CN109609581A - 一种微生物混合发酵转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法 - Google Patents

一种微生物混合发酵转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法 Download PDF

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潘弘哲
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Abstract

本发明涉及一种微生物混合发酵转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。本发明利用筛选出的两种菌种Fusarium proliferatum 0821（CGMCC NO.16482）和Fusarium verticillioides 0213（CGMCC NO.16481），以黄芪甲苷为底物，通过两种菌混合发酵，制得环黄芪醇。本发明以两种微生物混合发酵技术降解黄芪甲苷得到高纯度的环黄芪醇，工艺流程简单、成本低，整个工艺过程在常温、常压下进行，所要求的设备条件低，适用于大批量生产，最终环黄芪醇的转化率达到80%以上、纯度高达95%以上。

Description

一种微生物混合发酵转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法
技术领域
本发明属于医药化工领域，具体涉及一种微生物混合发酵转化降解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。
背景技术
黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，是中医临床治疗最常用的药物之一。黄芪中的有效成分包括黄酮类、皂苷类、多糖类及氨基酸类。黄芪甲苷是黄芪皂苷的代表性化合物，具有提高免疫力、清除自由基、降压以及抗菌等多种功效。而环黄芪醇是黄芪皂苷的苷元，分子式为C30H50O5、相对分子质量为490.71，是黄芪甲苷在肠道内代谢的主要产物，具有促进伤口愈合，促进神经细胞增殖，抗衰老等作用。而且研究发现，环黄芪醇能够起到激活端粒酶的作用，有效抑制端粒的减少，从而增强机体免疫力，抗衰老。
环黄芪醇为黄芪皂苷的苷元，主要由黄芪甲苷水解得到，易溶于甲醇、乙酸乙酯等。目前国内水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的生产工艺主要为化学法、酶法及微生物发酵法。
化学法是通过强氧化剂水解断开黄芪甲苷C3位置的木糖苷键和C6位置的葡萄糖苷键为得到环黄芪醇。中国发明专利CN104817610A使用硫酸水解黄芪甲苷制备环黄芪醇，反应器为一种高压反应釜，水解温度为130℃。硫酸水解反应条件剧烈，导致黄芪甲苷的三元环破坏严重，产生大量副产物。中国发明专利CN103880910A采用Smith氧化还原降解法制备环黄芪醇，减少了副产物的生成，但因使用了强氧化剂和强还原剂，操作步骤繁琐，增大了生产成本，不利于工业化生产。
酶法是采用多种水解酶复合的形式水解黄芪甲苷制备环黄芪醇。中国发明专利CN105734109A使用β-葡萄糖苷酶、油柑酶、纤维素酶、蜗牛酶的复合酶组合，中国发明专利CN10556643A使用β-葡萄糖苷酶、油柑酶、β-木糖苷酶的复合酶组合。使用复合酶的缺点是酶的成本较大，不易大规模生产。
微生物发酵法是中国发明专利CN106011213A使用犁头霉发酵水解黄芪甲苷制备环黄芪醇的方法。相较于本发明来说，该方法黄芪甲苷的转化率较低。。
发明内容
本发明是利用筛选出的两种菌种轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides 0213（CGMCC NO.16481 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：20180911）和层生镰刀菌Fusarium proliferatum 0821（CGMCCNO.16482中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：20180911），选用合适的培养基并在适当的培养条件下发酵水解黄芪甲苷制备环黄芪醇。本发明的目的在于采用微生物转化的方法来克服现有化学法和酶法制备环黄芪醇技术中副产物多、成本高、污染环境等缺点，并且比现有的微生物发酵制备环黄芪醇的转化率高。
为实现上述发明目的，所采用的技术方案是：
（1）种子培养
将保存的菌种轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides 0213（CGMCC NO.16481）和层生镰刀菌Fusarium proliferatum 0821（CGMCC NO.16482）分别接入100mL装有麦芽汁培养基的锥形瓶中，在25-30℃、150-200r/min的条件下培养36-48h，获得种子液。
（2）转化培养
将步骤（1）培养的种子液各按10%的接种量接入100mL装有发酵培养基的锥形瓶中，在25-30℃、150-200r/min的条件下培养6天，获得发酵液。
（3）分离纯化
将步骤（2）所得的发酵液经水饱和正丁醇等体积萃取三次后真空浓缩蒸干得到萃取产品，进一步利用硅胶柱层析分离纯化，最终通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95%以上，得到环黄芪醇产品。
上述步骤（2）中的发酵培养基的组成为：黄芪粉2g/L，蛋白胨 5g/L，酵母粉 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgS04•7H20 0.5g/L，黄芪甲苷底物 0.2g/L。
上述步骤（2）中的发酵培养基配方中的黄芪粉是80目的黄芪粉，是直接将洗净的黄芪根茎粉碎制成，黄芪甲苷底物的纯度为50%-100%。
上述步骤（3）中的硅胶柱层析填料为100-200目硅胶粉，洗脱剂为体积比例分别为13:6:2的甲醇-氯仿-水的下层溶液。
本发明是以两种微生物混合发酵技术水解黄芪甲苷得到高纯度的环黄芪醇。与现有技术相比，本发明显著的有益效果是：
与化学法制备环黄芪醇相比，微生物发酵法解决了化学法制备过程中产生副产物和污染环境的问题，且发酵反应条件温和，对设备要求较低。
与酶法制备环黄芪醇相比，微生物发酵法的成本低，易于工业化生产。
与现有的微生物发酵法制备环黄芪醇相比，本发明的环黄芪醇的转化率较高，达到80%以上，纯度达到95%以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但这些实施例的目的并不在于限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例按如下步骤制备环黄芪醇：
（1）种子培养
将保存的菌种轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides 0213（CGMCC NO.16481）和层生镰刀菌Fusarium proliferatum 0821（CGMCC NO.16482）分别接入100mL装有麦芽汁培养基的锥形瓶中，在25℃、180r/min的条件下培养48h，获得种子液。麦芽汁培养基的组成为：葡萄糖 10g/L，蛋白胨 4g/L，酵母浸粉 3g/L，麦芽粉 10g/L。
（2）转化培养
将步骤（2）培养的种子液各按10%的接种量接入100mL装有发酵培养基的锥形瓶中，在25℃、180r/min的条件下培养6天，获得发酵液。发酵培养基的组成为：黄芪粉2g/L，蛋白胨 5g/L，酵母粉 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgS04•7H20 0.5g/L，50%质量百分比的黄芪甲苷底物 0.2g/L。
（3）分离纯化
向步骤（2）所得的发酵液加入100mL水饱和正丁醇萃取，连续萃取三次后，将得到的萃取液经真空浓缩蒸干得到萃取产品。取萃取产品1g于硅胶柱层析分离纯化，填料为100-200目的硅胶粉，采用干法上样，洗脱剂为体积比例为13:6:2的甲醇-氯仿-水的下层溶液。收集其中含有产品的馏分并于液相检测浓度，后将所有的馏分收集经真空浓缩至干并称量干燥，经计算得到0.8092g纯度为86.38%的产品。
将硅胶柱层析后的产品通过乙醇重结晶后，最终得到环黄芪醇产品的纯度为95.47%，转化率为80.92%。
实施例2
本实施例按如下步骤制备环黄芪醇：
（1）种子培养
将菌种轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides 0213（CGMCC NO.16481）和层生镰刀菌Fusarium proliferatum 0821（CGMCC NO.16482）分别接入100mL装有麦芽汁培养基的锥形瓶中，在30℃、180r/min的条件下培养36h，获得种子液。麦芽汁培养基的组成为：葡萄糖 10g/L，蛋白胨 4g/L，酵母浸粉 3g/L，麦芽粉 10g/L。
（2）转化培养
将步骤（2）培养的种子液各按10%的接种量接入100mL装有发酵培养基的锥形瓶中，在30℃、180r/min的条件下培养6天，获得发酵液。发酵培养基的组成为：黄芪粉2g/L，蛋白胨 5g/L，酵母粉 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgS04•7H20 0.5g/L，50%质量百分比的黄芪甲苷底物 0.2g/L。
（3）分离纯化
向步骤（2）所得的发酵液加入100mL水饱和正丁醇萃取，连续萃取三次后，将得到的萃取液经真空浓缩蒸干得到萃取产品。取萃取产品1g于硅胶柱层析分离纯化，填料为100-200目的硅胶粉，采用干法上样，洗脱剂为体积比例为13:6:2的甲醇-氯仿-水的下层溶液。收集其中含有产品的馏分并于液相检测浓度，后将所有的馏分收集经真空浓缩至干并称量干燥，经计算得到0.7584g纯度为81.57%的产品。
将硅胶柱层析后的产品通过乙醇重结晶后，最终得到环黄芪醇产品的纯度为94.81%，转化率为75.84%。
实施例3
本实施例按如下步骤制备环黄芪醇：
（1）种子培养
将菌种轮枝镰孢菌Fusarium verticillioides 0213（CGMCC NO.16481）和层生镰刀菌Fusarium proliferatum 0821（CGMCC NO.16482）分别接入100mL装有麦芽汁培养基的锥形瓶中，在30℃、180r/min的条件下培养36h，获得种子液。麦芽汁培养基的组成为：葡萄糖 10g/L，蛋白胨 4g/L，酵母浸粉 3g/L，麦芽粉 10g/L。
（2）转化培养
将步骤（2）培养的种子液各按10%的接种量接入100mL装有发酵培养基的锥形瓶中，在30℃、180r/min的条件下培养6天，获得发酵液。发酵培养基的组成为：黄芪粉2g/L，蛋白胨 5g/L，酵母粉 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgS04•7H20 0.5g/L，100%质量百分比的黄芪甲苷底物 0.2g/L。
（3）分离纯化
向步骤（2）所得的发酵液加入100mL水饱和正丁醇萃取，连续萃取三次后，将得到的萃取液经真空浓缩蒸干得到萃取产品。取萃取产品1g于硅胶柱层析分离纯化，填料为100-200目的硅胶粉，采用干法上样，洗脱剂为体积比例为13:6:2的甲醇-氯仿-水的下层溶液。收集其中含有产品的馏分并于液相检测浓度，后将所有的馏分收集经真空浓缩至干并称量干燥，经计算得到0.7885g纯度为83.48%的产品。
将硅胶柱层析后的产品通过乙醇重结晶后，最终得到环黄芪醇产品的纯度为95.21%，转化率为78.85%。

Claims (7)

1.利用筛选出的两种菌种Fusarium proliferatum 0821（CGMCC NO.16482）和Fusarium verticillioides 0213（CGMCC NO.16481），以黄芪甲苷为底物，通过两种菌混合发酵，制得环黄芪醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步骤：
种子培养
将保存的菌种Fusarium proliferatum 0821（CGMCC NO.16482）和Fusarium verticillioides 0213（CGMCC NO.16481）分别接入100mL装有麦芽汁培养基的锥形瓶中，在25-30℃、150-200r/min的条件下培养36-48h，获得种子液。
3.转化培养
将步骤（1）培养的种子液各按10%的接种量接入100mL装有发酵培养基的锥形瓶中，在25-30℃、150-200r/min的条件下培养6天，获得发酵液。
4.（3）分离纯化
将步骤（2）所得的发酵液经水饱和正丁醇等体积萃取三次后真空浓缩蒸干得到萃取产品，进一步利用硅胶柱层析分离纯化，最终通过乙醇重结晶将产品的纯度提高到95%以上，得到环黄芪醇产品。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中的发酵培养基的组成为：黄芪粉2g/L，蛋白胨 5g/L，酵母粉 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgS04·7H20 0.5g/L，黄芪甲苷底物 0.2g/L。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：发酵培养基配方中的黄芪粉是80目的黄芪粉，是直接将洗净的黄芪根茎粉碎制成，黄芪甲苷底物的纯度为50%-100%。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中的硅胶柱层析填料为100-200目硅胶粉，洗脱剂为体积比例分别为13:6:2的甲醇-氯仿-水的下层溶液。
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