Leu Lys Lys Val Arg Asp

195 200 205

Ser Glu Ser Thr Ser Tyr Gly Val Val Val Asn Ser Phe Tyr Glu Leu

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Glu Pro Asp Tyr Ala Asp Tyr Tyr Ile Asn Val Leu Gly Arg Lys Ala

225 230 235 240

Trp His Ile Gly Pro Phe Leu Leu Cys Asn Lys Leu Gln Ala Glu Asp

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275 280 285

Gly Ser Met Ala Asn Leu Asn Ser Ala Gln Leu His Glu Ile Ala Thr

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Leu Ile Leu Glu His Glu Ser Val Gly Ala Phe Val Thr His Cys Gly

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Trp Asn Ser Thr Leu Glu Gly Ile Cys Ala Gly Val Pro Leu Val Thr

370 375 380

Trp Pro Phe Phe Ala Glu Gln Phe Phe Asn Glu Lys Leu Ile Thr Glu

385 390 395 400

Val Leu Lys Thr Gly Tyr Gly Val Gly Ala Arg Gln Trp Ser Arg Val

405 410 415

Ser Thr Glu Ile Ile Lys Gly Glu Ala Ile Ala Asn Ala Ile Asn Arg

420 425 430

Val Met Val Gly Asp Glu Ala Val Glu Met Arg Asn Arg Ala Lys Asp

435 440 445

Leu Lys Glu Lys Ala Arg Lys Ala Leu Glu Glu Asp Gly Ser Ser Tyr

450 455 460

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<211> 2418

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

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accaaatatc cggattcgga catctactgg aaaaaattcg atgaaaaata ccatttcagc 1380

tctcagttca ccgcagatct gattgctatg aaccacacgg actttattat caccagtacg 1440

ttccaggaaa tcgcgggctc caaagatacc gtgggtcaat acgaaagtca tatggccttt 1500

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cgttggatca gttcccaaat gaaccgtgtt cgcaatggcg aactgtatcg ctacatcgca 1980

gatacgaaag gtgcttttgt ccagccggcg ttttacgaag ccttcggcct gaccgtcgtg 2040

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ctgacgctgg cggccgtgta cggtttctgg aaacacgttt ctaaactgga tcgtctggaa 2340

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<211> 805

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 6

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Asp Ala Thr Leu Ala Ala His Arg Asn Glu Ile Leu Leu Phe Leu Ser

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Arg Ile Glu Ser His Gly Lys Gly Ile Leu Lys Pro His Glu Leu Leu

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Pro Tyr Met Glu Thr Phe Ile Glu Asp Val Ala Lys Glu Ile Ser Ala

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Glu Leu Gln Ala Lys Pro Asp Leu Ile Ile Gly Asn Tyr Ser Glu Gly

405 410 415

Asn Leu Ala Ala Ser Leu Leu Ala His Lys Leu Gly Val Thr Gln Cys

420 425 430

Thr Ile Ala His Ala Leu Glu Lys Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Asp Ile

435 440 445

Tyr Trp Lys Lys Phe Asp Glu Lys Tyr His Phe Ser Ser Gln Phe Thr

450 455 460

Ala Asp Leu Ile Ala Met Asn His Thr Asp Phe Ile Ile Thr Ser Thr

465 470 475 480

Phe Gln Glu Ile Ala Gly Ser Lys Asp Thr Val Gly Gln Tyr Glu Ser

485 490 495

His Met Ala Phe Thr Met Pro Gly Leu Tyr Arg Val Val His Gly Ile

500 505 510

Asn Val Phe Asp Pro Lys Phe Asn Ile Val Ser Pro Gly Ala Asp Ile

515 520 525

Asn Leu Tyr Phe Ser Tyr Ser Glu Thr Glu Lys Arg Leu Thr Ala Phe

530 535 540

His Pro Glu Ile Asp Glu Leu Leu Tyr Ser Asp Val Glu Asn Asp Glu

545 550 555 560

His Leu Cys Val Leu Lys Asp Arg Thr Lys Pro Ile Leu Phe Thr Met

565 570 575

Ala Arg Leu Asp Arg Val Lys Asn Leu Thr Gly Leu Val Glu Trp Tyr

580 585 590

Ala Lys Asn Pro Arg Leu Arg Gly Leu Val Asn Leu Val Val Val Gly

595 600 605

Gly Asp Arg Arg Lys Glu Ser Lys Asp Leu Glu Glu Gln Ala Glu Met

610 615 620

Lys Lys Met Tyr Glu Leu Ile Glu Thr His Asn Leu Asn Gly Gln Phe

625 630 635 640

Arg Trp Ile Ser Ser Gln Met Asn Arg Val Arg Asn Gly Glu Leu Tyr

645 650 655

Arg Tyr Ile Ala Asp Thr Lys Gly Ala Phe Val Gln Pro Ala Phe Tyr

660 665 670

Glu Ala Phe Gly Leu Thr Val Val Glu Ala Met Thr Cys Gly Leu Pro

675 680 685

Thr Phe Ala Thr Asn His Gly Gly Pro Ala Glu Ile Ile Val His Gly

690 695 700

Lys Ser Gly Phe His Ile Asp Pro Tyr His Gly Glu Gln Ala Ala Asp

705 710 715 720

Leu Leu Ala Asp Phe Phe Glu Lys Cys Lys Lys Asp Pro Ser His Trp

725 730 735

Glu Thr Ile Ser Met Gly Gly Leu Lys Arg Ile Glu Glu Lys Tyr Thr

740 745 750

Trp Gln Ile Tyr Ser Glu Ser Leu Leu Thr Leu Ala Ala Val Tyr Gly

755 760 765

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Pro Leu Ala Ala Glu

805

<210> 7

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 7

atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60

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cagcaagaag tgctggcgca tggcgcgatt ggcgcgtttt ggacccactc cggttggaac 1140

tcaacgctgg aatcggtttg tgaaggtgtc ccgatgattt tctcagattt tggcctggac 1200

cagccgctga atgcacgtta tatgtcggat gttctgaaag tcggtgtgta cctggaaaac 1260

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<210> 8

<211> 458

<212> PRT

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 8

Met Glu Asn Lys Thr Glu Thr Thr Val Arg Arg Arg Arg Arg Ile Ile

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Leu Phe Pro Val Pro Phe Gln Gly His Ile Asn Pro Ile Leu Gln Leu

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Ala Asn Val Leu Tyr Ser Lys Gly Phe Ser Ile Thr Ile Phe His Thr

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Asn Phe Asn Lys Pro Lys Thr Ser Asn Tyr Pro His Phe Thr Phe Arg

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Gly Ala Asp Glu Leu Arg Arg Glu Leu Glu Leu Leu Met Leu Ala Ser

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130 135 140

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Phe Asp Glu Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Asp Asp Lys Thr Arg Leu Glu

165 170 175

Glu Gln Ala Ser Gly Phe Pro Met Leu Lys Val Lys Asp Ile Lys Ser

180 185 190

Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Ile Leu Lys Glu Ile Leu Gly Lys Met Ile

195 200 205

Lys Gln Thr Lys Ala Ser Ser Gly Val Ile Trp Asn Ser Phe Lys Glu

210 215 220

Leu Glu Glu Ser Glu Leu Glu Thr Val Ile Arg Glu Ile Pro Ala Pro

225 230 235 240

Ser Phe Leu Ile Pro Leu Pro Lys His Leu Thr Ala Ser Ser Ser Ser

245 250 255

Leu Leu Asp His Asp Arg Thr Val Phe Gln Trp Leu Asp Gln Gln Pro

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Pro Ser Ser Val Leu Tyr Val Ser Phe Gly Ser Thr Ser Glu Val Asp

275 280 285

Glu Lys Asp Phe Leu Glu Ile Ala Arg Gly Leu Val Asp Ser Lys Gln

290 295 300

Ser Phe Leu Trp Val Val Arg Pro Gly Phe Val Lys Gly Ser Thr Trp

305 310 315 320

Val Glu Pro Leu Pro Asp Gly Phe Leu Gly Glu Arg Gly Arg Ile Val

325 330 335

Lys Trp Val Pro Gln Gln Glu Val Leu Ala His Gly Ala Ile Gly Ala

340 345 350

Phe Trp Thr His Ser Gly Trp Asn Ser Thr Leu Glu Ser Val Cys Glu

355 360 365

Gly Val Pro Met Ile Phe Ser Asp Phe Gly Leu Asp Gln Pro Leu Asn

370 375 380

Ala Arg Tyr Met Ser Asp Val Leu Lys Val Gly Val Tyr Leu Glu Asn

385 390 395 400

Gly Trp Glu Arg Gly Glu Ile Ala Asn Ala Ile Arg Arg Val Met Val

405 410 415

Asp Glu Glu Gly Glu Tyr Ile Arg Gln Asn Ala Arg Val Leu Lys Gln

420 425 430

Lys Ala Asp Val Ser Leu Met Lys Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Ser Leu

435 440 445

Glu Ser Leu Val Ser Tyr Ile Ser Ser Leu

450 455

Claims

1.一种生物法催化合成姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷化合物的方法，其特征在于，使用能表达蔗糖合成酶AtSUS1和糖基转移酶CaUGT2的重组大肠杆菌催化姜黄素生成姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷，所述蔗糖合成酶AtSUS1基因序列如SEQ ID NO:1所示；所述糖基转移酶CaUGT2基因序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述一种生物法催化合成姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷化合物的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌是在Nco I和EcoR I 插入蔗糖合成酶Atsus1基因，在Xho I和NdeI插入糖基转移酶基因CaUGT2，构建共表达重组质粒pRSF-CaUGT2-AtSUS1，后转化至宿主细胞大肠杆菌中得到重组菌。

3.根据权利要求1所述一种生物法催化合成姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)、将重组菌株活化，转接到LB培养基中，放入摇床中于25～40°C、100～300rpm，至其OD₆₀₀达到0.4～0.8，添加诱导剂诱导培养，低温离心并收集菌体，菌体重悬于适量缓冲液并破碎，离心收集上清液即为粗酶液；

2）、在催化反应体系中加入姜黄素，蔗糖和粗酶液，反应5-30h，甲醇灭活，离心得上清即为姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷。

4.根据权利要求3所述的一种生物法催化合成姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷化合物的方法，其特征在于，所述诱导剂为乳糖或异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，用量为0.1～1.0mM，诱导时间为20～48h。

5.根据权利要求3所述的一种生物法催化合成姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷化合物的方法，其特征在于，姜黄素的浓度为1mM～100mM；蔗糖浓度为3mM～1M；粗酶添加量为3g/L～10g/L。

6.一种重组质粒，其特征在于，所述质粒同时连接有蔗糖合成酶AtSUS1基因和糖基转移酶CaUGT2基因，所述蔗糖合成酶AtSUS1基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；糖基转移酶CaUGT2基因，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

7.一种催化姜黄素的重组菌，其特征在于，所述重组菌能共表达蔗糖合成酶AtSUS1和糖基转移酶CaUGT2，所述蔗糖合成酶AtSUS1基因，其优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述糖基转移酶CaUGT2基因，其优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述重组菌能催化姜黄素生成姜黄素单糖苷和姜黄素双糖苷。