CN102876582A

CN102876582A - 金龟子绿僵菌突变株及其在甾体化合物羟化反应中的应用

Info

Publication number: CN102876582A
Application number: CN2011101995507A
Authority: CN
Inventors: 叶丽; 冯美卿; 史济平
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-07-15
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2031-07-15
Also published as: CN102876582B

Abstract

本发明属微生物及化学合成领域，具体涉及一株金龟子绿僵菌突变株Metarhizium anisopliae11490及其在甾体化合物羟化反应中的应用，所述的金龟子绿僵菌突变株于2011年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC M 2011240。采用所述的突变株进行羟化反应，包括斜面培养，种子培养，扩大培养，甾体转化，产物分离等步骤。该突变株能在甾体化合物19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄甾-4-烯-3，17-二酮及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮上有效的引入11α羟基，具有广泛的甾体底物选择性。本发明的方法具有转化率高、无污染、培养方法简单易操作的优点，能为甾体药物合成提供关键中间体，具有很大的应用前景。

Description

金龟子绿僵菌突变株及其在甾体化合物羟化反应中的应用

技术领域

本发明属微生物及化学合成领域，涉及金龟子绿僵菌突变株及其应用，具体的说，涉及一株金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490及其在甾体化合物羟化反应中的应用，所述的金龟子绿僵菌突变株能在甾体化合物母核上引入11α羟基。

背景技术

甾体药物应用广泛、需求量大，其化学合成通常涉及多步复杂反应以及有毒有害物质的使用。而微生物转化反应通常在常温常压下进行，相比于化学反应具有专一性强、污染少和产率高的优点，因此甾体制药工业通常利用两者的优势配合使用。1952年美国普强药厂的Murray和Peterson首次利用黑根霉在黄体酮上引入11α羟基，人们开始认识到微生物转化反应在甾体药物生产中的重要性。此后，相继报道了多种甾体微生物转化反应，主要有羟基化、Δ¹-脱氢和甾醇边链降解等，这些反应为甾体药物的化学合成提供关键中间体。

羟化反应是甾体微生物转化反应中最重要的反应，微生物能在甾体母核的任何位置进行羟化反应，而化学方法除了较易在C₁₇引入羟基外，在其它位置都很难引入。甾体微生物羟化反应无论在其多样性或重要性方面都是独特的，因为它能达到其它方法不能达到的部位。其中甾体11α羟化反应在甾体制药工业上应用广泛，在甾体母核上引入11α羟基能增加甾体药物的抗炎活性。有研究公开了19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，1-二酮(GD)的11α羟化衍生物是制备新型口服避孕药地索高诺酮(Desogestrel)的关键中间体；另外，雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)的11α羟基衍生物是制备依普利酮(Eplerenone，商品名Inspra，第一个获准上市的选择性醛固酮受体阻断剂)的关键中间体。美国专利(US20050234251A1)采用一株棕曲霉Aspergillus ochraceous在地索高诺酮合成前体19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮上引入11α羟基。有研究报道采用金龟子绿僵菌野生菌株928或610在19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，1-二酮上引入11α羟基，投料浓度0.2％时转化率为36％；野生菌株经过UV-LiCl联合诱变后获得能在雄甾-4-烯-3，17-二酮上引入11α羟基的突变株M28-203。

发明内容

本发明目的是提供金龟子绿僵菌突变株及其应用，具体涉及一株金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490及其在甾体化合物羟化反应中的应用，尤其是在甾体化合物11α羟化反应中的应用。

本发明在提供了一株金龟子绿僵菌突变株，该突变株能在19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄甾-4-烯-3，17-二酮及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮上有效的引入11α羟基。所述的金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490于2011年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国，武汉)，保藏号为：CCTCC M 2011240。

本发明所述的金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490CCTCC M2011240经鉴定，具有如下生物学特征：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，28℃培养4～5天，菌落边沿整齐，平展，最初白色，7～10天呈橄榄石灰色。分生孢子梗短而直，分枝或单生；从气生菌丝长出，然后形成分生孢子链，链横向粘聚成壳状覆盖在分生孢子座上，孢子脱落常聚成黑色块状物结构。在液体摇瓶生长培养时，呈分叉状大型营养菌丝，进而能形成大型分叉状芽生孢子，最终出现卵圆形或鞋底形分生孢子，大小为2.5～3.75×5.6～8.0μm。

本发明进一步提供了金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490在甾体化合物羟化反应中的应用。

具体而言，本发明提供了一种新的甾体化合物11α羟化反应方法，其特征在于：在甾体化合物上引入11α羟基，其包括步骤：

(1)菌种选择：金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490CCTCC M2011240；

(2)斜面培养：将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基，其中添加质量百分比为0.25％的蚕蛹粉，26～30℃培养5～10天；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于装有40mL液体培养基的250mL摇瓶中，26～30℃条件下，旋转式摇床220r/min培养24～60小时，制得种子液，

所述的培养基中，含质量百分比1～3％的葡萄糖、1～3％的黄豆粉、0.25～1％的蚕蛹粉，pH6.0～7.0；

(4)扩大培养：以5～15％的体积比的接种量将种子液接种于步骤(3)所述的液体培养基中，26～30℃条件下，旋转式摇床220r/min培养24～60小时，得发酵液；

(5)甾体转化：将待转化的甾体底物预先溶于含质量百分比为1％的吐温80中，超声粉碎30分钟，按质量百分比1～3％的投料量投入经步骤(4)培养获得好的发酵液中，26～30℃条件下，旋转式摇床220r/min转化48～96小时，得发酵液；

(6)分离产物：将步骤(5)所得的发酵液经离心过滤除去菌体后，滤液用1/2体积乙酸乙酯提取3次，合并抽提液，经减压浓缩，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析后的甾体底物11α羟基衍生物，所得菌体用乙酸乙酯浸泡后回收未转化甾体底物。

本发明中，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的菌种培养和转化温度优选为28℃。

本发明中，步骤(3)、(4)中所述的葡萄糖的浓度优选质量百分比为3％，黄豆粉的浓度优选质量百分比为2％，蚕蛹粉的浓度优选质量百分比为0.5％。

本发明中，步骤(3)、(4)中所述菌体培养时间优选是44～50小时。

本发明中，步骤(3)、(4)中所述菌体培养pH值优选为6.5。

本发明中，步骤(5)所述待转化的甾体底物包括但不限于19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮、雄甾-4-烯-3，17-二酮及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮。

本发明中，步骤(5)所述底物投料量优选为质量百分比2％。

本发明中，步骤(5)所述转化时间优选为66～78小时。

在上述利用金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490进行甾体化合物11α羟化反应的方法中，步骤(2)、(3)、(4)、(5)中所述的液体培养基为添加葡萄糖、黄豆粉和蚕蛹粉的无机盐培养基，其配方为：

每1000mL蒸馏水中添加：葡萄糖30g、黄豆粉20g、蚕蛹粉5g、硫酸氨2.5g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁0.5g、硫酸亚铁0.02g。

上述步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养基于121℃条件下灭菌20分钟后使用。

经试验鉴定，本发明的金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490能有效的在甾体化合物上引入11α羟基，并且转化产物和未转化底物分别存在于发酵上清液和菌体中，便于分别进行产物分离和回收底物；而现有技术利用化学方法很难在甾体母核上引入11α羟基。本发明提供的甾体化合物11α羟化反应方法具有转化效率高、发酵和转化条件简单、无污染和分离纯化方便等优点，可为甾体药物合成提供关键中间体，适合产业化应用。

比较现有技术采用金龟子绿僵菌野生型菌株610或928在甾体化合物19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮上引入11α羟基(转化率36％)的报道，本发明所述的金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490不仅能在19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮上引入11α羟基，且转化率更高达50％，并且也能在雄甾-4-烯-3，17-二酮及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮上有效的引入11α羟基，具有更广泛的底物选择性，而且培养条件更加简单，操作方便。

附图说明

图1是金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490CCTCC M 2011240在PDA平板上的形态。

图2是金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490CCTCC M 2011240对19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮的11α羟化产物薄层扫描图谱，其中峰1为产物，Rf为0.30；峰2为底物，Rf为0.50。

图3是金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490CCTCC M 2011240对雄甾-4-烯-3，17-二酮的11α羟化产物HPLC图谱，其中峰1为产物，峰2为底物。

具体实施方式

实施例1：筛选金龟子绿僵菌突变株

采用硫酸二乙酯和紫外线对出发菌株金龟子绿僵菌野生型菌株610进行联合诱变筛选。

硫酸二乙酯处理：

工作原液：0.05mL硫酸二乙酯(DES)溶于少量无水乙醇内，再加入适量0.25MTris-HCl pH7.2缓冲液，使其浓度为0.5％。

菌液：5mL无菌水洗下斜面孢子，转移至盛有5mL无菌水和玻璃珠的三角烧瓶内，振摇40min，用脱脂棉过滤备用。

取DES工作原液7mL和3mL菌液，于无菌试管内混合，最后浓度为0.35％，28℃振摇8h，稀释涂皿，摇瓶筛选活力高的单菌落斜面保存。

紫外线(UV)处理：

取4mL0.3％的吐温80溶液，加入斜面刮下孢子，转移至盛有30mL0.3％吐温80和玻璃珠的三角瓶内，置旋转式摇床250r/min条件下，振荡15min，桑皮纸过滤备用。将上述菌液进行不同时间UV处理(距离30cm，电磁搅拌)，取样进行系列稀释，采用固体稀释法进行活细胞平板计数。计算公式为：存活率(％)＝照射后每毫升活细胞数/照射前每毫升活细胞数。细胞致死率为95～99％时，正突变率最高。因此采用紫外照射3min，细胞致死率为99％的条件进行诱变育种。将诱变后的菌液经稀释调整浓度，涂于含0.1％氯化锂的平板上，置27℃黑暗条件下，培养7～10天，经摇瓶初筛、复筛、精筛，获得一株11α羟化能力强的金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490，斜面保存；该突变株于2011年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国，武汉)，保藏号为：CCTCC M 2011240。

实施例2 金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490CCTCC M 2011240的特征和稳定性

经过形态学观察的特征为：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，28℃培养4～5天，菌落边沿整齐，平展，最初白色，7～10天呈橄榄石灰色。分生孢子梗短而直，分枝或单生。从气生菌丝长出，然后形成分生孢子链，链横向粘聚成壳状覆盖在分生孢子座上，孢子脱落常聚成黑色块状物结构。在液体摇瓶生长培养时，呈分叉状大型营养菌丝，进而能形成大型分叉状芽生孢子，最终出现卵圆形或鞋底形分生孢子，大小为2.5～3.75×5.6～8.0μm。

根据形态学观察，筛选到的具有甾体化合物11α羟化活性的菌株为绿僵菌属的菌株。

实验结果比较，其对19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮的11α羟化转化率为50％，比出发菌株高约14％，该高转化率的绿僵菌属菌株为金龟子绿僵菌突变株。

金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490经连续4次传代，经种子、发酵、转化，测定其转化率，从结果可知，菌种代数之间菌体重量与转化率变化不大，说明该突变株性状稳定。

甾体底物经突变株转化后，将发酵全液、上清液及菌体经乙酸乙酯抽提后TLC分析，证明转化产物分泌到胞外，而未作用的底物留在菌体内部，因此菌体和上清液可以分别进行目的性分离。

实施例3 金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490CCTCC M 2011240对19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮的11α羟化反应

(2)斜面培养：将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，其中添加质量百分比为0.25％的蚕蛹粉，28℃培养7天；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1环于装有40mL液体培养基(含质量百分比3％的葡萄糖、2％的黄豆粉、0.5％的蚕蛹粉，pH6.5)的250mL摇瓶中，28℃条件下，旋转式摇床220r/min培养48小时，制得种子液；

(4)扩大培养：以10％的体积比的接种量将种子液接种于质量百分比为3％的葡萄糖、2％的黄豆粉、0.5％的蚕蛹粉，pH6.5的液体培养基中，28℃条件下，旋转式摇床220r/min培养48小时；

(5)甾体转化：将待转化的甾体底物19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮预先溶于含质量百分比为1％的吐温80中，超声粉碎30分钟，按质量百分比2％的投料量投入经步骤(4)培养好的发酵液中，28℃条件下，旋转式摇床220r/min转化72小时。

(6)产物分析：取发酵液2mL加入1mL乙酸乙酯浸泡，取有机相点样与GF254硅胶板，展开剂(石油醚∶丙酮7∶4)层析分离后，薄层扫描分析产物含量，转化率达50％，发酵液的薄层扫描色谱图如图2所示。

(7)分离产物：将步骤(5)所得的发酵液经离心过滤除去菌体后，滤液用1/2体积乙酸乙酯提取3次，合并抽提液，经减压浓缩，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析后的甾体底物11α羟基衍生物，所得菌体用乙酸乙酯浸泡后回收未转化甾体底物。

实施例4 金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490CCTCC M 2011240对雄甾-4-烯-3，17-二酮的11α羟化反应

(1)菌种选择：金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490CCTCC M 2011240；

(4)扩大培养：以15％的体积比的接种量将种子液接种于质量百分比为3％的葡萄糖、2％的黄豆粉、0.5％的蚕蛹粉，pH6.5的液体培养基中，28℃条件下，旋转式摇床220r/min培养44小时；

(5)甾体转化：将待转化的甾体底物雄甾-4-烯-3，17-二酮预先溶于含质量百分比为1％的吐温80中，超声粉碎30分钟，按质量百分比2％的投料量投入经步骤(4)培养好的发酵液中，28℃条件下，旋转式摇床220r/min转化72小时。

(6)发酵液用1/2体积乙酸乙酯抽提，取30mL乙酸乙酯提取液，减压蒸干后，用5mL甲醇溶解，将溶解液高速(12000r/min)离心10min。准确移吸取上清液1mL，用甲醇稀释30倍，0.45μm滤膜过滤，作为测定样液进行HPLC分析，选择C₁₈(Waters Symmetry，4.6mm×150mm，5μm)柱，甲醇∶水4∶1作为流动相，流速为0.7mL/min，检测波长254nm，柱温30℃。底物与产物保留时间分别为7.5min和5.5min，转化率为60％。发酵液的HPLC图谱如图3所示。

实施例5 金龟子绿僵菌突变株(Metarhizium anisopliae)11490CCTCC M 2011240对雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮的11α羟化反应

(5)甾体转化：将待转化的甾体底物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮预先溶于含质量百分比为1％的吐温80中，超声粉碎30分钟，按质量百分比2％的投料量投入经步骤(4)培养好的发酵液中，28℃条件下，旋转式摇床220r/min转化72小时。

(6)产物分析：取发酵液2mL加入1mL乙酸乙酯浸泡，取有机相点样与GF254硅胶板，展开剂(石油醚∶丙酮7∶4)层析分离后，薄层扫描分析产物含量，转化率达40％。

Claims

1.金龟子绿僵菌突变株，其特征在于：该菌株为金龟子绿僵菌突变株(Metarhiziumanisopliae)11490，保藏号为CCTCC M 2011240，保藏日期为2011年7月7日。

2.如权利要求1所述的金龟子绿僵菌突变株，其特征在于，其具有如下生物学特征：

马铃薯葡萄糖琼脂培养基PDA上，28℃培养4～5天，菌落边沿整齐，平展，最初白色，7～10天呈橄榄石灰色；分生孢子梗短而直，分枝或单生，从气生菌丝长出，然后形成分生孢子链，链横向粘聚成壳状覆盖在分生孢子座上，孢子脱落聚成黑色块状物结构；液体摇瓶生长培养中，呈分叉状大型营养菌丝，能形成大型分叉状芽生孢子，最终出现卵圆形或鞋底形分生孢子，大小为2.5～3.75×5.6～8.0μm。

3.权利要求1或2所述的金龟子绿僵菌突变株在甾体化合物11α羟化反应中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的甾体化合物包括但不限于19-去甲基-13-乙基-雄甾-4-烯-3，17-二酮或雄甾-4-烯-3，17-二酮及雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮。

5.一种甾体化合物11α羟化反应方法，其特征在于：采用权利要求1的金龟子绿僵菌突变株在甾体化合物上引入11α羟基，其包括步骤：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)、(3)、(4)或(5)中的菌种培养或转化温度为28℃。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)或(4)中的培养基中，含葡萄糖的浓度质量百分比为3％，黄豆粉的浓度质量百分比为2％，蚕蛹粉的浓度质量百分比为0.5％。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)或(4)中菌体培养时间为44～50小时。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)或(4)中菌体培养pH值为6.5。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中底物投料量为质量百分比2％。

11.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)中转化时间为66～78小时。