CN104277986A - 撕裂蜡孔菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株撕裂蜡孔菌菌株，命名为撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU，该菌株己经保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年5月28日，保藏编号为CCTCCM2014230，保藏单位的地址为中国湖北武汉，武汉大学。本发明菌株可以以植物油底物发酵生产甘露糖赤藓糖醇脂，底物为可再生资源，来源广泛，底物和产物无毒、环保，发酵液具有高表面活性。利用本发明菌株发酵生产甘露糖赤藓糖醇脂，发酵过程中菌丝团小，底物转化充分，粗产物产量高。

Description

撕裂蜡孔菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种真菌，尤其涉及一株撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)菌株及其应用。 
背景技术
甘露糖赤藓糖醇脂(Mannosylerythritol lipids，MELs)是一种糖脂类生物表面活性剂。MELs不仅具有良好的表面活性、乳化性、生物降解性、较低的临界胶束浓度，还具有许多特殊的生理活性，如抑制微生物生长、诱导细胞变异、可分化人类骨髓性白血病细胞系和黑素瘤细胞、提高基因转染效率、与糖蛋白有很强的配位能力等，可应用于环保、食品、化妆品、医药等行业。 
关于MELs的生物转化研究，国内报道较少。华兆哲等研究南极假丝酵母Candida antarctic WHS112利用豆油为唯一碳源，生产获得了甘露糖赤藓糖醇脂(华兆哲，陈坚，朱文昌，等.假丝酵母(Candida antarctic WSH112)生产生物表面活性剂及降解正构烷烃的研究.南京大学学报(自然科学)，1998，32(2)：149-154)，但是产量不高。Rau等研究了以蚜虫拟酵母Pseudozyma aphidis DSM 70725发酵大豆油生产MELs。在发酵过程中通过补料，并添加甘露糖和赤藓糖醇，经过10天的发酵，最高产量可达75g/L(U.Rau，L.A.Nguyen，S.Schulz，et al.Formation and analysis of mannosylerythritol lipids secreted by Pseudozyma aphidis.Appl Microbiol Biotechnol，2005，66：551-559)。除了优化生产工艺，筛选新的生产菌种，也成为提高MELs产量的一条途径。 
撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)是一种具有多种用途的真菌。CN102807956A公开了撕裂蜡孔菌可以应用于生物转化制备2’，4’-二羟基-6’-甲氧基-3’，5’-二甲基查尔酮(DMC)。CN103173357A公开了撕裂蜡孔菌可以应用于治疗贫血、心脏病、肺结核、肺心病、肺癌、骨髓瘤、白血病、子宫肌瘤。Ying等研究报道了从撕裂蜡孔菌中分离出三萜类物质，对人肿瘤细胞具有毒性作用(You-Min Ying et al.Ceriponols A-K，tremulane sesquitepenes from Ceriporia lacerate HS-ZJUT-C 13A，a fungal endophyte of Huperzia serrata.Phytochemistry，2013，95，360-367)。 
发明内容
本发明提供了一株高产甘露糖赤藓糖醇脂撕裂蜡孔菌菌株。 
一株撕裂蜡孔菌菌株，命名为撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU，该菌株已经保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年5月28日，保藏编号为CCTCC NO: M2014230，保藏单位的地址为中国湖北武汉，武汉大学。 
所述撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU的rRNA基因的ITS片段序列如SEQ ID NO.1所示。 
菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上25℃～28℃培养3～7天，菌落呈白色，绒毛 状，菌丝多隔，分枝，长45mm，直径1.5-3μm。 
本发明还提供了包含所述撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU的菌剂。 
本发明提供了所述撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU在发酵生产甘露糖赤藓糖醇脂中的应用。 
本发明又提供了一种生产甘露糖赤藓糖醇脂的方法，包括以下步骤：将所述撕裂蜡孔菌菌株接入种子培养基中进行种子培养，培养后分离得到菌体细胞，将菌体细胞接入发酵培养基，发酵完成后，从发酵液中分离得到甘露糖赤藓糖醇脂。 
所述发酵培养基以植物油作为碳源，优选的，所述植物油为大豆油、花生油和菜籽油中的一种或多种混合。 
发酵培养的温度28～30℃，时间为7-15d。 
所述分离甘露糖赤藓糖醇脂的方法包括：对发酵液离心，取液相，加入萃取剂萃取，合并有机相，最后除去萃取剂。 
本发明菌株可以以植物油底物发酵生产甘露糖赤藓糖醇脂，底物为可再生资源，来源广泛，底物和产物无毒、环保，发酵液具有高表面活性。利用本发明菌株发酵生产甘露糖赤藓糖醇脂，发酵过程中菌丝团小，底物转化充分，粗产物产量高。 
附图说明
图1为本发明菌株的菌落形态图。 
图2为本发明菌株的显微镜图。 
图3为本发明菌株的电镜图。 
具体实施方式
实施例1菌株的分离纯化、鉴定和保藏 
1、土壤菌株的分离纯化 
采用稀释平板涂布法从土壤中分离并筛选，得到一株真菌菌株。具体为：取10g土壤，加入100mL无菌水，混匀，制成悬液。取100μL悬液于PDA平板培养基上，并涂布均匀。置于25～28℃的培养箱培养7天，直到长出肉眼可见的菌落。挑取出绒毛状单菌落，接种到新的培养基，进行纯化分离，得到单一菌株。 
2、菌株的诱变 
采用常温等离子体诱变技术，对上述单一的菌株进行诱变，筛选得到目的菌株。具体为：将真菌菌株在PDA培养基上培养4天，取一环接种到含有玻璃珠的液体培养基中，在28℃，220rmp下培养3天，得到菌悬液。将菌悬液稀释到OD600＝0.5～0.7，用于诱变处理。菌悬液经过60s常温等离子体诱变处理后，用1.5mL无菌生理盐水洗脱到EP管中，得到新的菌悬液。将新的菌悬液进行稀释，取稀释梯度为10-1～10-4的菌液涂布于PDA平板上，在28℃下培养10天，待长出肉眼可见的菌落，挑选出长势较好的40株菌落进行复筛，经过3次复筛驯化比较，得到目的菌株。 
3、菌株的序列测定 
用PCR扩增产物进行切胶纯化测序，将测序结果与所有已知的ITSrDNA序列进行最大同源性比较，发现该菌与已知的撕裂蜡孔菌的ITSrDNA具有很高的同源性，其中与Ceriporia lacerata strainATCC 42010的同源性达到99％。菌株在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上25℃～28℃培养3～7天，菌落呈白色，绒毛状，菌丝多隔，分枝，长45mm，直径1.5-3μm。结合该细菌的培养特征、形态特征，确定该菌株为撕裂蜡孔菌。 
4、菌株的保藏 
将上述撕裂蜡孔菌菌株，命名为撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年5月28日，保藏编号为CCTCC NO: M2014230，保藏单位的地址为中国湖北武汉，武汉大学。 
实施例2撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU发酵制备甘露糖赤藓糖醇脂 
1、菌种活化：以PDA培养基为活化培养基，接入撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate CHZJU)，在28℃条件下活化培养3天，待菌丝体长满平板备用。 
2、种子培养：从平板培养基上挑取1cm×1cm的菌丝块3块接入装有50mL种子培养液的250mL三角瓶中，在28℃、220rpm条件下4天；将培养好的种子液体离心，取菌体细胞，并用0.9％氯化钠溶液洗涤3次； 
其中，种子培养液组分包含葡萄糖4.0％，硝酸钠0.3％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.1％，蒸馏水。 
3、发酵培养：将菌体细胞按湿重比例10g/L接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃、220rpm条件下培养10天； 
其中，发酵培养基的成分包括：大豆油8.0％，蛋白胨0.1％，硝酸钠0.2％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，硫酸锰0.02％，硫酸铜0.02％，酵母粉1.0％，蒸馏水。发酵培养基中加入已灭菌的玻璃珠。 
4、分离纯化：发酵培养完成后，离心，除去菌体及玻璃珠，得到发酵液；发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取、分离2次，合并有机相，并用旋转蒸发仪减压浓缩除去萃取溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂的粗品，约为80g/L。 
实施例3撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU发酵制备甘露糖赤藓糖醇脂 
1、菌种活化：以PDA培养基为活化培养基，接入撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate CHZJU)，在30℃条件下活化培养3天，待菌丝体长满平板备用。 
2、种子培养：从平板培养基上挑取1cm×1cm的菌丝块3块接入装有50mL种子培养液的250mL三角瓶中，在30℃、220rpm条件下4天；将培养好的种子液体离心，取菌体细胞，并用0.9％氯化钠溶液洗涤3次； 
其中，种子培养液组分包含葡萄糖4.0％，硝酸钠0.3％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.1％，蒸馏水。 
3、发酵培养：将菌体细胞按湿重比例10g/L接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在30℃、220rpm条件下培养10天； 
其中，发酵培养基的成分包括：调和油(按照体积比计算，组成为大豆油∶花生油∶菜籽油＝6∶3∶1)10.0％，硝酸钠0.3％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，硫酸锰0.02％，硫酸铜0.02％，酵母粉1.0％，蒸馏水。发酵培养基中加入已灭菌的玻璃珠。 
4、分离纯化：发酵培养完成后，离心，除去菌体及玻璃珠，得到发酵液；发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取、分离2次，合并有机相，并用旋转蒸发仪减压浓缩除去萃取溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂的粗品，约为88g/L。 
实施例4撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU发酵制备甘露糖赤藓糖醇脂 
1、菌种活化：以PDA培养基为活化培养基，接入撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate CHZJU)，在28℃条件下活化培养3天，待菌丝体长满平板备用。 
2、种子培养：从平板培养基上挑取1cm×1cm的菌丝块3块接入装有50mL种子培养液的250mL三角瓶中，在28℃、220rpm条件下4天；将培养好的种子液体离心，取菌体细胞，并用0.9％氯化钠溶液洗涤3次； 
其中，种子培养液组分包含葡萄糖4.0％，硝酸钠0.3％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，酵母粉0.1％，蒸馏水。 
3、发酵培养：将菌体细胞按湿重比例10g/L接入装有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，在28℃、220rpm条件下培养15天； 
其中，发酵培养基的成分包括：橄榄油8.0％，硝酸钠0.3％，硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.03％，硫酸锰0.02％，硫酸铜0.02％，酵母粉1.0％，蒸馏水。发酵培养基中加入已灭菌的玻璃珠。 
4、分离纯化：发酵培养完成后，离心，除去菌体及玻璃珠，得到发酵液；发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取、分离2次，合并有机相，并用旋转蒸发仪减压浓缩除去萃取溶剂，得到甘露糖赤藓糖醇脂的粗品，约为73.6g/L。 
综上述实施例2-4可以看出，采用实施例1所述的撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU，可以用于生产甘露糖赤藓糖醇脂，而且工艺简单。本发明的撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU的菌剂，丰富了产甘露糖赤藓糖醇脂的菌种新资源。 

Claims (10)

1.撕裂蜡孔菌菌株，其特征在于，命名为撕裂蜡孔菌(Ceriporia lacerate)CHZJU，保藏编号为CCTCC M2014230，保藏日期为2014年5月28日。
2.如权利要求1所述的撕裂蜡孔菌菌株，其特征在于，菌株的rRNA基因的ITS片段序列如SEQ ID NO.1所示。
3.一种包含权利要求1所述撕裂蜡孔菌菌株的菌剂。
4.如权利要求1所述撕裂蜡孔菌菌株在发酵生产甘露糖赤藓糖醇脂中的应用。
5.一种生产甘露糖赤藓糖醇脂的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述撕裂蜡孔菌菌株接入种子培养基中进行种子培养，培养后分离得到菌体细胞，将菌体细胞接入到发酵培养基，发酵完成后，从发酵液中分离得到甘露糖赤藓糖醇脂；所述发酵培养基中含有植物油。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述植物油为大豆油、橄榄油、菜籽油、葵花籽油、花生油、棉籽油、米糠油、玉米胚芽油、油茶籽油、红花籽油和小麦胚芽油中的至少一种。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基以植物油作为唯一碳源。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，以重量百分比计，所述的发酵培养基包括以下成分：植物油4.0～12.0％，蛋白胨0～1.0％，硝酸钠0.1～1.0％，硫酸镁0.01～0.1％，磷酸二氢钾0.01～0.1％，硫酸锰0.01～0.1％，硫酸铜0.01～0.1％，酵母粉0.1～1.0％。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵的温度为28～30℃，时间为7～15天。
10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分离的方法包括：将发酵液离心，取液相，然后加入萃取剂萃取，合并有机相，最后除去萃取剂。
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