CN101285048B - 类球红细菌突变株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种类球红细菌突变株。该突变株在发酵生产辅酶Q10时能够减少分离层析填料的用量，从而降低生产成本。该菌株还能够提高辅酶Q10的产量。

Description

类球红细菌突变株及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种类球红细菌突变株。本发明还涉及所述突变株在生产辅酶Q10方面的应用。

背景技术

类球红细菌1.1737可用于生产辅酶Q10。但在从该菌的发酵液提取辅酶Q10时，需要用层析方法吸附色素等水溶性物质。由于该菌的发酵液为深红色，要耗费较大量的层析填料用于脱色，层析所用的填料用量多少与生产辅酶Q10的成本相关。如果能够得到色泽较浅的类球红细菌发酵液，则可减少层析填料的用量，直接降低辅酶Q10的生产成本。

此外，类球红细菌1.1737生产辅酶Q10的产量不高，通常摇瓶发酵水平仅达到20-25ppm。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的菌株，在发酵生产辅酶Q10时能够减少脱色用的层析填料的用量，而降低生产成本。本发明的另一目的是提供的菌株能够提高辅酶Q10产量。

本发明将出发菌株——类球红细菌1.1737随航天育种卫星回收舱在太空飞行15天，从回收样品中筛选得到了一株类球红细菌突变株，达到了本发明的目的。

该突变株命名为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)space QG 1.1737-168 CGMCCNo.2359。

该突变株的菌种已经在国家知识产权局指定的保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.2359，保藏时间：2008年1月25日。

所述的类球红细菌突变株的培养条件为：

(1)固体培养基(％)：葡萄糖0.2，牛肉膏0.3，鱼蛋白胨1.0，酵母膏0.5，氯化钠0.5，琼脂粉1.5，pH7.0。

(2)种子液(％)：葡萄糖2.0，鱼蛋白胨1.0，酵母粉1.0，，氯化钠0.5，碳酸钙0.5，pH7.2。500毫升三角瓶分装，8层纱布封口灭菌。

(3)发酵液(％)：葡萄糖2.7，白砂糖2.0，玉米浆4.0，硫酸铵0.8，磷酸二氢钾0.05，磷酸氢二钾0.05，硫酸镁0.025。500毫升三角瓶分装，8层纱布封口灭菌。

(4)固体培养条件：菌种接种到带有固体培养基的培养皿或试管中，于28-37℃培养2-7天。

(5)种子液培养条件：用无菌接种环从培养皿或斜面中取菌体适量，接种到已灭菌的种子液中，28-37℃，220rpm摇床培养24-48小时。

(6)发酵培养条件：按照2-10％接种比例，将培养好种子液接种到发酵培养基中，28-37℃，150-250rpm摇床培养3-8天。

本发明的类球红细菌(Rhodobactersphaeroides space QG 1.1737-168)具有如下性质：

1.形态特征：

革兰氏阴性球菌，显微镜下如图1所示，多为单体存在。

2.与出发菌株在专用固体培养基上的菌落特征比较：

本发明的类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides space QG 1.1737-168)在类球红细菌专用培养基上菌落呈乳白色，圆形有凸起，表面湿润有光泽，边缘整齐(见图2)。

而出发菌株——类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides 1.1737)在类球红细菌专用培养基上菌落呈深粉红色(见图3)。

3.生理生化特征

该菌株为微好氧菌，革兰氏阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，脲酶阴性，半乳酶阴性，不产生H2S，不能还原硝酸盐。

4.碳源利用

能以蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖等为碳源；不能利用鼠李糖、密二糖、精氨酸、色氨酸、赖氨酸木糖等为碳源。

5.和出发菌株在麦芽糖利用方面的比较

类球红细菌space QG 1.1737-168不能利用麦芽糖，而类球红细菌1.1737能利用麦芽糖。

6.在辅酶Q10生产中的比较

出发菌株发酵生产辅酶Q10的发酵液为深红色，而本发明的类球红细菌space QG1.1737-168的发酵液为浅粉红色。从该菌的发酵液提取辅酶Q10时，不仅比出发菌株降低层析填料成本的10％，而且辅酶Q10产量比出发菌株提高30％。

表1是本发明的space QG 1.1737-168的微生物学特性的具体检测内容及结果：

表1微生物学特性

注：“+”表示阳性，“-”表示阴性

用本发明的突变菌发酵生产辅酶Q10时，从发酵液中提取辅酶Q10的方法是：

1.样品处理和提取

向发酵液中加入酸，可选用盐酸、硫酸、磷酸中的一种或几种的混合物，调pH值到1-5，之后加入碱，可选用氢氧化钠、氢氧化钾、氨水中的一种或几种的混合物，使pH值回复到6-8，将菌液离心后取菌体，加入有机溶剂混合均匀，溶剂可选用石油醚、正己烷、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的一种或几种的混合物。20-50℃摇床，100-200rpm条件下提取1-10小时。提取液离心后取上清液旋转蒸发。

2.柱层析

利用不锈钢或玻璃的加压柱、常压柱或减压柱作为层析柱，以硅胶或氧化铝作固定相，上样前用洗脱剂饱和柱子。洗脱剂为正己烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的一种或几种的混合物。

旋转蒸发后所得浸膏用正己烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的一种或几种的混合物溶解上样。

样品过柱的同时，进行薄层分析。当收集液的结果与标准品的结果一致时，即可开始正样收集，当收集液的结果与标准品的结果不一致时，停止收集。

3.样品检测

按照中华人民共和国药典中辅酶Q10的检测方法进行。

附图说明：

图1是space QG 1.1737-168显微镜下照片；

图2是space QG 1.1737-168菌落图；

图3是1.1737菌落图。

菌种保藏信息：

名称：类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)space QG 1.1737-168 CGMCC No.2359；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：CGMCC No.2359；

保藏时间：2008年1月25日。

具体实施方式：

实施例1类球红细菌突变株空间诱变育种

1.航天育种卫星搭载样品准备

取生长良好的类球红细菌1.1737菌体培养物在无菌条件下转移到搭载专用管中，拧紧管盖，接口处用封口膜封口后装入搭载用大管，送交搭载前于4℃保存。此搭载管放入“实践八号”航天育种卫星的实验装置中，在太空中随飞船飞行15天后回收。

2.搭载的空间环境

在本次育种卫星飞行过程中，空间环境的相关数据为：卫星姿态控制为三轴稳定姿态，其中卫星的I象限指向地面，卫星回收舱小头为飞行方向。育种卫星轨道为椭圆形倾斜轨道，卫星运行在近地点高度为180km远地点高度为460km的轨道上，轨道倾角为63°，近地点位置在北纬35°附近，卫星飞行15天，共飞行236圈，236圈通过回收区中心。测试结果表明，本次飞行试验期间空间辐射剂量最大为5.893mGy，最小2.484mGy。平均日剂量在0.401～0.169mGy之间。卫星在轨期间种子测温点的最大温度为20.72℃，最低温度为7.21℃。

3.空间试验条件设置

本研究中考虑的空间诱变因素为微重力和辐照两个方面。因此设计空间单一辐照、单一微重力以及辐照和微重力复合因素等三个试验条件。

在育种卫星中安放1g离心机，以克服空间微重力的影响，营造单一辐照条件；在卫星中放置铅罐，屏蔽掉空间绝大部分辐射剂量，营造单一微重力条件；样品直接放置在种子星铁罐中，使其处于辐照和微重力复合条件下。

实施例2类球红细菌突变株的地面筛选、分离、提取

1、地面筛选

在无菌条件下取培养面积为0.5平方厘米的搭载回收样品，用5毫升无菌水洗脱菌体到无菌离心管中，用移液器吸打均匀菌体洗脱液，取0.5毫升该菌液到4.5毫升无菌水中，吸打均匀，以此类推，做倍比稀释。取10^-4和10^-5稀释液涂布到平板培养基，每块平板上涂100-150微升稀释菌液，每个稀释梯度涂多块平板。待菌液被培养基吸收后于培养箱中28-37℃倒置培养2-7天。

待平板上长出菌落后，挑选颜色变浅或呈粉色，且菌落较大的用小量摇瓶发酵，进行初筛。初筛菌株的发酵液于8000rpm条件下离心8分钟，取沉淀60-80℃烘干，研磨后按质量体积比(1∶100)加入无水乙醇，超声处理1-2小时。处理液8000rpm条件下离心10分钟，取上清液利用高效液相色谱进行检测。挑选辅酶Q10含量比对照菌株高的浅颜色菌落进行复筛。

在平板培养物中共获得328个单菌落，其中颜色浅，菌落大的73个。将此73个菌落进行摇瓶发酵试验。

2.样品处理和提取

向各发酵液中分别加入6mol/L的盐酸，调pH值到2-4，之后加入6mol/L氢氧化钠溶液，使pH值回复到6-8，将菌液于8000rpm条件下离心10分钟，取菌体，按照固液比例(1∶10)加入石油醚，打散菌体，使之与提取溶剂混合均匀。45℃摇床，180rpm条件下提取2小时。提取液8000rpm条件下离心10分钟，取上清液在旋转蒸发仪上进行旋转蒸发。旋转蒸发后所得浸膏用石油醚和乙酸乙酯的混合物溶解上样。

3、用柱层析提取辅酶Q10，比较不同硅胶用量对分离产物产率的影响

1)方法

利用不锈钢常压柱作为层析柱，以60-100目的硅胶作固定相，柱子径高比为1∶15，样品与硅胶的质量之比为1∶10，上样前用洗脱剂饱和柱子。洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯的混合物。

样品过柱的同时，进行薄层分析。当收集液的结果与标准品的结果一致时，即可开始正样收集，当收集液的结果与标准品的结果不一致时，停止收集。

试验了出发菌株和突变株在上样量基本相同条件下，层析柱中三种硅胶用量对分离产物产率的影响。

2)结果见下表。

表2层析用不同硅胶用量的辅酶Q10产率比较

CK：对照物(出发菌株：类球红细菌1.1737)发酵样品；

S1：space QG 1.1737-168菌株发酵样品。

表中可看出，在硅胶用量减少10％的条件下，space QG 1.1737-168的样品仍然可以得到很好的分离效果，而对照菌株在相同硅胶用量条件下分离不完全。

3)结论

由于space QG 1.1737-168和对照菌株的发酵液颜色不同，颜色浅，旋转蒸发所得的样品颜色也浅较多，可节省层析填料，降低层析成本。

4、检测辅酶Q10含量

1)方法

按照中华人民共和国药典中辅酶Q10的检测方法进行。

将步骤2中得到的73个菌落进行摇瓶发酵，利用高效液相色谱检测发酵液中辅酶Q10含量，并与出发菌株发酵液中CoQ10含量对照。检测条件如下：

高效液相色谱，PDA检测器；色谱柱：Kromasil-C18-5μm 4.6×150mm；流速：1ml/min；柱温：25℃；检测时间：8min；进样体积：5μl；出峰时间：6-7min左右；紫外吸收：275nm；清洗针头溶剂：乙醇；检测方法：甲醇∶乙醇(5∶95)；平衡柱子：甲醇/乙醇＝5/95，1ml/min；冲柱子：100％甲醇饱和，流速：1ml/min。

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2)下表列出了19个辅酶Q10含量比对照菌高的突变株，其中样品编号168的是spaceQG 1.1737-168

表3类球红细菌部分突变株和出发菌株发酵液中辅酶Q10含量比较

样品编号	辅酶Q10含量(mg/L)	样品编号	辅酶Q10含量(mg/L)
				对照	22.21	38	28.32
2	28.04	39	27.85
				4	25.05	40	26.43

样品编号	辅酶Q10含量(mg/L)	样品编号	辅酶Q10含量(mg/L)
				50	32.85	61	29.10
62	35.71	63	27.58
				64	29.65	65	32.18
67	35.08	70	26.91
				72	36.78	130	25.05
149	31.89	150	27.49
				155	31.28	168	33.57

对这些突变株进行连续五次发酵，每个样品设三个平行，进行复筛，并与出发菌株以相同条件进行比较。

最终发现编号168的突变株发酵水平和发酵液颜色稳定，辅酶Q10含量始终高于对照的辅酶Q10含量的30％以上，将其命名为space QG 1.1737-168，并利用其发酵产物进行层析试验。复筛结果见表4：

表4出发菌株与168号突变株连续发酵辅酶Q10含量比较

单位：(mg/L)

Claims (3)

1.一种类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)，其为类球红细菌space QG 1.1737-168，保藏号为CGMCC No.2359。

2.权利要求1所述的类球红细菌在发酵生产辅酶Q10方面的应用。

3.权利要求2所述的类球红细菌在发酵生产辅酶Q10方面的应用，其中从发酵液中提取辅酶Q10的方法是：

1)样品处理和提取

在发酵液中加入酸，调pH值到1-5，之后加入碱，使pH值回复到6-8，将菌液离心后取菌体，加入有机溶剂混合均匀；20-50℃摇床，100-200rpm条件下提取1-10小时；提取液离心后取上清液旋转蒸发；

2)柱层析

以硅胶或氧化铝作固定相，洗脱剂为正己烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醚中的一种或几种的混合物；

3)检测收集液中的辅酶Q10。

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