CN106543243A - 一种红景天苷衍生物及其制备方法 - Google Patents

一种红景天苷衍生物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种红景天苷衍生物及其制备方法，包括如下步骤：(1)将产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株经活化培养和产酶发酵培养制得发酵培养液，离心收集上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶粗酶；(2)采用磷酸缓冲液配制反应体系，以淀粉和红景天苷为反应底物；(3)将反应体系反应后，煮沸终止反应，离心，取上清液；(4)将上清液，经分离、干燥后，制得红景天苷衍生物。该方法底物便宜，反应快速，操作简便，省时省力，生产成本低，应用前景广阔。

Description

一种红景天苷衍生物及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种红景天苷衍生物及其制备方法，特别涉及一种利用环糊精葡萄糖基转移酶合成葡萄糖基红景天苷的方法，属于糖工程技术领域。
技术背景
红景天苷天然存在于药用植物红景天中，其化学结构是对羟基苯乙基-O-β-D-葡萄糖苷，具有重要的药理学功能，具有神经保护、心血管保护、延缓衰老、抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、抗微波辐射等方面的作用，在中药及护肤品等中均有添加，应用潜力巨大。
药物分子的糖基化修饰能改进药理学功能，也是开发新药的有效途径之一。酶法糖基化药物分子简便快速，能催化糖基供体和糖基受体底物一步合成糖苷，底物便宜，环境友好。环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，EC 2.4.1.19)是一种重要的non-Leloir型糖基转移酶，能够以廉价的淀粉为糖基供体底物，对糖基受体进行葡萄糖基化修饰，效率高，成本低。目前尚未有酶法糖基化修饰红景天苷的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种新的红景天苷衍生物及其制备方法。
一种红景天苷衍生物，命名为：对羟基苯乙基-O-β-葡萄糖基-1,4-α-葡萄糖苷，分子式为C20H30O12，化学结构式如下：
上述红景天苷衍生物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株经活化后，接种于产酶培养基中，在30～45℃的条件下培养16～96小时，固液分离，收集上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶粗酶；
所述产酶培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 7g、可溶性淀粉3g，水定容至1L，pH 7.0；按常规方法配制，115℃灭菌30分钟；
所述产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株选自：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6699、浸麻芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)ATCC 8509、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)ATCC 4516或嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)ATCC12978；
(2)采用磷酸缓冲液配制可溶性淀粉浓度为0.01～0.05mg/mL、红景天苷浓度为0.01～0.05M、环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液的添加量为2230～11150U/mL的反应体系；
(3)将步骤(1)制得的反应体系于30～50℃水浴中反应5～8h，煮沸终止反应，10000～12000转/分钟离心20分钟，取上清液；
(4)将步骤(3)制得的上清液，经分离、干燥后，制得红景天苷衍生物。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，所述活化为在30～45℃的条件下于活化培养基中活化培养10～15小时；
所述活化培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 7g，水定容至1L，pH 7.0。配制方法按常规要求，115℃灭菌30分钟。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中，接种量为产酶培养基体积的1～10％。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的固液分离为在10000～12000转/分的条件下离心25～30分钟。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株选自枯草芽孢杆菌ATCC 6699。上述ATCC为美国标准生物品收藏中心菌种保藏中心缩写。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的磷酸缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液；根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中的缓冲液为50mM、pH7.0的磷酸钾缓冲液。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的反应条件为50℃水浴反应7小时。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸10分钟。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中的分离为用规格15mm ID×100cm的Bio-gelP2色谱柱进行色谱分离，以水为流动相，样品上样量为1～2mL，洗脱流速为0.2～0.3mL/分钟，收集洗脱样品，薄层层析检测，合并迁移距离相同的糖苷产物。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(4)中，样品上样量为1mL，洗脱流速为0.2mL/分钟。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(4)中，所述薄层层析检测的步骤如下：
薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。
最优的，所述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂含有体积百分比为20％的硫酸和质量浓度为0.5％的3,5-二羟基甲苯。
有益效果
1、本发明提供了一种新的红景天苷衍生物及其合成方法，采用环糊精葡萄糖基转移酶以廉价可溶性淀粉为糖基供体、红景天苷为糖基受体，一步合成对羟基苯乙基-O-β-葡萄糖基-1,4-α-葡萄糖苷，在新药筛选方面有潜在的应用价值；
2、本发明所述合成方法，底物便宜，反应快速，条件温和，产物分离纯化简单，操作简便，比化学法合成省时省力，大大降低了生产成本，应用前景广阔。
附图说明
图1为红景天苷衍生物的质谱图；
图2为红景天苷衍生物的氢谱；
图3为红景天苷衍生物的碳谱；
图4为红景天苷衍生物的氢氢相关图谱；
图5为红景天苷衍生物的碳氢直接相关图谱；
图6为红景天苷衍生物的碳氢远程相关图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例
一种红景天苷衍生物及其制备方法，步骤如下：
1.环糊精葡萄糖基转移酶粗酶的制备
按如下方法制备环糊精葡萄糖基转移酶粗酶。
将产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株枯草芽孢杆菌ATCC 6699接种于活化培养基中，在37℃活化培养12h，然后按体积比2％的接种量接种于产酶培养基中，在37℃的条件下培养96小时，培养液以10000转/分的速度，离心30分钟，收集上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶粗酶。
上述活化培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 7g，水定容至1L，pH 7.0。配制方法按常规要求，115℃灭菌30分钟。
产酶培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 7g、可溶性淀粉3g，水定容至1L，pH 7.0；按常规方法配制，115℃灭菌30分钟；
2.环糊精葡萄糖基转移酶催化合成红景天苷衍生物
用pH 7.0、50mM磷酸钾缓冲液配制反应体系1mL，可溶性淀粉终浓度为0.03mg/mL，红景天苷终浓度为0.02M，酶的添加量为6690U/mL。在50℃反应7小时后，100℃煮沸10分钟，终止反应。将煮沸后的反应液12000转/分钟离心20分钟，上清液样品经薄层层析检测后，通过软件Image J(http://imagej.en.softonic.com/)分析红景天苷衍生物的产率约为30.7％。
3.红景天苷衍生物的纯化
将上述步骤2所得上清液用0.22μm滤膜过滤后，吸取1mL，用Bio-gel P2色谱柱(15mm ID×100cm)分离，以水为流动相，流速0.2mL/分钟，收集洗脱样品，薄层层析检测，合并迁移距离相同的红景天苷转糖基产物，冷冻干燥后制得红景天苷衍生物的粉末。
所述薄层层析检测步骤如下：
薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。
所述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂含有体积百分比为20％的硫酸和质量浓度为0.5％的3,5-二羟基甲苯；
4.红景天苷衍生物的结构鉴定
取上述红景天苷衍生物的粉末加水稀释后进行质谱分析，目标产物的特征分子离子峰[M-H]-为m/z 461.15(如图1所示)，判断产物分子量约为462，与预期产物分子量一致。
将3mg红景天苷衍生物的粉末溶于氘代水中，进行核磁解析，综合氢谱(如图2所示)、碳谱(如图3所示)、氢氢相关谱(COSY)(如图4所示)、碳氢直接相关谱(HSQC)(如图5所示)、碳氢远程相关谱(HMBC)(如图6所示)，确定各位置碳氢的化学位移和偶合常数，鉴定新合成的产物结构为对羟基苯乙基-O-β-葡萄糖基-1,4-α-葡萄糖苷。氢谱上化学位移5.22ppm可观测到非还原端葡萄糖基异头质子的特征双峰信号，偶合常数为3.9Hz，推断葡萄糖基通过α-糖苷键与红景天苷分子相连，在HMBC图中可以观测到红景天苷葡萄糖基的C-4′(δ76.53)与非还原端葡萄糖异头质子H-1″(δ5.22)存在耦合信号，证实了α-1,4-葡萄糖苷键的存在。
上述质谱分析所用仪器为岛津LCMS-IT-TOF质谱仪(日本)；核磁分析所用仪器为Agilent DD2 600MHz核磁共振波谱仪(美国)。

Claims (10)

1.一种红景天苷衍生物，其特征在于，命名为：对羟基苯乙基-O-β-葡萄糖基-1,4-α-葡萄糖苷，分子式为C20H30O12，化学结构式如下：
2.如权利要求1所述红景天苷衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株经活化后，接种于产酶培养基中，在30～45℃的条件下培养16～96小时，固液分离，收集上清液，即为环糊精葡萄糖基转移酶粗酶；
所述产酶培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 7g、可溶性淀粉3g，水定容至1L，pH 7.0；
所述产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株选自：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC6699、浸麻芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)ATCC 8509、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)ATCC 4516或嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)ATCC12978；
(2)采用磷酸缓冲液配制可溶性淀粉浓度为0.01～0.05mg/mL、红景天苷浓度为0.01～0.05M、环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液的添加量为2230～11150U/mL的反应体系；
(3)将步骤(1)制得的反应体系于30～50℃水浴中反应5～8h，煮沸终止反应，10000～12000转/分钟离心20分钟，取上清液；
(4)将步骤(3)制得的上清液，经分离、干燥后，制得红景天苷衍生物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述活化为在30～45℃的条件下于活化培养基中活化培养10～15小时；
所述活化培养基，每升组分如下：
蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 7g，水定容至1L，pH 7.0；
优选的，所述步骤(1)中，接种量为产酶培养基体积的1～10％。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的固液分离为在10000～12000转/分的条件下离心25～30分钟；
优选的，所述步骤(1)中产环糊精葡萄糖基转移酶的菌株选自枯草芽孢杆菌ATCC6699。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的磷酸缓冲液为浓度10～100mM，pH6～8的磷酸钾缓冲溶液；
根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中的缓冲液为50mM、pH7.0的磷酸钾缓冲液。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的反应条件为50℃水浴反应7小时；
优选的，所述步骤(3)中的煮沸终止反应条件为100℃煮沸10分钟。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的分离为用规格15mm ID×100cm的Bio-gel P2色谱柱进行色谱分离，以水为流动相，样品上样量为1～2mL，洗脱流速为0.2～0.3mL/分钟，收集洗脱样品，薄层层析检测，合并迁移距离相同的糖苷产物。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，样品上样量为1mL，洗脱流速为0.2mL/分钟。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，所述薄层层析检测的步骤如下：
薄层层析板点样后在展层剂中展开，雾喷显色剂后，于120℃烘烤5分钟使糖斑点显色。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述展层剂由正丁醇、无水乙醇和水按体积比5：3：2混合配制；显色剂含有体积百分比为20％的硫酸和质量浓度为0.5％的3,5-二羟基甲苯。
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