CN105296545A

CN105296545A - 微生物转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法

Info

Publication number: CN105296545A
Application number: CN201510747647.5A
Authority: CN
Inventors: 汤华钊; 陈良
Original assignee: Guizhou Tianhao National Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Guizhou Tianhao National Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-11-06
Filing date: 2015-11-06
Publication date: 2016-02-03

Abstract

本发明公开了天然产物化学技术领域的一种微生物转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法，其步骤为：液体培养基的制备：300g土豆削皮后切成丁状或片状，放入1500mL纯净水中，煮沸，过滤取滤液，于滤液中加入虎杖内生菌、葡萄糖、硝铵酸、蛋白胨，酒曲，搅拌混合均匀，调节pH为5；将能过80～100目筛的虎杖粉末500g放入发酵容器中，将液体培养基倒入发酵容器中，搅拌充分混匀，发酵温度35～40℃，发酵5～8天；然后依次回流提取；分离；干燥。本发明利用虎杖内生菌，采用微生物发酵技术，促进中药虎杖中虎杖苷转化为白藜芦醇，提高虎杖苷转化为白藜芦醇的转化率，使虎杖中白藜芦醇的提取率高达95%以上，使资源获得充分利用。

Description

微生物转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法

技术领域

本发明涉及天然产物化学技术领域，具体涉及一种微生物转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法。

背景技术

广而周知喝葡萄酒有益健康，现代研究表明，这是因为葡萄酒中含有高效抗氧化剂，而白藜芦醇就是其中之一。葡萄在生长过程中，为防止灰色霉菌感染而产生了一种植物抗霉素，该抗霉素就是白藜芦醇，主要存在于葡萄的皮中，是一种生物性很强的天然多酚类物质，多用作肿瘤、心脑血管疾病等的化学预防剂。除此之外，白藜芦醇还存在与蓼科植物虎杖的根和根茎、豆科花生的红衣和仁等植物中，其中，虎杖中白藜芦醇含量最高。

白藜芦醇在虎杖药材中主要以苷的形式存在，少量以游离的白藜芦醇并存。研究发现，白藜芦醇的糖苷衍生物虎杖苷和白藜芦醇具有相似的药理作用，且在虎杖中的含量大大超过白藜芦醇，但它的生物活性和价值却远不如白藜芦醇。所以，根据目前藜芦醇在市场上需求量的增大，本领域内大多学者研究从植物中提取白藜芦醇的方法。

检索发现，关于“从虎杖中提取白藜芦醇”方面的文献和专利已有报道。中国专利“虎杖苷和白藜芦醇的新制备方法”（ZL200310112538.3）公开的是采用聚酰胺层析法分离纯化白藜芦醇。但是因该方法是将虎杖中的虎杖苷和白藜芦醇分别提取，不能在提取的同时将虎杖中的虎杖苷转化成白藜芦醇，所以采用该方法提取白藜芦醇的获得率低；中国专利“一种从中药虎杖中制备白藜芦醇的工艺”（CN201210344092.6）将虎杖先用复合酶发酵再提取，再用大孔树脂分离纯化白藜芦醇。该方法制得的白藜芦醇产品纯度可达65%以上。但该方法的虎杖中虎杖苷的转化率不高，从而白藜芦醇的获得率低。

发明内容

针对上述存在的技术问题，本发明提供一种中药虎杖中提取白藜芦醇的方法，该方法有助于促进虎杖药材中的虎杖苷转化为白藜芦醇，进而提高白藜芦醇获得率。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：微生物转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法，步骤包括粉碎、发酵、提取、分离、干燥，具体步骤如下：

1）液体培养基的制备：300g土豆削皮后切成丁状或片状，放入1500mL纯净水中，煮沸30min，过滤取滤液，于滤液中加入虎杖内生菌虎杖内生菌33～48株、葡萄糖15～20g、硝铵酸15～20g、蛋白胨5～10g，酒曲100～150g，搅拌混合均匀，调节pH为5；

2）粉碎：粉碎虎杖饮片，制得虎杖粉末；

3）发酵：称取80～100目筛之间的虎杖粉末500g放入发酵容器中，将步骤1所制备培养基倒入发酵容器中，搅拌充分混匀，发酵温度35～40℃，发酵5～8天；

4）提取：向步骤3所得虎杖粉末连同发酵液中加入8倍体积浓度为70%的甲醇回流提取3次；每次趁热过滤，合并3提取所得到的提取液；

5）分离：将步骤4所得的提取液进行离心处理，取上清液，将上清液上样于中压氧化铝层析柱，依次采用35%、65%、95%的乙醇进行梯度洗脱，收集浓度为95%的乙醇洗脱液，并回收乙醇；

6）干燥：干燥步骤5中收集的洗脱液，制得白藜芦醇。

本发明的有益效果：本发明通过实验研究，采用了虎杖内生菌进行发酵，有助于将虎杖中存在的虎杖苷转化成白藜芦醇。加入酒曲作是满足发酵的基本条件，利用酒曲中的营养成分，如糖分、淀粉酶等，补充虎杖内生菌生长繁殖的营养及能量来源，从而为虎杖内生菌的生长提供营养基础，一方面可时虎杖内生菌的活性增强，提高虎杖内生菌高效、快速地将虎杖苷转化为白藜芦醇的能力；另一方面可使虎杖内生菌持续繁殖，不断补充虎杖内生菌，持续作用于虎杖苷，促进虎杖中的虎杖苷转化为白藜芦醇，使白藜芦醇的获得率达95%以上。另外，控制加入的虎杖内生菌和酒曲的用量，避免发酵过度导致虎杖药材的腐败，造成白藜芦醇的获得率降低的情况。

进一步，步骤1所述虎杖内生菌为40株、葡萄糖为20g、硝铵酸为20g、蛋白胨为10g，酒曲为150g；步骤3所述发酵温度为35℃，发酵6天。本方案作为优化方案，通过多组对照实验，得出500g虎杖药材中，虎杖苷转化为白藜芦醇效果最佳，最终白藜芦醇的获得率达98.4%。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明：

实施例1：

微生物转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法，步骤包括粉碎、发酵、提取、分离、干燥，微生物转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法，具体步骤如下：

1）液体培养基的制备：300g土豆削皮后切成丁状或片状，放入1500mL纯净水中，煮沸30min，过滤取滤液，滤液冷却后，向滤液中加入虎杖内生菌40株、葡萄糖20g、硝铵酸20g、蛋白胨10g，酒曲130g，搅拌混合均匀，利用氢氧化钠或盐酸调节pH为5；

2）粉碎：粉碎虎杖饮片，制得虎杖粉末；

3）发酵：筛取能通过80目筛不能通过100目筛的虎杖粉末，并称取500g放入发酵容器中，再将步骤1所制备的液体培养基倒入发酵容器中，充分搅拌、混匀，密封，控制发酵温度为35℃，发酵6天；

4）提取：将步骤3发酵后的虎杖粉末连同发酵液转移至提取容器中，以浓度为70%的甲醇作为提取溶剂，量取8倍发酵液体积的提取溶剂加入提取容器中，进行回流提取，提取3次；每次提取1.5小时，每次提取后趁热过滤，合并3次提取所得提取液；

5）分离：将步骤4所得的提取液进行离心处理，取上清液，将上清液上样于中压氧化铝层析柱，依次采用浓度为35%、65%、95%的乙醇进行梯度洗脱，并收集浓度为95%的乙醇洗脱液；

6）干燥：干燥步骤5中收集的洗脱液，制得白藜芦醇。

实施例2：

与实施例1的区别在于：步骤1中加入虎杖内生菌33株、葡萄糖18g、硝铵酸17g、蛋白胨8g，酒曲100g，搅拌混合均匀，利用氢氧化钠或盐酸调节pH为5范围内；

步骤3中控制发酵温度为40℃，发酵5天。

实施例3：

与实施例1的区别在于：步骤1中加入虎杖内生菌48株、葡萄糖15g、硝铵酸15g、蛋白胨5g、酒曲150g，搅拌混合均匀，利用氢氧化钠或盐酸调节pH为5范围内；

步骤3中控制发酵温度为35℃，发酵8天。

实施例4：

与实施例1的区别在于：步骤1中不加入酒曲。

实施例5：

与实施例1的区别在于：步骤1中不加入虎杖内生菌和酒曲。

实施例6：

与实施例1的区别在于：步骤1中不加入虎杖内生菌。

实施例7：

与实施例1的区别在于：步骤1中加入虎杖内生菌30株和酒曲125g。

实施例8：

与实施例1的区别在于：步骤1中加入虎杖内生菌50株和酒曲155g。

按以上8组实施例的方法制备白藜芦醇，对各组得到的白藜芦醇获得率统计分析，结果见表1：

以上8组实施例中，发酵用到的虎杖粉末的用量相同，均为500g，而变量因素有：虎杖内生菌、葡萄糖、硝铵酸、蛋白胨和酒曲的用量，以及发酵时间和发酵温度。

数据分析：实施例1～3的结果显示白藜芦醇获得率达到95%以上，而这三组实施例中虎杖内生菌的用量范围是33～48株，葡萄糖15～20g，硝铵酸15～20g，蛋白胨5～10g，酒曲100～150，发酵时间为35～40天。其中实施例1的白藜芦醇获得率最高，为98.4%，所以优选实施例1的方法作为对比，改变变量因素进行了实施例4～8。

实施例4中不加入酒曲，结果白藜芦醇的获得率为76.4%，显著低于实施例1～3的获得率；实施例5中既不加入虎杖内生菌，也不加入酒曲，结果白藜芦醇的获得率为68%，实施例6中仅不加入虎杖内生菌，结果白藜芦醇的获得率为73%，实施例7和实施例8中相比于实施例1改变了虎杖内生菌和酒曲的加入量，结果白藜芦醇的获得率分别为83.7%和80.2%。可见，发酵虎杖时，向培养基中加入酒曲和虎杖内生菌对虎杖苷转化为白藜芦醇具有明显的影响作用，且加入的量同样影响到虎杖苷的转化。加入虎杖内生菌或酒曲能相应增加虎杖苷的转化，但是转化的程度不明显，最终白藜芦醇获得率不能达到80%。而同时加入虎杖内生菌和酒曲后，白藜芦醇获得率能够达到80%，但通过实施例7和实施例8反映的情况，虽然同时加入虎杖内生菌和酒曲，但是加入的量也是虎杖苷转化程度和白藜芦醇获得率的决定因素。加入量不足，不能使虎杖苷得到充分的转化；通过实施例8可知，并非加入虎杖内生菌和酒曲的量越大，虎杖苷向白藜芦醇的转化就越彻底，会存在发酵过度的情况，使虎杖本身的性质发生改变，导致虎杖药材腐败，使虎杖药材不能被完全利用，从而降低了白藜芦醇获得率。

结论：采用虎杖内生菌进行发酵，有助于将虎杖中存在的虎杖苷转化成白藜芦醇。加入酒曲作是满足发酵的基本条件，利用酒曲中的营养成分，如糖分、淀粉酶等，补充虎杖内生菌生长繁殖的营养及能量来源，从而为虎杖内生菌的生长提供营养基础，一方面可时虎杖内生菌的活性增强，提高虎杖内生菌高效、快速地将虎杖苷转化为白藜芦醇的能力；另一方面可使虎杖内生菌持续繁殖，不断补充虎杖内生菌，持续作用于虎杖苷，促进虎杖中的虎杖苷转化为白藜芦醇。在微生物转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法中，向发酵所用的培养基中使用300g土豆加水1500mL制备培养基的基质，再加入虎杖内生菌为33～48株、酒曲为100～150g，葡萄糖15～20g、硝铵酸15～20g、蛋白胨5～10g，控制发酵温度为35～40℃，发酵5～8天，可提高500g虎杖药材中虎杖苷向白藜芦醇的转化率，使白藜芦醇的获得率达到95%以上。

Claims

1.微生物转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法，步骤包括粉碎、发酵、提取、分离、干燥，其特征在于，具体步骤如下：

1）液体培养基的制备：300g土豆削皮后切成丁状或片状，放入1500mL纯净水中，煮沸30min，过滤取滤液，向滤液中加入虎杖内生菌33～48株、葡萄糖15～20g、硝铵酸15～20g、蛋白胨5～10g，酒曲100～150g，搅拌混合均匀，调节pH为5；

2）粉碎：粉碎虎杖饮片，制得虎杖粉末；

4）提取：向步骤3所得虎杖粉末连同发酵液中加入8倍体积浓度为70%的甲醇回流提取3次；每次趁热过滤，合并3次提取所得到的提取液；

5）分离：将步骤4所得的提取液进行离心处理，取上清液，将上清液上样于中压氧化铝层析柱，依次采用浓度为35%、65%、95%的乙醇进行梯度洗脱，收集浓度为95%的乙醇洗脱液；

6）干燥：干燥步骤5中收集的洗脱液，制得白藜芦醇。

2.如权利要求1所述的微生物转化虎杖苷制备白藜芦醇的方法，其特征在于：步骤1所述葡萄糖为20g、硝铵酸为20g、蛋白胨为10g，酒曲为150g；步骤3所述发酵温度为35℃，发酵6天。