CN101838621A

CN101838621A - 枯草芽孢杆菌及脂肽类生物表面活性剂的制备方法

Info

Publication number: CN101838621A
Application number: CN200910300898A
Authority: CN
Inventors: 梅晓丹; 刘向阳; 叶伟; 孙强; 陈朋; 王薇; 粱莹; 江磊磊; 靳祥; 史兴来
Original assignee: DALIAN BITEOMICS Inc
Current assignee: DALIAN BITEOMICS Inc
Priority date: 2009-03-17
Filing date: 2009-03-17
Publication date: 2010-09-22
Anticipated expiration: 2029-03-17
Also published as: CN101838621B

Abstract

本发明涉及枯草芽孢杆菌及脂肽类生物表面活性剂的制备方法，其特征在于：所用菌株为高效脂肽生产菌枯草芽孢杆菌BIT09S1、BIT09S2、BIT09A2，所用培养基以廉价的糖蜜、豆粉、魔芋胶精粉、瓜尔胶及改性瓜尔胶的破胶液为碳源，加以其它的氮源、磷源和无机盐成份及营养元素，发酵后，经分离纯化，制得脂肽生物表面活性剂。该法生产脂肽所需原料廉价易得，可大量市购。所得的脂肽类生物表面活性剂Surfactin的粗提物可以用于油气田压裂、酸化、解堵、调剖堵水、油污水处理及环境修复等诸多钻采工艺，是一前景广阔的生物表面活性剂。

Description

枯草芽孢杆菌及脂肽类生物表面活性剂的制备方法

技术领域

本发明涉及生物表面活性剂和枯草芽孢杆菌，具体地说是属于利用枯草芽孢杆菌生产脂肽类生物表面活性剂Surfactin的方法。

背景技术

生物表面活性剂是由微生物在一定条件下产生的同时具有亲水性和疏水性两种结构的次生代谢产物。除具有化学合成的表面活性剂相同或相似的理化性质外，生物表面活性剂还具有结构复杂，专一性强，低毒性，可生物降解，环境友好，可利用廉价农副产品进行发酵生产，某些生物表面活性剂还具有抗菌，抗病毒，抗肿瘤等药理作用及生理活性。生物表面活性剂已在石油，食品，化妆品以及医药学等领域获得广泛使用。

1968年由Arima等人发现枯草芽抱杆菌Bacillus subtilis生产的产一种脂肽类表面活性剂，活性极强，命名为Surfactin。Surfactin是目前所知表面活性最强的生物表面活性剂之一，自从被发现以来，受到持续的关注。但由于产量很低，达不到商业化用途，许多发明者致力于提高Surfactin的产量。1968年Arima发现Surfactin时产量只有0.05-0.10g/L，1981年Cooper等人采用含4％葡萄糖的基本无机盐培养基培养ATCC21332，并收集泡沫分离surfactin，产量达到0.78g/L，1989年Mulligan等人发现一株枯草芽抱杆菌ATCC21332的紫外突变株，产surfactin可以达到1.124g/L，1997年Kim等人采用一个改进的Cooper培养基并在限氧条件下培养枯草芽抱杆菌C9，Surfactin产量达到7.0g/L，2002年魏毓宏等人采用一种强化无机盐培养基伴以控制pH使surfactin产量接近3.5g/L。

如何降低成本是目前开发的主要目标，这需要选育优良的高产菌株，合适的廉价的培养基，开发高附加值产品，同时也考虑产品生产时的环境因素，这正是本发明要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供枯草芽孢杆菌及一种高效生产脂肽类生物表面活性剂Surfactin的方法，生物表面活性剂Surfactin产物以1007，1021和1035Da的物质为主，临界胶束浓度CMC值为21mg/L产品主要用于油田采油。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

枯草芽孢杆菌，其为以下三株枯草芽孢杆菌中的一株或多株；它们分别为：Bacillussubtilis BIT09S1，保藏号为：CGMCC No.2947；Bacillus subtilis BIT09S2，保藏号为：CGMCC No.2948；Bacillus amyloliquefaciens BIT09A2，保藏号为：CGMCC No.2945；它们均已经于2009年3月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。

以上枯草芽孢杆菌菌株是对生长于油井地层水或黄渤海海泥中含有的芽孢杆菌进行富集培养后，LB琼脂平板上挑取单一菌落，筛选高品质菌株BIT09S 1、BIT09S2、BIT09A2。

所述液体培养基中包括碳源、氮源和无机盐，碳源选自葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、糖蜜、油田用植物胶(瓜尔胶或改性瓜尔胶，优选羟丙基瓜尔胶)的破胶液中的一种或多种；氮源选自谷氨酸、大豆粉、蛋白胨、NH₄NO₃、(NH₄)₂SO₄中的一种或多种；无机盐及营养元素选自K₂HPO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、FeSO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、MnCl₂·4H₂O、CuSO₄·5H₂O、KCl、NaCl和酵母粉中的一种或多种。

LB液体培养基为种子培养基，发酵培养基为液体培养基，利用三株枯草芽孢杆菌发酵生产脂肽表面活性剂。发酵培养基包括：

麦芽糖培养基：麦芽糖(6.7％)、豆粉(4％)、K₂HPO₄(0.5％)、MgSO₄·7H₂O(0.05％)、CaCl₂·2H₂O(0.018％)、FeSO₄·7H₂O(25ppm)、MnCl₂·4H₂O(22ppm)、酵母粉(0.1％)、水，pH 7.0，接种量37℃培养36h；

糖蜜培养基：糖蜜(2％)、NH₄NO₃(0.2％)、K₂HPO₄·3H₂O(0.3％)、NaH₂PO₄·2H₂O(1％)、MgSO₄·7H₂O(0.02％)、MnCl₂·4H₂O(2ppm)、酵母提取物(0.02％)、水，pH 7.2；

葡萄糖培养基：葡萄糖(2％)、L-谷氨酸(0.5％)、KH₂PO₄(0.1％)、MgSO₄·7H₂O(0.05％)、KCl(0.05％)、MnSO₄(5ppm)、FeSO₄·7H₂O(0.15ppm)、CuSO₄·5H₂O(0.16ppm)、水pH7.0；

瓜尔胶培养基：瓜尔胶破胶液(20g瓜尔胶经酶博士

生物酶破胶剂破胶)，0.5％的NH₄H₂PO₄、0.3％的(NH₄)₂HPO₄，K₂HPO₄·3H₂O(0.3％)、MgSO₄·7H₂O(0.02％)、MnCl₂·4H₂O(2ppm)、酵母提取物(0.02％)、水，pH 7.2；

淀粉培养基：淀粉(2％)、(NH₄)₂SO₄(1％)、K₂HPO₄·3H₂O(0.06％)、KH₂PO₄(0.25％)、MgSO₄·7H₂O(0.03％)、NaCl(2％)、酵母粉(0.5％)、水，pH＝6.0；

具体为采用液体培养基，在恒温摇床中培养，培养温度28-37℃，培养时间48-72h，摇床转速150-200r/min，利用三株枯草芽孢杆菌BIT09S1、BIT09S2、BIT09A2中的一株或多株发酵生产表面活性剂Surfactin；发酵液分离提纯，得到脂肽类生物表面活性剂。

所述液体培养基以麦芽糖、糖蜜、魔芋胶精粉或瓜尔胶破胶液为碳源，以谷氨酸、大豆粉、蛋白胨、NH₄NO₃、(NH₄)₂SO₄中的一种或多种为氮源；以K₂HPO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·2H₂O、FeSO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、MnCl₂·4H₂O、CuSO₄·5H₂O、KCl、NaCl和酵母粉中的一种或多种为无机盐和营养元素，可高效制备脂肽生物表面活性剂。如果其中加入0.5％的NH₄H₂PO₄和0.3％的(NH₄)₂HPO₄后，可优化产量，由原来的5.7g/L提高到8.9g/L。

所述分离提纯是指，发酵液经过8000r/min离心10min除去菌体，上清液用6mol/L盐酸调制pH＝2，置于4℃冰箱中过夜；8000r/min离心10min后，收集沉淀；蒸馏水清洗除酸，8000r/min离心10min，洗涤两次，60℃干燥获得粗提物；酸化粗提物用甲醇抽提，获得初步提纯产物。

甲醇抽提物，用于HPLC以及质谱分析。HPLC分析使用大连依利特分析仪器有限公司的EC2006色谱数据处理工作站，P1201高压恒流泵，色谱柱为Sinochrom ODS-BP(4.6mm×200mm，5mm)，UV1201紫外可见检测器，ZW Ⅱ色谱柱恒温箱(大连依利特分析仪器有限公司)。流动相为乙腈(0.1％TFA)和水(0.1％TFA)的混合物，乙腈∶水＝85∶15(v/v)，流速1.00mL/min，紫外检测波长为210nm。质谱实验使用Brucker Daltons AutoflexMALDI-TOF-MS质谱仪、N₂激光器、激光波长337nm，激光能量为134.3μJ，基体来自Sigma公司，仪器校正使用HP-G2503A蛋白标准品。脂肽生物表面活性剂的确定根据相同条件下已知脂肽生物表面活性剂surfactin在高效液相色谱上的保留时间和其在质谱中的分子量判断。

该脂肽类生物表面活性剂可以用于油气田压裂、酸化、解堵、调剖堵水、油污水处理及环境修复等诸多钻采工艺。

本发明的产生菌的发酵工艺操作简单，原料为价廉的豆粉、糖蜜、魔芋胶精粉、或油田工业废弃物，即瓜尔胶或改性瓜尔胶的破胶液为碳源。条件经无机磷盐和铵盐复合物的优化，可高效生产生物表面活性剂。

附图说明

三株枯草芽孢杆菌分别为，Bacillus subtilis BIT09S1，保藏号为：CGMCC No.2947；Bacillus subtilis BIT09S2，保藏号为：CGMCC No.2948；Bacillusamyloliquefaciens BIT09A2，保藏号为：CGMCC No.2945；保藏日期：2009年3月11日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮编100101。

图1为BIT09S1(a)、BIT09S2(b)和BIT09A2(c)在麦芽糖培养基中生长发酵液中脂肽成分的HPLC分析。保留时间9.0-27.0min内出现的峰为脂肽组分的峰。

图2为BIT09S1(a)、BIT09S2(b)和BIT09A2(c)在糖蜜为碳源的培养基中生长发酵液中脂肽成分的HPLC分析。保留时间9.0-27.0min内出现的峰为脂肽组分的峰。

图3为BIT09S1在以瓜尔胶破胶产物为碳源(a)和加入0.5％的NH₄H₂PO₄和0.3％(NH₄)₂HPO₄的后(b)代谢产物的HPLC谱图。相同条件下，峰高代表产量，从图中可以看出加入磷酸铵盐后产量提高。

图4为BIT09S1在以瓜尔胶破胶产物为碳源和0.5％的NH₄H₂PO₄和0.3％(NH₄)₂HPO₄的培养基中培养后代谢产物的MALDI-MS谱图。根据谱图，主要峰的分子量([M+K]⁺)为1046.3，1060.6和1075.2，BIT09S1所产的化合物主要分子量为1007.3，1021.6及1036.2为surfactin类脂肽化合物。

具体实施方式

实施例1：

取斜面保存的菌株BIT09S1，BIT09S2和BIT09A2，接种于装量25mL/250mL的LB培养基在37℃培养36h；所得种子液按5％接种量接种于发酵培养基：麦芽糖(6.7％)、豆粉(4％)、K₂HPO₄(0.5％)、MgSO₄·7H₂O(0.05％)、CaCl₂·2H₂O(0.018％)、FeSO₄·7H₂O(25ppm)、MnCl₂·4H₂O(22ppm)、酵母粉(0.1％)、水，pH 7.0，装量100mL/250mL，37℃培养72h。培养结束后，取发酵液40mL，8000r/min离心10min除去菌体，所得上清液用于表面张力的测定，测完后用6mol/L HCl调pH＝2.0，置4℃冰箱过夜，离心得酸沉淀.60℃烘干24h，取出后加0.6mL甲醇溶解，超声1h，取上清液，留作HPLC分析。表面张力的测定先测得发酵液上清液的密度，用JYW-200全自动表界面张力仪(承德鼎盛试验机检测有限公司)在室温下测定发酵液的表面张力，每次测量重复三次，取平均值。HPLC分析在EC2006色谱数据处理工作站上进行高效液相色谱分析，P1201高压恒流泵，UV1201紫外可见检测器，ZW Ⅱ色谱柱恒温箱(大连依利特分析仪器有限公司)。酸沉淀的甲醇萃取液先通过0.45mm滤膜过滤，然后进样20μL进行HPLC分析，色谱柱为Sinochrom ODS-BP(4.6mm×200mm，5um)，流动相为乙腈(0.1％TFA)和水(0.1％TFA)的混合物，乙腈∶水＝85∶15(v/v)，流速1.00mL/min，紫外检测波长为210nm。

从表1可以看出，枯草芽孢杆菌BIT09S2在麦芽糖培养基中生长发酵液的表面张力最低，为27.49mN/m(表1)；经HPLC分析酸沉淀中脂肽的含量，结果表明：在相同条件下，BIT09S2产生的脂肽比BIT09S1和BIT09A2多(图1)。因此，以麦芽糖为碳源的培养基中，BIT09S2是脂肽生物表面活性剂的高效生产菌。

表1麦芽糖培养基，37℃，150r培养36h

实施例2：

取斜面保存的菌株：BIT09S1，BIT09S2和BIT09A2，分别接种于25mL/250mL LB培养基，37℃200rpm培养36h，所得种子培养液按5％的接种量接种于发酵培养基：糖蜜(2％)、NH₄NO₃(0.2％)、K₂HPO₄·3H₂O(0.3％)、NaH₂PO₄·2H₂O(1％)、MgSO₄·7H₂O(0.02％)、MnCl₂·4H₂O(2ppm)、酵母粉(0.02％)、水，pH 7.2，28℃ 150rpm培养72h。培养结束后取发酵液30mL，8000r/min离心10min除去菌体，所得上清液用于表面张力的测定，测完后用6mol/LHCl调pH＝2.0，置4℃冰箱过夜，离心得酸沉淀.60℃烘干24h，取出后加0.6mL甲醇溶解，超声1h，取上清液，留作HPLC分析。表面张力的分析先测定发酵液上清液的密度，然后用JYW-200全自动表界面张力仪(承德鼎盛试验机检测有限公司)在室温下测定发酵液的表面张力，每次测量重复三次，取平均值。HPLC分析在EC2006色谱数据处理工作站上进行高效液相色谱分析，P1201高压恒流泵，UV1201紫外可见检测器，ZW Ⅱ色谱柱恒温箱(大连依利特分析仪器有限公司)。酸沉淀的甲醇萃取液用0.45mm滤膜过滤，然后进样20μL进行HPLC分析，色谱柱为Sinochrom ODS-BP(4.6mm×200mm，5μm)，流动相为乙腈(0.1％TFA)和水(0.1％TFA)的混合物，乙腈∶水＝85∶15(v/v)，流速1.00mL/min，紫外检测波长为210nm。

结果表明：BIT09A2在糖蜜培养基中生长的表面活性剂产量最高，其发酵液表面张力值为28.20mN/m，低于同等条件下BIT09S1和BIT09S2发酵液的表面张力(表2)。在HPLC分析中，相同条件下，脂肽峰的峰高代表了脂肽的产量，因此，由HPLC分析结果可以看出BIT09A2所产生的脂肽的量高于BIT09S1和BIT09S2产生的脂肽的量(图2)。

表2糖蜜培养基，28℃，150r/min培养36h

实施例3：

取斜面保存的菌株BIT09S1，接种于装量25mL/250mL的LB培养基，37℃200rpm培养36h，所得种子液按5％的接种量接种于发酵培养基：瓜尔胶破胶液(20g瓜尔胶经酶博士

生物酶破胶剂破胶)，0.5％的NH₄H₂PO₄、0.3％的(NH₄)₂HPO₄，K₂HPO₄·3H₂O(0.3％)、MgSO₄·7H₂O(0.02％)、MnCl₂·4H₂O(2ppm)、酵母提取物(0.02％)、水，pH 7.2，37℃培养72h。培养结束后，取发酵液25mL，8000r/min离心10min除去菌体，所得上清液用于表面张力的测定，测完后用6mol/L HCl调pH＝2.0，置4℃冰箱过夜，离心得酸沉淀.60℃烘干24h，取出后加0.6mL甲醇溶解，超声1h，取上清液，留作HPLC分析。表面张力的测定先测得发酵液上清液的密度，然后用JYW-200全自动表界面张力仪(承德鼎盛试验机检测有限公司)在室温下测定发酵液的表面张力，每次测量重复三次，取平均值。HPLC分析在EC2006色谱数据处理工作站上进行高效液相色谱分析，P1201高压恒流泵，UV1201紫外-可见检测器，ZW Ⅱ色谱柱恒温箱(大连依利特分析仪器有限公司)。酸沉淀的甲醇萃取液用0.45μm滤膜过滤，然后进样20μL进行HPLC分析，色谱柱为Sinochrom ODS-BP(4.6mm×200mm，5um)，流动相为乙腈(0.1％TFA)和水(0.1％TFA)的混合物，乙腈∶水＝85∶15(v/v)，流速1.00mL/min，紫外检测波长为210nm。酸沉淀的甲醇萃取液用Brucker DaltonsAutoflex MALDI-TOF-MS质谱仪、N₂为激光源，激光波长337nm、激光能量为134.3μJ，基体来与Sigma公司，先用HP-G2503A蛋白标准品对仪器进行校正后。将脂肽样品吸取1μL的α-氰基-4-羟基肉桂酸混匀，再加入1μL的0.1％三氟乙酸水溶液混匀。取1μL此溶液滴于进样探头上抽空除去溶剂，使样品/基质混合物在探头上形成均匀的结晶，直接进样分析。质谱信号为单次扫描累加50次，以正离子谱测定。

结果表明：以BIT09S1为出发菌株，瓜尔胶破胶液为碳源、NH₄H₂PO₄和(NH₄)₂HPO₄为磷源的条件下，发酵液的表面张力为29.17mN/m，脂肽的产量经HPLC分析后从原来的5.8g/L提高到8.9g/L，该法证明瓜尔胶破胶液NH₄H₂PO₄和(NH₄)₂HPO₄是一种可以提高BIT09S1菌株脂肽生产的高效方法。代谢物经MALDI-TOF MS分析，根据质谱图中显示的分子量分别为1007.3，1021.6及1036.2，说明BIT09S1产生的脂肽为surfactin类家族的脂肽，酸沉淀干燥后，其中的脂肽组分用pH 8-9的碱水溶解，通过稀释不同倍数获得浓度分别为1，2.5，5，10，15，30，62.5，100，125，250，500和1000mg/L的表面活性剂溶液，根据不同浓度与表面张力之间的曲线关系，确定脂肽的CMC值为21mg/L。

Claims

1.枯草芽孢杆菌，其特征在于：为以下三株枯草芽孢杆菌中的一株或多株；它们分别为，Bacillus subtilis BIT09S1，保藏号为：CGMCC No.2947；Bacillus subtilis BIT09S2，保藏号为：CGMCC No.2948；Bacillusamyloliquefaciens BIT09A2，保藏号为：CGMCC No.2945；保藏日期：2009年3月11日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种脂肽类生物表面活性剂的制备方法，其特征在于：权利要求1所述枯草芽孢杆菌为脂肽类生物表面活性剂的生产菌，其培养方法为，采用液体培养基以葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、糖蜜、油田用植物胶(瓜尔胶或改性瓜尔胶，优选羟丙基瓜尔胶)的破胶液中的一种或多种为碳源，加入其它氮源、无机盐及营养元素，在恒温摇床中培养，培养温度28-37℃，培养时间48-72h，摇床转速150-200r/min，利用权利要求1所述三株枯草芽孢杆菌BIT09S1、BIT09S2、BIT09A2中的一株或多株发酵，所得发酵液经分离提纯，制得脂肽生物表面活性剂。

3.根据权利要求2的制备方法，其特征在于：所述液体培养基中最经济有效的碳源，按重量浓度计为糖蜜1-3％、瓜尔胶破胶液1-2％或淀粉1-3％。

4.根据权利要求2的制备方法，其特征在于：所述液体培养基以麦芽糖、糖蜜、魔芋胶精粉或瓜尔胶破胶液为碳源，以谷氨酸、大豆粉、蛋白胨、NH4NO3、(NH4)2SO4中的一种或多种为氮源；以K2HPO4.3H2O、MgSO4.7H2O、CaCl2.2H2O、FeSO4.7H2O、NaH2PO4.2H2O、MnCl2.4H2O、CuSO4.5H2O、KCl、NaCl和酵母粉中的一种或多种为无机盐和营养元素，可高效制备脂肽生物表面活性剂。

5.根据权利要求2的制备方法，其特征在于：所述氮源、无机盐及营养元素，其用量为(g/L)：NH4NO31.0-4.0，K2HPO4.3H2O 3-5，NaH2PO4.2H2O 7-15，MgSO4.7H2O 0.1-0.3，MnCl2.4H2O 0.001-0.010，酵母粉0.1-0.3。

6.根据权利要求2的制备方法，其特征在于：所述Bacillussubtilis BIT09A2的最优液体培养基为(g/L)：糖蜜20、NH4NO32.0，K2HPO4.3H2O 3.0，NaH2PO4.2H2O 10，MgSO4.7H2O 0.2，MnCl2.4H2O 0.002，酵母粉0.2；

所述Bacillus subtilis BIT09S1的最优液体培养基为(g/L)：瓜尔胶破胶液1000mL(含0.45％单糖)，NH4NO32.0，K2HPO4.3H2OO 3.0，NaH2PO4.2H2O 10，MgSO4.7H2O 0.2，MnCl2.4H2O 0.002，酵母粉0.2；

所述Bacillus subtilis BIT09S2的最优液体培养基为(g/L)：麦芽糖67、豆粉40、K2HPO45、MgSO4.7H2O 0.5、CaCl2.2H2O 0.18、FeSO4.7H2O 0.025、MnCl2.4H2O 0.022、酵母提取物1。

7.根据权利要求2的制备方法，其特征在于：所述液体培养基中的碳源为油田用植物胶(瓜尔胶或改性瓜尔胶，优选羟丙基瓜尔胶)破胶液是以羟丙基瓜尔胶的水溶液为基液，向其中加入可市购的酶博士

生物酶破胶剂、助排剂、生物杀菌剂、发泡剂、温度稳定剂、粘土稳定剂、防膨剂、pH调节剂，通过1％的硼砂水溶液(交联比为100∶5，v/v)交联后经破胶得到。

8.根据权利要求7的制备方法，其特征在于：所述油田用植物胶为瓜尔胶或改性瓜尔胶，优选羟丙基瓜尔胶。

9.根据权利要求7的制备方法，其特征在于：所述油田用植物胶破胶液是以重量浓度1-2的羟丙基瓜尔胶的水溶液为基液，向其中加入可市购的酶博士

生物酶破胶剂至终浓度15-20ppm、助排剂CF-5C至终重量浓度0.5％、生物杀菌剂鼠李糖脂至终浓度20-30ppm、粘土稳定剂COP-1至终重量浓度0.3-0.5％或KCl至终重量浓度1.0％、pH调节剂碳酸钠至终重量浓度0.05-0.1％，通过重量浓度1％的硼砂水溶液交联后经破胶得到，交联比为100∶5，v/v。