CN104388497B - 利用红松头霉菌生产红景天苷和酪醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用红松头霉菌生产红景天苷和酪醇的方法，所述的红松头霉菌是保藏编号为CGMCC No.9347的菌株。所述生产红景天苷和酪醇的方法，是将这种真菌发酵培养，对发酵液或菌丝进行提取，获得含有红景天苷和酪醇的粗提物。红景天苷最高含量可达0.621mg/g，酪醇最高含量可达0.463mg/g。该方法具有高效、绿色、简便、能够连续生产、成本低廉等诸多优点，为生产红景天苷和酪醇提供了一种新途径。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体属于一种利用红松头霉菌生产红景天苷和酪醇的方法。
背景技术
红景天苷(Salidroside)和酪醇(p-tyrosol)是红景天(Rhodiola sp.)植物的主要活性成分，具有抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗疲劳等多方面的生物活性，被广泛应用于食品、化妆品、药品等多个领域，受到深海、高山作业者，航天员等多行业人员的青睐，市场需求逐年上升，供求关系十分突出。
植物是获取红景天苷和酪醇的主要来源，这导致野生红景天，尤其是青藏高原的大花红景天(R.crenulata)和东北的库叶红景天(R.sachalinensis)等主要品种，资源储藏量急剧减少，物种面临被灭绝的危险。人们将野生资源引种驯化进行人工栽培，取得了一定进步，但面临着生长周期过长(3年以上)、有效成分偏低、容易发生变种、种植地域受限(海拔高)、大量占用耕地等诸多问题。近年来，随着组培技术和细胞悬浮培养技术的进步，人们尝试用工业化生产方法实现红景天苷和酪醇的快速获取，但面临着生物量积累成本高、有效成分含量低等问题，截止目前，尚无工业化生产的报道。
也有报道人们以酪醇和葡萄糖及其类似物为底物，采用重金属盐为催化剂合成红景天苷，但原料成本高、催化效率低、重金属污染、提取工艺复杂等成为严重制约因素。人们也尝试用微生物或酶法催化合成红景天苷，但效果都不理想。
本发明则是从多年生红景天根部数百株共生真菌菌株中筛选获得1株真菌，通过常规发酵培养，即可获得红景天苷和酪醇，具有高效、绿色、简便、能够连续生产、成本低廉等诸多优点，是生产红景天苷和酪醇的新途径，在缓解红景天苷和酪醇的紧张供求关系、保护野生植物等方面具有重要价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够通过发酵培养产生红景天苷和酪醇的真菌。
本发明的另一目的在于提供一种利用这种真菌发酵培养获得含有红景天苷和酪醇粗提物的方法。且该方法具有绿色、高效、简便、能够连续生产、成本低廉等诸多优点。
本发明提供的一种能够通过发酵培养产生红景天苷和酪醇的真菌，命名为ZPRa-R-1，鉴定为Phialocephala fortinii(红松头霉菌)，这株真菌于2014年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.9347，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
这株真菌的培养特性：在25℃条件下，用查氏培养基培养，生长10d的菌落直径为3.90cm。菌落呈灰黑色，中央隆起，深色毛状边缘。菌丝为短絮状，发达。菌落周围培养基透明，无明显分泌物，菌落背面为黑色。显微观察表明，该菌丝暗色、有隔、具分支；老菌丝颜色深、粗；新菌丝颜色浅、细；粗、细菌丝相连，介于0.8μm～4.5μm之间。不产分生孢子。
本发明提供的一种通过真菌发酵培养生产红景天苷和酪醇的方法，具体包括如下步骤：
(1)真菌培养及培养物制备
将保藏编号CGMCC No.9347的真菌接种于查氏培养基平板活化，在25-30℃条件下恒温培养，当菌落生长至直径为3-9cm左右时，作为真菌培养物的接种菌种；
配制查氏液体培养基，在500mL三角瓶中装液100-300mL，放5-10粒直径为3-5mm的玻璃珠，121℃灭菌20min，冷却，无菌接入5-6片直径为5mm的上述菌种菌片，在22-30℃，转速为150-250r/min，暗条件下摇床培养5-10d,停止发酵，备用；
(2)红景天苷和酪醇粗品的制备
收集上述发酵培养物，纱布过滤，获得菌丝和发酵液，分别按下列步骤提取红景天苷和酪醇：
A、发酵液中红景天苷和酪醇的提取
取真菌发酵液，按照体积比发酵液︰甲醇＝1︰5-10，加入甲醇，静置10min，用分液漏斗收集下层清液，去掉漂浮絮状物；在5000r/m条件下，将清液离心10min,收集上清液，旋转蒸发，挥干，得含有红景天苷和酪醇粗提物。
B、菌丝中红景天苷和酪醇的提取
将菌丝放滤纸上，40℃烘干，研细，过三号筛，置于锥形瓶中，称重，按1g︰5-10mL的比例加入甲醇，密封，浸泡30min，超声30min，收集滤液；滤渣按上述方法再重复提取2次；合并三次提取的滤液，在5000r/m条件下离心10min，旋转蒸发，得含有红景天苷和酪醇粗提物。
采用1H-NMR和HPLC方法分别鉴定红景天苷和酪醇，结果见图1和图2。按2010年《药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷和酪醇的含量。
实验证明，保藏编号为CGMCC No.9347的红松头霉菌可在发酵生产红景天苷和酪醇中应用。
与现有技术相比本发明的优点和效果：
本发明通过对保藏编号为CGMCC No.9347的红松头霉菌发酵培养，直接提取便可获得含有红景天苷和酪醇的粗品，两者的最高含量为0.621mg/g和0.463mg/g。该方法具有环保、廉价、操作简单、能连续生产等诸多优点，是获取天然红景天苷和酪醇的良好方法。
附图说明
图1本发明粗提物中红景天苷和酪醇HPLC鉴定图，图中：a、b图分别为发酵液和菌体提取物中红景天苷和酪醇的鉴定结果。
图2本发明粗提物中红景天苷和酪醇1H-NMR鉴定图，图中：a、b图分别为发酵液和菌体提取物中红景天苷和酪醇的鉴定结果，画圈部分为红景天苷和酪醇的NMR光谱特征。
具体实施方式
实施例1
(1)真菌培养及发酵物制备
将保藏编号CGMCC No.9347的真菌接种于查氏培养基活化，在25℃条件下恒温培养，当菌落生长至直径为3cm左右时，作为真菌培养物的接种菌种。
配制查氏液体培养基，在500mL三角瓶中装液100mL，放5粒直径为3mm的玻璃珠，121℃灭菌20min，冷却，无菌接入6片直径为5mm的上述菌种菌片，在25℃，转速为150r/min，暗条件下，摇床培养10d,停止发酵，备用。
(2)红景天苷和酪醇粗品的制备
收集上述发酵培养物，纱布过滤，获得发酵液，按照1(V):5(V)＝发酵液：甲醇的比例，加入甲醇，静置10min，用分液漏斗收集下层清液，去掉漂浮絮状物。在5000r/m条件下，将清液离心10min,收集上清液，旋转蒸发，挥干，得含有红景天苷和酪醇粗提物。
(3)对照：不添加真菌培养物，将同批次的查氏培养基进行同样的处理。
采用1H-NMR和HPLC方法分别鉴定红景天苷和酪醇，按2010年《药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷和酪醇的含量。具体结果见表1。
实施例2
(1)真菌培养及发酵
将保藏编号CGMCC No.9347的真菌接种于查氏培养基活化，在30℃条件下恒温培养，当菌落生长至直径为9cm左右时，作为真菌培养物的接种菌种。
配制查氏液体培养基，在500mL三角瓶中装液300mL，放10粒直径为5mm的玻璃珠，121℃灭菌20min，冷却，无菌接入5片直径为5mm的上述菌种菌片，在30℃，转速为250r/min，暗条件下，摇床培养5d,停止发酵，备用。
(2)红景天苷和酪醇粗品的制备
收集上述发酵培养物，纱布过滤，获取菌丝，将菌丝放滤纸上，40℃烘干，研细，过三号筛，置于锥形瓶中，称重，按1(g)：10(mL)的比例加入甲醇，密封，浸泡30min，超声30min，收集滤液。滤渣按上述方法再重复提取2次。合并三次提取的滤液，在5000r/m条件下离心10min,旋转蒸发，得含有红景天苷和酪醇粗提物。
采用1H-NMR和HPLC方法分别鉴定红景天苷和酪醇，按2010年《药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷和酪醇的含量。具体结果见表1。
实施例3
将保藏编号CGMCC No.9347的真菌接种于查氏培养基，在25℃条件下恒温培养，当菌落生长至直径为3-9cm左右时，将边缘部分活力旺盛菌丝重新接种于新的查氏培养基，当菌落长满培养皿时，用无菌接种铲将菌丝刮到滤纸上，放40℃烘干，研细，过三号筛，置于锥形瓶中，称重，按1(g)：5(mL)的比例加入甲醇，密封，浸泡30min，超声30min，收集滤液。滤渣按上述方法再重复提取2次。合并三次提取的滤液，在5000r/m条件下离心10min,旋转蒸发，得含有红景天苷和酪醇粗提物。
按2010年《药典》P144页记载的HPLC方法测定红景天苷和酪醇的含量。具体结果见表1。
表1.真菌促进大花红景天提高红景天苷和酪醇含量
Claims (3)
1.保藏编号为CGMCC No.9347的红松头霉菌在发酵生产红景天苷和酪醇中的应用。
2.一种通过真菌发酵生产红景天苷和酪醇的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将保藏编号CGMCC No.9347的真菌接种于查氏平板培养基活化，在25-30℃条件下恒温培养，当菌落生长至直径为3-9cm时，作为真菌培养物的接种菌种；
配制查氏液体培养基，在500mL三角瓶中装液100-300mL，放5-10粒直径为3-5mm的玻璃珠，121℃灭菌20min，冷却，无菌接入5-6片直径为5mm的上述菌种菌片，在22-30℃，转速为150-250r/min，暗条件下摇床培养5-10d,停止发酵，备用；
(2)收集上述发酵培养物，纱布过滤，取发酵液，按照体积比发酵液︰甲醇＝1︰5-10，加入甲醇，静置10min，用分液漏斗收集下层清液，去掉漂浮絮状物；在5000r/m条件下，将清液离心10min,收集上清液，旋转蒸发，挥干，得含有红景天苷和酪醇粗提物。
3.如权利要求2所述的一种通过真菌发酵培养生产红景天苷和酪醇的方法，其特征在于，将步骤(2)中经纱布过滤得到的菌丝放滤纸上，40℃烘干，研细，过三号筛，置于锥形瓶中，称重，按1g︰5-10mL的比例加入甲醇，密封，浸泡30min，超声30min，收集滤液；滤渣按上述方法再重复提取2次；合并三次提取的滤液，在5000r/m条件下离心10min，旋转蒸发，得含有红景天苷和酪醇粗提物。
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