CN109022329B - 一种产生物表面活性剂的双头菌菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产生物表面活性剂的双头菌菌株。该菌株分离自延长油田坪桥区块的油水样中，经16S rDNA序列鉴定属于双头菌属(Labrys sp.)，保藏编号CGMCC No.16012。该菌株在以原油(或菜油)50g/L，(NH4)2SO410.0g/L，KCl 1.1g/L，NaCl 1.1g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO43.4g/L，K2HPO44.4g/L，酵母粉0.5g/L的培养基中于30℃、160rpm恒温振荡培养5d后可使培养基的表面张力由初始的71.2mN/m降至32.1mN/m，其产生的表活剂属于糖脂类生物表面活性剂，具有很好的应用潜力。

Description

一种产生物表面活性剂的双头菌菌株
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株双头菌(Labrys sp.)菌株HM11(HM-11)及其所产生的生物表面活性剂。
背景技术
表面活性剂是具有表面活性的两亲化合物。传统化学合成的表面活性剂成本高且对环境污染严重。而由微生物所合成的生物表面活性剂，具有低毒性、可生物降解性和环境相容性，及能适应极端环境等优点，是化学表面活性剂的良好的替代物。
尤其是在原油开采领域，对于已处于进行水驱(或气体驱)的二次开采阶段的油田。如何采出二次开采后仍留在油井中的近50％的原油是急需攻克的重要技术难题。其中，生物表面活性剂可以降低油-水界面处的界面张力，提高洗油效率，这是三次采油微生物提高原油采收率(MEOR)的重要机理之一。因此，急需筛选适应油藏环境的高产表面活性剂的微生物。
目前已报道产表面活性剂的微生物包括细菌、真菌及酵母菌等。其中，细菌占大多数，尤其是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，此外还包括霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)、链球菌属(Streptococcus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，及固氮菌属(Azotobacter sp.)等。对其他菌属产表活剂的菌株报道仍然很少。
目前还没有关于双头菌产表面活性剂的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种产生物表面活性剂的双头菌菌株。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供的双头菌菌株，命名为双头菌(Labrys sp.)菌株HM11，其保藏编号为CGMCC No.16012。
本发明提供的表面活性剂是利用上述双头菌(Labrys sp.)菌株HM11对原油或植物油(例如，菜油)进行生物转化而得到的。
优选的，所述表面活性剂为糖脂类的生物表面活性剂。
上述表面活性剂的制备方法包括以下步骤：
1)对所述双头菌(Labrys sp.)菌株HM11进行种子培养；
2)将种子培养得到的双头菌种子以原油或植物油为碳源进行增殖培养，增殖培养时间根据培养体系表面张力变化情况确定，培养结束得发酵液；
3)将发酵液经碱沉、离心、萃取、减压浓缩，以及冷冻干燥，即得表面活性剂。
优选的，所述种子培养采用液体LB培养基，并于28～32℃振荡培养至对数生长期，得双头菌种子。
优选的，所述增殖培养采用添加有原油或植物油的无机盐培养基，原油或植物油的添加比例为无机盐培养基体积的4～6％；增殖培养的条件为：于28～32℃、150～170rpm下振荡培养60小时以上。
优选的，所述无机盐培养基的配方为：(NH4)2SO4 9.0～11.0g/L、KCl 1.0～1.2g/L、NaCl 0.9～1.3g/L、MgSO4 0.4～0.6g/L、KH2PO4 3.1～3.7g/L、K2HPO4 4.2～4.6g/L，以及酵母粉0.4～0.6g/L。
优选的，所述碱沉的条件为：用NaOH调节发酵液pH值为7.8～8.2后于78～82℃水浴中处理14～16min。
优选的，所述离心的条件为：9000～11000rpm离心14～16min。
优选的，所述萃取具体包括的步骤为：用HCl调节离心所得上清液的pH值至1.9～2.1，然后用氯仿/甲醇混合溶剂进行萃取，氯仿:甲醇的体积比为1.9～2.1:1。
优选的，所述减压浓缩具体包括的步骤为：将萃取得到的下层萃取液于43～47℃旋转蒸发，直至得到淡黄色固体物质。
本发明的有益效果体现在：
本发明从油田坪桥区块的油水样中筛选得到了一株产表面活性剂的菌株，经16SrDNA序列鉴定属于双头菌属(Labrys sp.)，命名为双头菌(Labrys sp.)菌株HM11(CGMCC No.16012)，其在生长过程中可持续产生糖脂类的生物表面活性剂。本发明筛选的双头菌(Labrys sp.)菌株HM11可以以原油或植物油(例如，菜油)等为碳源，具有生长速度快、产表面活性剂能力强的优点，且表面活性剂容易分离纯化，在生物表面活性剂制备、原油开采等领域具有很好的应用潜力。
附图说明
图1为菌株HM11的16S rDNA的进化树。
图2为菌株HM11在液体培养基中的生长与表面张力变化图。
图3为菌株HM11所产表面活性剂的红外光谱。
图4为生物表面活性剂浓度与表面张力的关系图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
(一)培养基配方
1、无机盐培养基(g/L)：(NH4)2SO4 10.0，KCl 1.1，NaCl 1.1，MgSO4 0.5，KH2PO43.4，K2HPO4 4.4，以及酵母粉0.5；使用纯水定容至1L，121℃灭菌20min，备用。
2、蓝色凝胶培养基(g/L)：牛肉膏1.0，蛋白胨5.0，酵母膏0.2，葡萄糖20.0，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)0.2，亚甲基蓝0.005，以及琼脂粉15.0；使用纯水定容至1L，121℃灭菌20min，备用。
3、LB培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母膏5.0，以及NaCl 10.0(若是固体平板则额外添加琼脂粉15.0)；使用纯水定容至1L，pH 7.0，121℃灭菌20min，备用。
(二)双头菌(Labrys sp.)菌株的筛选
1、菌株的富集
将延长油田坪桥区块的油水样在采出后24h内于6000rpm离心30min，收集沉淀，接种于100mL的以菜油(2％)为碳源的无机盐培养基中，放入30℃摇床，于转速160rpm培养，培养5天后以10％的接种量转接至新鲜的培养基中继续培养。同样条件连续转接3代。
2、单菌株的分离
在菌群驯化3代后，在无菌条件下，将驯化后得到的混合菌群分别稀释0、100、10000倍涂布到蓝色凝胶培养基(平板)，倒置于30℃的恒温培养箱中培养5d。然后根据菌落的颜色、形态、大小等不同的特征，从平板选取单菌落，分别在新的平板上划线分离，倒置于30℃的恒温培养箱中培养5d。若单菌株未被完全分离出来，则需将菌落在新的平板上划线分离、培养，直到分离出单菌株。
本发明从筛选到的12株单菌株中得到一株产表活剂能力较强的菌株HM11。
(三)单菌株HM11的鉴定
分离的菌株通过比对16S rDNA序列来确定种属。使用上海生工的Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取菌株HM11的基因组，并以此为模板，使用下列引物对16S rDNA序列进行PCR扩增：
上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’
下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反应体系如下：
Figure BDA0001794934850000031
Figure BDA0001794934850000041
PCR反应条件：预变性94℃ 3min；30次循环：变性94℃ 30s，退火57℃ 30s，延伸72℃ 2min；后续延伸72℃ 5min，4℃停止反应并保温。
得到的PCR产物经回收纯化后，送至上海生工生物工程有限公司进行Sanger测序。所得序列经BLAST(NCBI)后，使用MEGA软件绘制进化树(图1)。最终确定菌株HM11属于双头菌属(Labrys sp.)，命名为Labrys sp.HM11。
所述菌株HM11已于2018年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.16012，分类命名为双头菌(Labrys sp.)。
(四)菌株HM11在液体培养基中的生长及表面张力变化
从LB平板(4℃保藏HM11)挑取单菌，接种于5mL液体LB培养基中，于30℃过夜振荡培养(160rpm)至对数生长期。以此为种子液，按照5％(v/v)的接种量接种至由无机盐培养基以及该无机盐培养基体积5％的原油(碳源)共同组成的液体培养基(120mL)中，于30℃、160rpm恒温振荡培养。定期用无菌注射器取样测定菌浓(OD600)及表面张力(图2)。
参见图2，菌株HM11种子在接种后，不经延迟期，直接进入对数生长期，OD600迅速上升，表明HM11的适应能力很强，能迅速适应环境，进入代谢活跃、繁殖旺盛的时期。随着培养基中的营养物质不断被消耗，细菌的增殖速率不断下降，死亡速率不断上升。60h左右，对数生长期结束，HM11进入稳定期，OD600维持在1.0左右。此时细菌的增殖速率与衰亡速率大致相同，细菌的数量保持稳定。而在整个培养过程中，培养基的表面张力一直在下降，说明HM11一直在生成表面活性剂，并不受培养时期的影响。培养120h后，培养基的表面张力最终降至32.1mN/m，得发酵液。
(五)菌株HM11所产表面活性剂的提纯及红外光谱分析
1、表面活性剂的提纯方法
使用NaOH溶液(2mol/L)将发酵液pH值调至8.0，置于80℃水浴中15min，增加表面活性产物的溶解性，使蛋白等物质变性析出，然后10000rpm离心15min(4℃)，去除菌体及其他不溶性物质；将上清液用2mol/L的HCl溶液调节pH值至2.0；加入等体积的氯仿/甲醇(v/v＝2:1)萃取3次，合并下层(氯仿)萃取液；于45℃，50r/min下，真空旋转蒸发；得到淡黄色固体物质，将其溶解于二氯甲烷中，真空冷冻干燥后，得到表面活性剂产物。
2、表面活性剂的红外光谱分析
将冷冻干燥后的表面活性剂粉末与KBr混合压片后进行红外光谱分析。产自菌株HM11的表面活性剂红外光谱图(图3)上的2961cm-1、2925cm-1和2851cm-1的吸收峰是脂肪链中-CH2-和-CH3基团C-H键的伸缩振动峰；1638cm-1和1385cm-1处的强伸缩振动峰表明存在酯羰基结构(C＝O)，是生物表面活性剂的典型特征峰；1080cm-1附近的强吸收峰可能与生物表面活性剂中多糖或多糖类物质的存在有关。由红外光谱分析结果推断，菌株HM11所产的表面活性剂属于糖脂类的生物表面活性剂。
本发明在利用菌株HM11发酵生产生物表面活性剂中既可以以原油为碳源，也可以以菜油(5％)为碳源，即该生物表面活性剂的发酵生产过程可以不消耗原油。
(六)生物表面活性剂的表面活性作用实验
将冷冻干燥后的表面活性剂粉末配制成不同浓度的水溶液(使用超纯水配制)，在30℃、常压下测量水溶液的表面张力，并绘制表面活性剂浓度与表面张力的对应曲线(图4)。随着表面活性剂浓度的增加，表面张力逐渐下降。当浓度增加到80mg/L时，表面张力降至30mN/m。之后随着表面活性剂浓度的不断提高，表面张力不再有明显变化。即该生物表面活性剂可将水的表面张力降至30mN/m，且其临界胶束浓度(CMC)约为80mg/L，远低于其他化学表面活性剂，如十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵的CMC值，表明该生物表面活性剂仅需较小的浓度就能让水溶液的表面张力降至较低的水平。
(七)生物表面活性剂在原油开采中的应用
目前生物表面活性剂在驱油方面的应用，一般都是先通过发酵的方法转化得到生物表面活性剂，经提取纯化后将所得生物表面活性剂注入到油井中。本发明对从油田坪桥区块的油水样中筛选分离的菌株HM11，在以原油50g/L、(NH4)2SO4 10.0g/L、KCl 1.1g/L、NaCl 1.1g/L、MgSO4 0.5g/L、KH2PO4 3.4g/L、K2HPO4 4.4g/L，以及酵母粉0.5g/L为组分的液体培养基中于30℃、160rpm恒温振荡培养5d后可使培养基的表面张力由初始的71.2mN/m降至32.1mN/m，不仅表明菌株HM11能以原油为碳源生长，而且菌株HM11具有直接注入到油井中并原位生产表面活性剂的潜力。

Claims (10)

1.一种双头菌(Labrys sp.)菌株，其特征在于：该菌株的保藏编号为CGMCC No.16012。
2.一种表面活性剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)对双头菌(Labrys sp.)菌株进行种子培养，该菌株的保藏编号为CGMCC No.16012；
2)将种子培养得到的双头菌种子以原油或植物油为碳源进行增殖培养，增殖培养时间根据培养体系表面张力变化情况确定，培养结束得发酵液；
3)将发酵液经碱沉、离心、萃取、减压浓缩，以及冷冻干燥，即得表面活性剂。
3.根据权利要求2所述一种表面活性剂的制备方法，其特征在于：所述种子培养采用液体LB培养基，于28～32℃振荡培养至对数生长期，得双头菌种子。
4.根据权利要求2所述一种表面活性剂的制备方法，其特征在于：所述增殖培养采用添加有原油或植物油的无机盐培养基，原油或植物油的添加比例为无机盐培养基体积的4～6％；增殖培养的条件为：于28～32℃、150～170rpm下振荡培养60小时以上。
5.根据权利要求4所述一种表面活性剂的制备方法，其特征在于：所述无机盐培养基包括以下组分：(NH4)2SO4 9.0～11.0g/L、KCl 1.0～1.2g/L、NaCl 0.9～1.3g/L、MgSO40.4～0.6g/L、KH2PO4 3.1～3.7g/L、K2HPO4 4.2～4.6g/L，以及酵母粉0.4～0.6g/L。
6.根据权利要求2所述一种表面活性剂的制备方法，其特征在于：所述碱沉的条件为：用NaOH调节发酵液pH值为7.8～8.2后于78～82℃水浴中处理14～16min。
7.根据权利要求2所述一种表面活性剂的制备方法，其特征在于：所述萃取具体包括的步骤为：用HCl调节离心所得上清液的pH值至1.9～2.1，然后用氯仿/甲醇混合溶剂进行萃取，氯仿:甲醇的体积比为1.9～2.1:1。
8.一种如权利要求1所述的双头菌(Labrys sp.)菌株在制备表面活性剂中的应用或在原油开采中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述表面活性剂是利用双头菌(Labryssp.)菌株对原油或植物油进行生物转化而得到的，该菌株的保藏编号为CGMCC No.16012。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述表面活性剂为糖脂类的生物表面活性剂。
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