CN110790820B - 一种芽孢杆菌菌株fjat-52631产生的脂肽及其制备方法 - Google Patents
一种芽孢杆菌菌株fjat-52631产生的脂肽及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种芽孢杆菌菌株FJAT‑52631产生的脂肽及其制备方法，属于微生物技术领域，所述的脂肽主要的有效成分为Fengycin。所述的制备方法包括菌株FJAT‑52631的活化，种子液的制备，发酵液的制备，脂肽的制备，还包括脂肽的纯化。所述的菌株为贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT‑52631，采用该菌株制备的脂肽对脂肪酶具有较强的抑制作用，可以有效抑制肠道中脂肪酶对脂肪的分解催化作用，达到减少脂肪吸收、控制和治疗肥胖的目的，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT-52631产生的脂肽，以及脂肽的制备和纯化方法。
背景技术
人们在与因热量摄入高于能量消耗而引起的肥胖的斗争中，关键性策略是控制能量平衡，即防止能量的长期积累对身体的损伤。通过提高每日平均代谢率和增加能量消耗，体育活动可能有助于预防肥胖。然而，临床数据显示，这种方法无法长期的控制并达到治疗肥胖的作用，阻止体重恢复的药物成为了治疗肥胖所必需的重要课题。减少多余膳食脂肪的吸收，成为治疗肥胖关键突破口，作为与膳食脂肪消化相关的酶，如十二指肠前脂肪酶(舌、胃脂肪酶)、胰腺脂肪酶(PL)、胆固醇-酯脂肪酶和盐刺激脂肪酶的成为治疗肥胖药物研究的关注对象。其中，胰腺脂肪酶是消化膳食甘油三酯的关键酶。目前欧洲唯一一种通过批准的抗肥胖药物奥利司他(Orlista)，就是利用该药物能够抑制PL活性，从而配合合理膳食达到减少脂肪吸收、控制和治疗肥胖的目的。但是长期服用奥利司他的患者会发生腹泻、胀气等副作用反应。因而，寻求低毒、高效的脂肪酶抑制剂成为了人们关注的课题。
目前，已筛选的胰腺脂肪酶抑制剂主要来源于微生物和植物。从微生物代谢物中分离的脂肪酶抑制剂包括：链霉菌属代谢的Lipstatin(奥利司他)、Panclicins、Valilactone、Ebelactones和Esterastin；杉叶蕨藻产生的Caulerpenyne；真菌产生的Vibralactone和Percyquinin。从植物中提取的脂肪酶抑制剂包括：茶叶、大豆、人参、山茱萸、花生、苹果、葡萄藤、葡萄籽等植物中提取的多酚类、黄酮类、皂苷类、萜类、以及生物碱类等。
芽胞杆菌脂肽是一类由氨基酸肽环和脂肪酸链构成的两性分子，具有强生物活性功能、不易产生耐药性、无毒副作用等优点，其具有抗菌、表面活性、抗癌等生物活性。有文献报道在小鼠高脂饮食中加入芽胞杆菌脂肽，能够抑制脂质消化，实现抗肥胖功效。不同芽胞杆菌菌株产生的脂肽组成不同，导致活性存在差异。因而筛选出高效抑制脂肪酶活性的脂肽，将其开发为脂肪酶抑制剂，从而抑制肠道中脂肪酶对脂肪的分解催化作用，达到减少脂肪吸收、控制和治疗肥胖的目的，其在预防肥胖方面具有较好的临床应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种低毒、高效的，由微生物代谢产生的能够抑制胰腺脂肪酶活性的脂肽。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
本实验室从福建省武夷山黄岗山土壤中分离并筛选得到具有很好生物防治作用的菌株FJAT-52631，并将对该菌株的理化特性进行测定分析，最终鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌的一个菌株。
所述的菌株FJAT-52631为贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT-52631(BacillusvelezensisFJAT-52631)，于2019年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCCM2019760。
所述的贝莱斯芽孢杆菌产生的脂肽，其特征在于：所述的脂肽包括Fengycin或Surfactin中的一种或两种。
进一步的，所述的脂肽包括C14-C16iturinA、C12-C16surfactinA、C16surfactinA衍生物、C16/C18fengycinA、C16fengycinA2/B2、C16–C17fengycinB或C15fengycinA/B衍生物其中的一种以上。
所述的贝莱斯芽孢杆菌产生的脂肽的制备方法具体包括以下步骤：
菌株FJAT-52631的活化：用接种环将菌株FJAT-52631划线于NA培养基上，并于恒温培养箱中培养36-60h，培养温度25-35℃；
种子液的制备：将上一步获得的单菌落接种于马铃薯葡萄糖营养肉汤培养基中，并将其置于恒温摇床振荡培养，温度25-35℃，培养24-48h后即得种子液；
发酵液的制备：将上一步获得的种子液接种到已灭菌的马铃薯葡萄糖营养肉汤培养基中，接种量1-2％，边搅拌边培养，温度25-35℃；在发酵培养36-60h后，测得菌体浓度值为4.0-6.0×108CFU/mL时，则获得所需的发酵液；
脂肽的制备：将上一步得到的发酵液离心，离心后弃去菌体得上清液，在上清液中加入1.5-2.5mol/L盐酸至pH<2，2-8℃静置24-48h后，离心得到沉淀；利用低温真空冷冻干燥将沉淀进行干燥后，得脂肽粉末。
所述步骤的NA培养基的组分为：牛肉浸膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，琼脂1.8％，以水配制，pH7.0-7.2；所述的马铃薯葡萄糖营养肉汤培养基的组分为：马铃薯浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、葡萄糖1.5％，以水配制，pH7.0-7.2；各培养基组分中的百分比均为重量比。
进一步的，所述的脂肽的纯化方法为将脂肽粉末溶于水中，过滤后，上样于活化的C18固相萃取柱中，加入70％-90％甲醇淋洗，将淋洗液旋转蒸干即可，纯化得到的脂肽主要为Fengycin。
进一步的，所述的脂肽在抑制脂肪酶活性中的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株产生的脂肽能够有效抑制脂肪酶活性，且与文献报道的减肥药奥林司他相当。
(2)本发明纯化后得到的脂肽为Fengycin，纯度可达95％左右。
(3)本发明的脂肽能够作为脂肪酶抑制剂，减少多余膳食脂肪的吸收，在预防肥胖方面具有较好的临床应用前景。
附图说明
图1为具体实施方式所述的菌株FJAT-46737的基因组圈图。
图2为具体实施方式所述的脂肽混合物对米黑毛霉脂肪酶的活力影响。
图3为具体实施方式所述的不同浓度脂肽下的酶活力和酶量的关系。
图4为具体实施方式所述的脂肽混合物对脂肪酶抑制类型，图中线1-5所对应的浓度分别为：0.005，0.0045，0.004，0.0025，0mg/mL。
图5为具体实施方式所述的米黑毛霉脂肪酶催化p-NPC16反应紫外-可见吸收光谱。图中(a)图为p-NPC16和米黑毛霉脂肪酶的峰位和峰形；(b)图为脂肽、p-NPC16和米黑毛霉脂肪酶的峰位和峰形，图中1-10代表10分钟内酶的变化；(c)图为脂肽对米黑毛霉脂肪酶内源荧光发射光谱的影响，图中1-7所对应的浓度分别是0,0.194,0.265,0.324,0.375,0.419和0.457mg/mL。
图6为具体实施方式所述的80％甲醇洗脱物总离子流图。
图7为具体实施方式所述的Fengycin脂肽对米黑毛霉脂肪酶的活力影响。
图8为具体实施方式所述的不同浓度Fengycin脂肽下的酶活力和酶量的关系。
图9为具体实施方式所述的Fengycin脂肽对脂肪酶抑制类型，线1-5对应浓度为：0.003，0.0025，0.002，0.0013，0mg/mL。
图10为具体实施方式所述的脂肽Iturin对米黑毛霉脂肪酶的活力影响。
图11为具体实施方式所述的脂肽Surfactin对米黑毛霉脂肪酶的活力影响。
图12为具体实施方式所述的不同浓度脂肽Surfactin下的酶活力和酶量的关系。
图13为具体实施方式所述的脂肽Surfactin对脂肪酶抑制类型，线1-5对应浓度为：0.0013，0.0011，0.0009，0.0008，0mg/mL。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1
本发明一种贝莱斯芽孢杆菌菌株(Bacillusvelezensis)FJAT-52631是从福建省武夷山市黄岗山土壤中分离并筛选得到具有很好生物防治作用的菌株，采用该菌株制备一种能够抑制脂肪酶活性的脂肽混合物。
1.菌株的分离
(1)取福建省武夷山市黄岗山的土壤样品10g于90mL无菌水中，充分振荡后吸取1mL土壤悬液进行梯度稀释；
(2)将步骤(1)获得的土壤稀释液涂布于NA培养基平板上，然后将NA培养基平板置于30℃恒温培养箱内培养48h；
(3)先挑取步骤(2)培养获得的单菌落进行涂片，碱性品红染色后镜检，选取能够产生芽孢的菌株转入斜面培养基保存，作为待测菌株，然后将待测菌株划线于NA固体平板上，并将该NA固体平板置于30℃恒温培养箱内培养48h；其中NA液体培养基的组分：蛋白胨0.5％，牛肉浸膏0.3％，葡萄糖1.0％，琼脂1.8％，以蒸馏水配制，pH7.2；另外，该NA培养基组分中的百分比均为重量比。
2.菌株的鉴定
将所获得的菌株进行理化及生物学特性的测定，得到该菌株的主要形态及生物学特征如下：菌落浅黄色、干皱、不透明，革兰氏染色呈阳性，营养体细胞杆状；有芽孢，芽孢近椭圆形，中生或次端生，不膨大。表1和表2是其具体生理生化鉴定指标。
表1菌株FJAT-52631的API20E测定结果
表2菌株FJAT-52631的API 50CH测定结果
注：“+”表示有作用或有反应，“-”表示无作用或无反应，“w”表示弱反应。
提取菌株FJAT-52631的DNA，进行NanoporePromethION和Illumina NovaSeqPE150测序，获得FJAT-52631菌株的全基因组数据，genebank号为CP045186，基因组圈图如图1。该菌株的G+C含量为46.5mol％。利用ChunLab'sonlineAverageNucleotideIdentity(ANI)calculator计算出菌株FJAT-52631与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株CBMB205T的ANI相似性为99.95％。
将上述各指标进行分析比对后发现各指标与贝莱斯芽孢杆菌菌株(Bacillusvelezensis)完全一致，则判定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。
3.脂肽混合物的制备方法
(1)贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT-52631的活化：用接种环将贝莱斯芽孢杆菌FJAT-52631划线于菌株的NA培养基上，并于恒温培养箱中培养48h，且培养温度设定为30℃；
(2)种子液的制备：将步骤(1)所获得的贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT-52631的单菌落接种于盛装有种子培养基的三角瓶中(瓶装量为50mL/250mL三角瓶)，并将三角瓶置于恒温摇床振荡培养，转速170rpm，温度设定为30℃，培养24h后即得种子液；
(3)发酵液的制备：将步骤(2)所获得的贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT-52631的种子液接种到马铃薯葡萄糖营养肉汤(PDB)液体培养基中，接种量1％，搅拌速率170rpm，温度设定为30℃，培养48h后，测定的菌体浓度值为5.0×108CFU/mL，则获得所需的发酵液。
其中，步骤(1)中NA培养基的组分为：牛肉浸膏0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖1.0％，琼脂1.8％，以水配制，pH7.0-7.2；步骤(2)中种子培养基与步骤(3)中发酵培养基均为PDB培养基，其组分为：马铃薯浸粉0.5％、蛋白胨1％、氯化钠0.5％、葡萄糖1.5％，以水配制，pH7.0-7.2；且各培养基组分中的百分比均为重量比。
(4)脂肽混合物的制备：将步骤3得到的发酵液离心，转速为9000r/min；离心后弃去菌体得上清液，在上清液中加入2mol/L盐酸至pH<2，4℃静置24h后，离心得到沉淀；利用低温真空冷冻干燥将沉淀进行干燥后，得脂肽混合物粉末。
4.脂肽混合物抑制脂肪酶活性试验
(1)试验材料
米黑毛霉脂肪酶、对硝基苯酚棕榈酸酯(p-NPC16)
(2)试验方法
①脂肽对米黑毛霉脂肪酶的影响
将脂肽溶于水，制成不同浓度脂肽溶液。在以0.75mmol/Lp-NPC16为底物的活力分析体系中，检测不同浓度的脂肽加入时OD405nm随时间的增长，换算得米黑毛霉脂肪酶相应的剩余活力。
②脂肽对米黑毛霉脂肪酶的抑制机理的判断
在底物p-NPC16的浓度为0.75mmol/L，含有0.05mol/LpH7.8的Tris-HCl的活力分析体系中，改变酶量，检测不同浓度脂肽下的剩余活力，分析脂肽对米黑毛霉脂肪酶的抑制效应。
③脂肽对米黑毛霉脂肪酶的抑制类型的判断
在活力分析体系中，将米黑毛霉脂肪酶的酶浓度固定，改变p-NPC16的浓度，测定各个浓度下的抑制剂对酶活性的影响。
④光谱法分析脂肽对米黑毛霉脂肪酶的作用
酶分子的紫外吸收光谱测定：在反应体系中，加入定量的米黑毛霉脂肪酶液和固定浓度的脂肽，混匀充分后，进行紫外吸收光谱扫描，波长范围在350-800nm之间的。
酶分子的内源荧光光谱测定：采用VarianCaryEclipse荧光波谱仪测试米黑毛霉脂肪酶的内源荧光强度变化，设定激发光波长为280nm，发射光夹缝宽度为5nm，扫描290-450nm范围内米黑毛霉脂肪酶的内源荧光发射光谱。分次将10μL不同浓度的脂肽加入2mL0.1mg/mL的米黑毛霉脂肪酶液中，扫描该酶与各浓度脂肽混匀1min后的荧光发射光谱。测定米黑毛霉脂肪酶与效应物混匀1min后的发射荧光强度变化情况。2.0mL双蒸水调零，H2O作为空白对照。
(3)试验结果
该脂肽混合物对脂肪酶酶促反应的抑制IC50为0.011mg/mL(图2)，其抑制机理为可逆的(图3)，抑制类型为竞争型抑制(图4)。脂肽对脂肪酶催化底物p-NPC16紫外可见吸收光谱显示，加入脂肽后OD405nm处吸收峰值下降54.5％。荧光发射光谱显示，脂肪酶液中加入脂肽后，不影响脂肪酶荧光发射光谱的峰位和峰形(图5a和5b)，但是脂肪酶的内源荧光强度呈现出规律性的减弱(图5c)，说明脂肽与脂肪酶之间形成了复合物。根据Stern-Volmer方程计算得荧光猝灭过程速率常数KSV为0.525L/g。该数值大于生物大分子的最大动态猝灭过程的速率常数(KSV<100L/mol)，表明脂肽存在时脂肪酶内源性荧光的猝灭过程类型为静态猝灭，而不是由扩散控制引起的动态猝灭。
5.抑制脂肪酶活性的脂肽混合物组成的测定
(1)试验材料
10mg/ml脂肽混合物
(2)试验方法
利用LC-QTOF-MS/MS技术对菌株FJAT-52631产生的脂肽进行测定，测试条件如下：
液相色谱条件：色谱柱为AgilentZORBAXExtend-C18色谱柱(2.1×150mm，1.8-Micron)，流速为0.3mL/min；流动相A为0.1％甲酸水；流动相B为甲醇；洗脱程序0，60％B；60min,100％B；65min,60％B。
质谱条件：ESI(+/–)、干燥气温度350℃、干燥气流速8L/min、雾化气压力(nebulizer)30psig、Fragmentor175V、CollisionEnergy100V、Skimmer65V、扫描方式autoMS/MS；离子扫描范围：100–3000m/z。
(3)试验结果
利用LC-QTOF-MS/MS技术对菌株FJAT-52631产生的脂肽进行测定，脂肽组成如表3所示，结果表明，菌株FJAT-52631产生的脂肽由C14-C16iturinA、C12-C16surfactinA、C16surfactinA衍生物、C16/C18fengycinA、C16fengycinA2/B2、C16–C17fengycinB和C15fengycinA/B衍生物组成。
表3菌株FJAT-52631脂肽组成
进一步对FJAT-52631产生的Iturin、Fengycin和Surfactin脂肽进行定量分析，结果显示，FJAT-52631产生的Iturin、Surfactin和Fengycin在发酵上清中的含量分别为2.66、35.93和86.95mg/L，其中Fengycin含量最丰富，占脂肽总量的69.3％。
6.Fengycin类脂肽的纯化
(1)试验材料
脂肽粉末、C18固相萃取小柱(6g/60mL)、Iturin和Surfactin标准品(sigma)
(2)试验方法
将250mg脂肽粉末溶于50mL水中，过滤后，上样于活化的C18固相萃取小柱中，分别加入60mL的水、10％甲醇、20％甲醇、30％甲醇、40％甲醇、50％甲醇、60％甲醇、70％甲醇、80％甲醇、90％甲醇、100％甲醇淋洗，将淋洗液旋转蒸干后，进LC-QTOF-MS进行检测。方法见5(2)。
(3)试验结果
LC-QTOF-MS显示，80％甲醇洗脱物为Fengycin类脂肽，纯度约为95％(图6)。进一步对纯化的Fengycin抑制脂肪酶活性进行检测。该Fengycin类脂肽对脂肪酶抑制的IC50为0.0046mg/mL(图7)，其抑制机理为可逆的(图8)，抑制类型为竞争型抑制(图9)。
同时，检测了Iturin和Surfactin对脂肪酶的抑制活性，结果显示，Iturin和Surfactin抑制脂肪酶活性的IC50分别是0.0561mg/mL和0.0050mg/mL(图10，图11)。表明，Iturin抑制脂肪酶活性最弱。Surfactin抑制脂肪酶活性与Fengycin相当，且Surfactin抑制脂肪酶的抑制机理是可逆的(图12)，抑制类型为竞争型(图13)。
上述结果表明，由于菌株FJAT-52631脂肽中Fengycin含量最高，占据69.3％，抑制脂肪酶活性主要来源于Fengycin；脂肽中Surfactin含量为28.6％，因而该物质也起到重要作用。
综上，本发明利用贝莱斯芽孢杆菌菌株FJAT-52631制备所得的脂肽混合物及纯化的Fengycin对脂肪酶活性具有较强的抑制作用，发挥抑制作用的脂肽成分主要为Fengycin(浓度为0.0046mg/mL时，能够使脂肪酶活性下降50％)，该脂肽在预防肥胖方面具有较好的临床应用前景。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
Claims (3)
1.一种芽孢杆菌菌株FJAT-52631产生的脂肽的制备方法，其特征在于：所述的制备方法具体包括以下步骤：
菌株FJAT-52631的活化：用接种环将菌株FJAT-52631划线于NA培养基上，恒温培养36-60 h，培养温度25-35℃；所述的菌株FJAT-52631为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis） 菌株FJAT-52631，于2019年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC M 2019760；
种子液的制备：将上一步获得的单菌落接种于马铃薯葡萄糖营养肉汤培养基中，25-35℃恒温振荡培养24-48h后即得种子液；
发酵液的制备：将上一步获得的种子液接种到已灭菌的马铃薯葡萄糖营养肉汤培养基中，接种量1-2%，边搅拌边培养，温度25-35℃；在发酵培养36-60h后，测得菌体浓度值为4.0-6.0×108 CFU/mL时，则获得所需的发酵液；
脂肽的制备：将上一步得到的发酵液离心，离心后弃去菌体得上清液，在上清液中加入1.5-2.5mol/L盐酸至pH<2，2-8℃静置24-48h后，离心得到沉淀；将沉淀进行冷冻干燥后，得脂肽粉末。
2.一种如权利要求1所述的芽孢杆菌菌株FJAT-52631产生的脂肽的制备方法，其特征在于：所述的制备方法还包括：将得到的脂肽粉末溶于水中，过滤后，上样于活化的C18固相萃取柱中，加入70%-90%甲醇淋洗，将淋洗液旋转蒸干即可。
3.一种如权利要求1或2所述的芽孢杆菌菌株FJAT-52631产生的脂肽在制备脂肪酶活性抑制剂中的应用。
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