CN1969930B - 一种微生物转化制备红景天提取物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用微生物与红景天共培养以制备其活性成分提取物的方法。该方法在当前提取方法的基础上用微生物与红景天共培养，使新工艺比现有工艺的浸取率大大提高，能有效利用野生资源，同时还能降低药渣等污染物的排量，实现中药的绿色开发，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于天然物质提取领域，具体地说涉及一种制备红景天提取物的方法。
背景技术
红景天是指景天科红景天属植物，在世界上有90余种，多分布在北半球的高寒地带，大多数都生长在海拔3500-5000米左右的高山流石或灌木丛林下。我国现发现有73种，主要分布在我国西藏的高山高寒地带，另外东北、西北、华北的一些地区也有红景天资源分布。
红景天的主要药用部位是根茎，主要有效成份是红景天素、红景天甙以及其甙元(酪醇)等，具有抗疲劳、抗缺氧、抗诱变和抑制肿瘤等功效，且本身并无副作用(宋月英等 红景天属植物化学成分及药理作用的研究进展 中草药.2004，35(2).-235-236；李刚等 藏药红景天的药理学研究进展中国民族医药杂志.2004，10(3).-38-40；王家明 闫继平 王盛虔 红景天的药理作用研究进展中医药学报.2003，31(4).-57-59)，因此在药品和保健食品的开发中得到了广泛的应用。
当前对红景天中的红景天素、红景天甙等活性成分的主要提取方法是水提法和醇提法，水法提取成本低，方法简单；醇法提取成本较前者高，但提取液中可溶性固形物的含量(得率)相对于水提法较高，故传统红景天提取提取物的制备以醇提为更为常用(余华 何志礼 红景天有效成分的提取和加工适应性研究食品工业科技2002，23(8).-47-49)。由于目前对红景天的大量开发利用，使这种我国的特有药材资源面临枯竭的危机，如何在当前提取法的基础上开发新的提取方法以提高红景天中有效成分的产率，从而提高红景天原药的利用率，成为当前本领域急需解决的问题。
发明内容
本发明解决的第一个技术问题是提供一种制备红景天的提取物的方法。该方法包括以下步骤：
a、准备红景天根茎原料；b、在每100重量份步骤a中准备好的红景天根茎原料中加入乙醇0.3～1份，对羟基苯乙醇0.6～2份，然后接种霉菌，进行培养；c、将步骤b所得产物进行醇提；d、除去c步骤产物中的醇，得红景天提取物。
优选的，乙醇加入0.6份，对羟基苯乙醇加入1.2份。
其中，上述方法步骤a中的红景天根茎原料准备过程是对红景天根茎进行粉碎、浸泡、加热蒸煮。
其中，上述方法的步骤b中还在每100重量份红景天根茎原料加入了0.05～0.5份酵母膏和0.05～0.2份磷酸二氢钾。
优选的，酵母膏加入0.2份，磷酸盐加入0.15份。
其中，上述方法的步骤b中的霉菌为曲霉属Aspergillus霉菌中的一种或多种。
优选的，上述的曲霉属霉菌为黑曲霉Aspergillus niger。
其中，上述方法步骤b中的培养为在温度28～30℃下培养40～48小时。
其中，上述方法的步骤c中醇提的条件为在80℃水浴中用醇回流浸提1～8次，每次醇加入量为使醇的终浓度为60％～85％，每次浸提时间为10～90min。优选为浸提3～5次，每次浸提时间20～60min。
优选的，上述的醇为乙醇。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种红景天提取物。该红景天提取物是由上述的方法所制备的。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述的红景天提取物在制备抗疲劳、抗缺氧或抗肿瘤的药物或保健食品中的用途。
红景天甙元及红景天甙的合成属次级代谢。微生物具有丰富的的代谢多样性和很强的代谢能力，在高等植物体内所有的代谢途径，在微生物中都有可能存在并且活性也有可能更强，而真菌与植物同属真核生物，更是有许多代谢途径可能相同或相似。红景天的主要药用成分甙元(酪醇)及红景天甙是在酚性结构基础上分别加上乙醇和葡萄糖所形成。在红景天原料里人为添加对羟基苯乙醇等辅料，再由微生物的酶系催化红景天原料中的葡萄糖和羟基苯乙醇等成分合成甙元及红景天甙。在比较若干株微生物对红景天植株组织的分解和转化结果，建立了本方法并确定了本发明所用真菌为霉菌，优选为曲霉属霉菌。
本发明方法在实际应用中为了加强效果，还可以在加入微生物发酵处理前使用微生物酶液预处理。上述微生物酶液是由以下方法制备得到的：将麸皮和水拌匀后在115～125℃灭菌25～35分钟，冷却后接种曲霉、木霉或根霉中的一种或多种，28～30℃培养36～48小时。然后加4～6倍水，在28～30℃下浸泡1～3小时，过滤或离心后取上清液，即得。将水、酶液与预处理后的原料按约1∶1∶1的比例混合，在30～50℃下保温酶解8～24小时。优选的，酶解温度为40℃，酶解时间约为12小时。实验证明其两步结合的提取产率更高。
现有的红景天活性成分提取物的提取工艺是直接用醇类(酒精等)直接浸泡提取红景天原料，提取率和药效受红景天品种，植株部位和分布地域等影响。本发明提供红景天活性成分提取物的制备方法与原工艺相比，在醇类提取之前，先用微生物共培养，通过微生物发酵转化来提高红景天中活性成分的含量，使新工艺比现有工艺的提取率大大提高，能有效利用野生资源；同时还能降低药渣等污染物的排量，有利于中药材的绿色开发。本发明红景天活性成分提取物中有效成分的含量比现有技术大为提高，其制备的药物组合物和保健食品的效果也得到了大大的增强，具有极好的市场前景。
下面通过对本发明较佳实施方式的详细描述以对本发明进行说明，但不应理解为是对本发明的限制。本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变型，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明所附权利要求所定义的范围。
具体实施方式
实施例一红景天提取物的制备
取10kg红景天根茎原料粉碎(40目)，加入3倍重量的水混合，加温至80～85℃蒸煮60分钟，降温至常温，在原料中加入对羟基苯乙醇0.02kg，乙醇0.03kg，混合均匀，按常规方法接种黑曲霉(Aspergillus niger)，在28～30℃培养48小时。向培养后的混合液中加入乙醇至终浓度70％，提取2次，每次0.5小时。提取液离心(1800r/min，8min)后用400目筛绢过滤，将滤液在真空度0.015Mpa下减压蒸馏除乙醇，干燥得到红景天提取物1850g。
实施例二红景天提取物的制备
取10kg红景天根茎原料粉碎(80目)，加入2倍重量的水混合，加温至95～100℃蒸煮30分钟，降温至常温。然后加入对羟基苯乙醇0.06kg，乙醇0.1kg，磷酸二氢钾0.02kg，酵母膏0.02kg，混合均匀，再按常规方法接种黑曲霉(Aspergillus niger)，于28～30℃培养40小时。向培养后的混合液中加入乙醇至终浓度75％，提取3次，每次1.5小时。提取液离心(1800r/min，8min)后用400目筛绢过滤，将滤液在真空度0.015Mpa下减压蒸馏除乙醇，干燥得到红景天提取物2160g。
实施例三红景天提取物的制备
取10kg红景天根茎原料粉碎(60目)，加入1倍重量的水混合，加温至110～120℃蒸煮40分钟，降温至常温，并加入乙醇0.06kg，对羟基苯乙醇0.15kg，磷酸二氢钾0.006kg，酵母膏0.06kg。混合均匀。接种黑曲霉(Aspergillus niger)，于28～30℃培养44小时。向培养后的混合液中加入乙醇至终浓度60％，提取5次，每次20分钟。提取液离心(1800r/min，8min)后用400目筛绢过滤，将滤液在真空度0.015Mpa下减压蒸馏除乙醇，干燥得到红景天提取物2050g。
实施例四红景天提取物的精制
取实施例一、二和三的产物按常规方法精制成浸膏。
实施例五红景天口服液的制备
取实施例四所制得的浸膏3kg，添加适量矫味剂、无菌水和其他常规辅料，按常规制药工艺制备成红景天口服液。
实施例六红景天胶囊的制备
取实施例四所制得的浸膏5kg，按常规制药工艺并添加适量药学上常用的辅料制备成红景天胶囊。
试验例一本发明方法的比较实验
1、试验材料
a、按常规醇提方法制备的红景天提取物
取60目粉碎的红景天原料200g，加入2倍重量的水混匀，85～95℃蒸煮40分钟，加入乙醇至终浓度85％，提取5次，共18个小时。提取液离心(1800r/min，8min)后抽滤，将滤液在真空度0.015Mpa下减压蒸馏除乙醇，得到红景天提取物。
b、按本发明方法制备的红景天提取物
分别取60目粉碎的红景天原料200g，加入2倍重量的水混匀，加温至110～120℃蒸煮40分钟，降温至常温，并加入乙醇0.06g，对羟基苯乙醇0.15g，磷酸盐0.6g，酵母膏0.6g。在蒸煮后的原料中接种黑曲霉(Aspergillus niger)，于28～30℃培养44小时。向培养后的混合液中加入乙醇至终浓度85％，提取3次，共18小时。提取液离心(1800r/min，8min)后抽滤，将滤液在真空度0.015Mpa下减压蒸馏除乙醇，得到红景天提取物。
然后将a和b所得提取液加去离子水调节至相同体积得红景天提取物样品溶液。
2、检测项目及检测方法
a、重氮盐比色法检测有效成份的含量(结果见表一)
重氮化试剂
甲液：用浓盐酸溶解对氨基苯磺酸制成10％的溶液。称取对氨基苯磺酸1g，加浓盐酸10ml充分溶解即得10％的盐酸对氨基苯磺酸溶液。放在100ml容量瓶中，加水稀释至100ml即得到1％的该溶液。
乙液：配10％的亚硝酸钠溶液。称取亚硝酸钠1g，加水至10ml，使之充分溶解即得10％的亚硝酸钠溶液。
重氮化反应的前处理
红景天的提取物中，仍然含有蛋白和多糖，以及一些色素等从而使得红景天的提取物呈现暗红棕色和浑浊，影响产物的比色。用醋酸铅除去多糖和蛋白，饱和硫酸钠除去多余的铅离子。取红景天提取物样品溶液5ml，加入10％的醋酸铅5ml和饱和的硫酸钠2ml，最后定容至25ml。沉淀完毕后8Krpm离心5min，取上清液用于重氮化反应。
重氮化显色反应
取上清液5ml于20ml刻度比色管中，在其中加2％碳酸钠3ml和重氮化试剂3ml，摇匀显色5min，再加5％氢氧化钠0.5ml显色15min。整个过程都保持在4℃以下，稀释至1/10，分光光度计测定在489nm处的吸光度值。
b、重量法测定红景天总物质溶出(结果见表一)
将称量皿在65℃烘箱中预烘一天，然后在102℃烘箱中烘至恒重，于天平上称重，为M1。取一定体积样品的红景天提取物，置于65℃烘箱中烘干，再在102℃烘箱中烘至恒重。同样在天平上称重，为M2。
干物质的重量M＝M2-M1。
总固形物溶出率＝M/25 *提取液总体积数/药材取样量
总固形物溶出率比＝各组总固形物溶出率/直接醇提的总固形物溶出率*100％
c、用高效液相色谱仪按中国药典2005年版一部附录VID的方法检测红景天苷和酪醇的含量(结果见表二)。
表一本发明方法的比较实验结果
| 有效成份的含量(重氮盐比色O.D489) | 总固形物溶出率比(％) | |
| 直接醇提产物 | 0.275 | 100 |
| 本发明方法产物 | 0.480 | 112.7 |
表中总物质溶出率参照酶解的结果
表二高效液相色谱检测红景天苷和酪醇的含量
| 酪醇峰面积 | 红景天苷峰面积 | 总面积 | |
| 原方法 | 5811261 | 25864046 | 31675307 |
| 酪醇峰面积 | 红景天苷峰面积 | 总面积 | |
| 本发明方法 | 7104304 | 43260500 | 50364804 |
本试验结果表明，本发明方法能极显著地提高提取物中总物质的溶出量和有效成份的得率。
上述实例表明本发明提供红景天活性成分提取物的制备方法与原工艺相比，所得的红景天活性成分提取物的活性成分含量大大提高，大大增加了原材料利用率并带来显著的经济效益；同时本方法能降低药渣污染物的排量，实现对红景天的绿色开发，具有极好的市场前景。
以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明作出各种改变及变形，只要不脱离本发明的精神，均属于本发明所附权利要求所定义的范围。
Claims (4)
1.一种制备红景天提取物的方法，其特征在于包括以下几个步骤：a、准备红景天根茎原料；b、在每100重量份步骤a中准备好的红景天根茎原料中加入乙醇0.3～1份，对羟基苯乙醇0.6～2份，然后接种霉菌，进行培养；c、将步骤b所得产物进行乙醇提取；d、除去c步骤产物中的乙醇，得红景天提取物；
其中，步骤b中所述的霉菌为黑曲霉Aspergillus niger，所述的培养为在培养温度28～30℃下培养40～48小时。
2.根据权利要求1所述的制备红景天提取物的方法，其特征在于：所述步骤a中的红景天根茎原料准备过程是对红景天根茎进行粉碎、浸泡、加热蒸煮。
3.根据权利要求1所述的制备红景天提取物的方法，其特征在于：所述步骤b还在每100重量份红景天根茎原料加入了0.1～0.6份酵母膏和0.1～0.6份磷酸二氢钾。
4.根据权利要求1所述的制备红景天提取物的方法，其特征在于：步骤c中所述的乙醇提取的条件为在80℃水浴中用乙醇回流浸提1～8次，每次乙醇加入量为使乙醇的终浓度为60％～85％，每次浸提时间为10～90min。
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