CN103305572B - 淫羊藿发酵生产宝藿苷i的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了淫羊藿发酵生产宝藿苷I的方法，它包括以下步骤：S1、酵母菌在培养基中扩繁，稀释；S2、将培养液与淫羊藿混合并搅拌均匀，置发酵罐密闭静态厌氧发酵；S3、当淫羊藿苷水解完全时，将发酵原料用提取溶剂提取；S4、浸膏用二氯甲烷洗涤，再用乙酸乙酯萃取；S5、将乙酸乙酯萃取液经氧化铝柱过滤后，经硅胶吸附柱层析，得到宝藿苷Ι纯品。本发明的有益效果是：采用微生物固态厌氧发酵水解含有淫羊藿苷的原料，操作简便，易于实施，高效快捷、低成本、高收率、无污染，适于工业化大规模生产。

Description

淫羊藿发酵生产宝藿苷I的方法

技术领域

本发明涉及中药成分提取工艺，特别是淫羊藿发酵生产宝藿苷I的方法。

背景技术

淫羊藿为为小檗科植物心叶淫羊藿，淫羊藿（Epimedium brevicornum Maxim.）、箭叶淫羊藿（Epimedium sagittatum（Sieb.et Zucc.）Maxim.）、柔毛淫羊藿（Epimedium pubescensMaxim.）、巫山淫羊藿（Epimedium wushanense T.S.Ying）、或朝鲜淫羊藿（Epimedium koreanumNakai）的干燥地上部分。夏、秋季茎叶茂盛时采割，除去粗梗及杂质，晒干或阴干。

淫羊藿，是一种传统的补益中药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等多种功效，用于治疗阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛；更年期高血压。

宝藿苷I（Baohuoside I），又名淫羊藿次苷II（Icarisid II），在五加皮、柔毛淫羊藿中有少量存在。宝藿苷I具有比淫羊藿苷更强、更广泛的药理活性，具有突出的抗骨质疏松、提高肌体免疫力、抗氧化、防治心脑血管疾病的功效；对老年痴呆等退行性疾病，也有良好的预防和治疗作用。宝藿苷I对癌细胞有明显的生长抑制及诱导细胞凋亡的作用，作用机制被认为是与下调凋亡抑制基因SURFvivin的表达有关。业内认为针对靶向survivin的阻断性抗肿瘤疗法，必将为肿瘤的治疗开辟新途径。

此外宝藿苷I还同样具有和淫羊藿苷部分相同的药理作用。是开发多种新药及功能食品的原料，应用前景广阔。因其在淫羊藿药材中的含量较低，难以分离纯化得到。宝藿苷Ι的生产技术也就成为研究的热门课题。

药代研究发现，服用淫羊藿苷后，在血液中大量检出宝藿苷Ι，表明淫羊藿中的淫羊藿苷在体内经降解脱去了葡萄糖基，得到宝藿苷Ι。转化率为1/3。

此前已有采用纤维素酶和β-葡糖苷酶酶解含淫羊藿苷单体微量（毫克级）制备宝藿苷Ι的报道，以及经改进用纤维素酶酶解淫羊藿原料制备宝藿苷Ι的小试（克级）的工艺报道。

中国专利201110186207.9公开了一种从淫羊藿制备宝藿苷I的方法，为用1千克淫羊藿用稀醇加纤维素酶和吐温80在提取中酶解淫羊藿苷为宝藿苷I的小试工艺。但该法尚存在以下技术缺陷：

1.因用低度醇提取，提取液含有大量水，浓缩能耗高，浓缩温度也高，时间长。由于宝藿苷I的C-8位有敏感的异戊烯基，其它部位还有较敏感的羰基、酮基，长时间高温对产品破坏很大。同时，低度醇含水多，带出杂质多，又增加了分离难度。低度醇浓缩后留下水液，对目标产物宝藿苷I不溶解，影响提出效果。加乳化剂吐温80仅有助于已提出的淫羊藿苷水解成宝藿苷I部分融入水中，而植物组织中的宝藿苷I则难以提出，导致提出不完全。

2.纤维素酶价格高，每吨原料使用5千克，用量大。使该工艺产品无成本优势。4.由于该工艺的以上缺陷（提不净、带出杂质多、产品破坏大），提取物含量低，导致产品提纯困难。生产98%以上产品需用制备柱纯化。由于中、高压制备柱产量小，成本高。一般不属工业生产范畴。

3.该工艺仅为1千克淫羊藿原料的小试生产。非工业性制备。能否工业放大尚未可知。

此前也有用纤维素酶、或β-葡萄糖苷酶水解已提纯的淫羊藿苷为宝藿苷I的微量实验工艺。用100毫克淫羊藿苷加等量的酶在缓冲溶液中水解。该法因是0.1克的微量实验，且用酶等量，又须在100毫升的缓冲液中控温进行。既繁琐难控，成本也太高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种高效快捷、低成本高收率无污染、可工业化生产的淫羊藿发酵生产宝藿苷I的方法。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：淫羊藿发酵生产宝藿苷I的方法，它包括以下步骤：

S1、酵母菌在培养基中扩繁8～12小时，扩繁培养条件为pH6～7、温度15～35℃，静态发酵，然后按扩繁液体积加2～2.5倍量的水稀释得到培养液；所述的培养基用淀粉加水配成，淀粉的用量为酵母菌重量的400～800倍，淀粉中加入的水与淀粉重量比为4～6:1；

S2、将步骤S1得到的培养液与粉碎至10～20目的淫羊藿混合，搅拌均匀，淫羊藿与培养液的重量比为1:0.2～1.5，然后置于发酵罐密闭静态厌氧发酵；罐内温度保持35～45℃，发酵时间48～72小时；

S3、检测，当淫羊藿苷水解完全时，将发酵原料转入提取器用提取溶剂提取，提取液浓缩，得含宝藿苷Ι的浸膏；所述的提取溶剂为酯、醇、酮或醚；

S4、浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮，再用乙酸乙酯萃取得到较纯的宝藿苷Ι部分；

S5、将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱过滤除去残存的鞣质等杂质，滤液在≤50℃温度下减压浓缩成干浸膏；按200～300目工业层析硅胶：干浸膏重量比为40：1的比例上柱，用含乙醇依次为4%、6%、8%的二氯甲烷洗脱，流出液薄层监测，将含宝藿苷Ι单一成分的流份合并，50℃以下浓缩成膏，抽松，乙醇溶解，过滤，滤液加蒸馏水，析出晶体，滤取晶体，45℃以下真空干燥至恒重，得到含量99%以上的宝藿苷Ι纯品。

所述的酵母菌为高活性干酵母。

所述的淀粉为全薯粉或全麦粉。

步骤S2中所述的淫羊藿为淫羊藿干原料，淫羊藿干原料与培养液的重量比为1:1.2～1.5。

步骤S2中所述的淫羊藿为淫羊藿鲜品，淫羊藿鲜品与培养液的重量比为1:0.2。

所述的浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮的具体操作为：浸膏先用石油醚洗涤除去油脂、蜡质、叶绿素，再用二氯甲烷萃取得到较干净的淫羊藿黄酮。

本发明具有以下优点：

本发明采用微生物固态厌氧发酵水解含有淫羊藿苷的原料，形成工业规模制备宝藿苷Ι的生产工艺；进一步地，本发明采用微生物固态厌氧发酵水解原料中的淫羊藿苷为宝藿苷Ι，再经洗涤、萃取、层析获得高纯度宝藿苷Ι，形成了高效快捷、低成本高收率无污染的工业生产工艺技术；该工艺操作简便，易于实施。

本发明采用菌扩繁水解工艺，菌用量少，扩繁成本低；菌及扩繁的培养基成本不足400元人民币/吨原料；相比采用酶水解制备工艺，解决了业内的酶水解工艺的酶用量大、酶价高造成的高生产成本问题。并且本发明采用固态发酵，无发酵液排放，解决了业内用酶在缓冲液中水解或低醇水液中水解，造成的水解缓冲液或去醇水液排放造成的污染。

本发明采用固态发酵，可用较水沸点低的溶剂提取，容易浓缩，能耗低，并可减少浓缩中的产品损失。而现有技术中采用低醇水酶解，酶解液浓缩困难，造成产品损失大，提出物的杂质多，造成后续精制难。本发明水解后目标产品相近成分少，分离精制容易，仅洗涤萃取、过滤和硅胶吸附层析即可获得纯度99%以上的产品，而现有技术中采用低醇水解造成杂质多，需树脂交换（继续造成大量废水污染）、制备柱分离才能获得纯品。

本发明采用密闭厌氧发酵，发酵产生的二氧化碳迅速充斥于容器中，成为保护剂，避免了降解所得敏感成分的氧化破坏，使目标产物得到稳定蓄存。

本发明的菌扩繁、提取、分离精制，无特殊设备条件要求，适用于大规模工业生产，已在15立方发酵罐中投料2.4吨的发酵水解和分离精制，运行稳定。淫羊藿苷水解残留量为原料的3.6～14.5ppm（醇提出物的20～80ppm），水解收率达99.24%，获得含量99.44%的产品，收率83%。避免了酶水解仅实现1千克原料的小试，不能形成工业生产的问题，解决了低成本高收率无污染工业规模生产宝藿苷Ι的业内难题。

本发明产品收率高。本发明使用经定向扩繁的微生物发酵产生β-葡糖苷酶，高选择性地只除去淫羊藿苷等苷类的O-葡糖基，鼠李糖基不被水解。由于该水解的高度专一性，使得宝藿苷I收率很高；同时，厌氧发酵对敏感产物实现有效保护，使水解收率超过99%，产品最终收率达到83%。

本发明产品品质优。生产的产品经中科院成都分院分析测试中心检验，含量达到99.44%，无有害溶剂残留。

本发明工艺简便，易于工业生产。本发明的菌来源方便，容易扩繁；发酵设备普通，低沸点溶剂提取，使浓缩容易，仅洗涤萃取、过滤、吸附层析即得高纯产品，适于工业化生产。

本发明生产成本低。由于水解成本低，水解后宝藿苷Ι的相近成分少，分离容易。生产成本低。

本发明生产过程环境友好。本发明固态发酵无发酵废液产生，低沸点溶剂提取，可完全回收，无大量水液残留，整个工艺过程无废液排放。

附图说明

图1为本发明制得的宝藿苷I纯品HPLC分析图谱；

图2为发酵原料醇提为膏送检宝藿苷I及相近成分HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：

淫羊藿发酵生产宝藿苷I的方法，它包括以下步骤：

S1、酵母菌在培养基中扩繁8～12小时，扩繁培养条件为pH6～7、温度15～35℃，静态发酵，然后按扩繁液体积加2～2.5倍量的水稀释得到培养液；所述的培养基用淀粉加水配成，淀粉的用量为酵母菌重量的400～800倍，淀粉中加入的水与淀粉重量比为4～6:1，

所述的淀粉为全薯粉或全麦粉；优选地，在培养温度为25～30℃条件下，培养8～10小时；当培养温度≤15℃时，时间延长至12～24小时；

酵母菌为中华人民共和国行业标准<面包酵母>QR/T1501-92规定的“高活性干酵母”，优级或一级品；发酵力≥750ml（CO₂)。

S2、将步骤S1得到的培养液与粉碎至10～20目的淫羊藿混合，搅拌均匀，淫羊藿与培养液的重量比为1:0.2～1.5，优选地，当淫羊藿为淫羊藿干原料时，淫羊藿干原料与培养液的重量比为1:1.2～1.5，当淫羊藿为淫羊藿鲜品时，淫羊藿鲜品与培养液的重量比为1:0.2；然后置于发酵罐密闭静态厌氧发酵；罐内温度保持35～45℃，发酵时间48～72小时；

S3、检测，当淫羊藿苷水解完全时，将发酵原料转入提取器用提取溶剂提取，提取液浓缩，得含宝藿苷Ι的浸膏；所述的提取溶剂为酯、醇、酮或醚；所述的淫羊藿苷水解完全即为淫羊藿苷残留量在规定值以下，如：所述的规定值可为发酵物料量的25ppm；

淫羊藿苷残留量按《中华人民共和国药典》2010年版规定方法检测。

所述的提取溶剂为乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯或比乙酸乙酯含碳略高的酯。

所述的提取溶剂也可为乙醇、甲醇、异丙醇或丙醇。

所述的提取溶剂也可为丙酮。

所述的提取溶剂也可为乙醚。

用于提取的酯，最常用的是乙酸乙酯，沸点更低的是甲酸乙酯、乙酸甲酯。但后二者水溶量更大，带出杂质比前者多。含碳更高的酯，如丙酸丁酯，沸点太高，提取液不便浓缩。用于提取的醇，沸点较低的是乙醇（即酒精）。甲醇沸点更低（64.6℃）、但有毒；异丙醇、丙醇的沸点高一些，价也高。上述醇的极性高，与水充分混合，带出杂质多。用于提取的酮，主要是丙酮，沸点低（56.5℃），极性介于醇、酯之间。提取带出的杂质也介于二者之间。由于为易制毒试剂。受管制。用于提取的醚，主要是乙醚。沸点仅34.5℃，水溶性比乙酸乙酯更小，提出物比乙酸乙酯带出的杂质更少。但也是易制毒试剂，受管制使用。且沸点过低、可过氧化爆炸，不便保管。

将发酵原料转入提取罐，加乙酸乙酯至没过原料面10厘米以上，冷浸4小时或50℃以下温浸2小时，放出溶剂，送去蒸馏；提取罐内再补充溶剂至原液位，冷浸4小时或50℃以下温浸1.5～2小时，放出溶剂，该溶剂不再浓缩，而是送入另一只提取罐作第一次提取原料的提取试剂使用，以节省能源，并减少试剂和敏感成分损失；同样，第三、四次提取液分别做另一只罐第二、三次提取试剂。第四次提后残渣中有效成分如已按要求提净，就可加热蒸馏回收残留溶剂至净。放出残渣，再加新提取原料，如上重复操作，继续提取。残渣因发酵菌蛋白含量高，为优质饲料；提取液浓缩得到浸膏。

S4、浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮，再用乙酸乙酯萃取得到较纯的宝藿苷Ι部分；

如要单独收取黄酮，先用石油醚洗涤除去油脂、蜡质、叶绿素，再用二氯甲烷萃取就得到较干净的淫羊藿黄酮。如不单独收黄酮，直接用二氯甲烷洗涤，油脂、蜡质、叶绿素、淫羊藿黄酮就一起被洗出。宝藿苷Ι不被洗出。用乙酸乙酯萃取，即仅萃取出宝藿苷Ι及相近成分。萃出物宝藿苷Ι含量大幅度提高。乙酸乙酯萃取后的残余物，是更高极性的多糖苷和糖类成分以及上述溶剂不容的杂质等。用于制取淫羊藿多糖、多糖苷等。

洗涤方法是将浸膏投入加有2～3倍量的60～90℃沸程的石油醚的萃取罐中，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在石油醚中即止。静置让分层，放出上层石油醚层；再加放出量的石油醚，同上操作，至石油醚色浅为止。在放净石油醚后的罐中加入2～3倍体积比的二氯甲烷，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在二氯甲烷中为止。静置使分层，放出下层二氯甲烷；再加放出量的二氯甲烷，同上操作，至二氯甲烷无色为止。

二氯甲烷萃取出黄酮完成后，在放干净二氯甲烷的罐中（内留有浸膏）再加入2～3倍体积比的乙酸乙酯，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在乙酸乙酯中即止；静置使分层，放出上层的乙酸乙酯；再加放出量的乙酸乙酯，同上操作。如无乳化，可延长每次搅拌时间3～5分钟。萃取至乙酸乙酯无色，且检测宝藿苷Ι低于规定值为止。

S5、将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱过滤除去残存的鞣质等杂质，滤液在≤50℃温度下减压浓缩成干浸膏；按200～300目工业层析硅胶：干浸膏重量比为40：1的比例上柱，用含乙醇依次为4%、6%、8%的二氯甲烷洗脱，流出液薄层监测，将含宝藿苷Ι单一成分的流份合并，50℃以下浓缩成膏，抽松，乙醇溶解，过滤，滤液加蒸馏水，析出晶体，滤取晶体，45℃以下真空干燥至恒重，得到含量99%以上的宝藿苷Ι纯品。

由于乙酸乙酯中要溶入一小部分水，这一小部分水仍会带出一小部分鞣质及氨基酸等高极性杂质，氧化铝对高极性物质吸附好，尤其是对鞣质属不可逆吸附，滤除效果极好，可干净彻底滤除。硅胶柱层析是要分开宝藿苷Ι和它的相近成分，获得高纯品。

实施例1：

淫羊藿发酵生产宝藿苷I的方法，它包括以下步骤：

S1、取40g高活性干酵母在培养基中扩繁10小时，扩繁培养条件为pH6～7、温度25℃，静态发酵，然后按扩繁液体积加2倍量的水稀释得到培养液；所述的培养基用淀粉加水配成，淀粉的用量为酵母菌重量的500倍（20kg），淀粉中加入的水与淀粉重量比为6:1，所述的淀粉为小麦粉；高活性干酵母为中华人民共和国行业标准<面包酵母>QR/T1501-92规定的“高活性干酵母”，优级或一级品；发酵力≥750ml（CO₂)。

S2、将步骤S1得到的培养液与240kg粉碎至10～20目的淫羊藿干原料混合，检测淫羊藿苷含量为0.55%，搅拌均匀，淫羊藿干原料与培养液的重量比为1:1.5，然后置于1.5立方米的发酵罐密闭静态厌氧发酵；罐内温度保持35℃，发酵时间72小时；

S3、检测，淫羊藿苷残留量11PPm。将发酵原料转入提取器用提取溶剂提取，提取液浓缩，得含宝藿苷Ι的浸膏；淫羊藿苷残留量按《中华人民共和国药典》2010年版规定方法检测。

所述的提取溶剂为乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯或比乙酸乙酯含碳量更高的酯；也可为乙醇、甲醇、异丙醇或丙醇，也可为丙酮，也可为乙醚。本实施例中采用的提取溶剂为乙酸乙酯。提取，浓缩的具体过程为：将发酵原料转入提取罐，加乙酸乙酯至没过原料面10～30厘米，冷浸4小时或50℃以下温浸2小时，放出溶剂，送去蒸馏；提取罐内再补充溶剂至原液位，冷浸4小时或50℃以下温浸1.5～2小时，放出溶剂，该溶剂不再浓缩，而是送入另一只提取罐作第一次提取原料的试剂使用，以节省能源，并减少试剂和敏感成分损失；同样，第三、四次提取液分别做另一只罐第二、三次提取试剂。第四次提后残渣中有效成分如已按要求提净，就可加热蒸馏回收残留溶剂至净。放出残渣，再加新提取原料，如上重复操作，继续提取。残渣因发酵菌蛋白含量高，为优质饲料；提取液浓缩至无乙酸乙酯，得到浸膏。

S4、浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮，再用乙酸乙酯萃取得到较纯的宝藿苷Ι部分；并且，浸膏先用石油醚洗涤除去油脂、蜡质、叶绿素，再用二氯甲烷萃取得到较干净的淫羊藿黄酮。

洗涤方法是将浸膏投入加有2～3倍量的60～90℃沸程的石油醚的萃取罐中，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在石油醚中即止。静置让分层，放出上层石油醚层；再加放出量的石油醚，同上操作，至石油醚色浅为止。在放净石油醚后的罐中加入2～3倍体积比的二氯甲烷，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在二氯甲烷中为止。静置使分层，放出下层二氯甲烷；再加放出量的二氯甲烷，同上操作，至二氯甲烷无色为止。

二氯甲烷萃取出黄酮完成后，在放干净二氯甲烷的罐中（内留有浸膏）再加入2～3倍体积的乙酸乙酯，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在乙酸乙酯中即止；静置使分层，放出上层的乙酸乙酯；再加放出量的乙酸乙酯，同上操作。如无乳化，可延长每次搅拌时间3～5分钟。萃取至乙酸乙酯无色，且检测宝藿苷Ι低于规定值为止。

S5、将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱过滤除去残存的鞣质等杂质，滤液50℃减压浓缩成干浸膏；按200～300目工业层析硅胶：干浸膏重量比为40：1的比例上柱，用含乙醇依次为4%、6%、8%的二氯甲烷洗脱，流出液薄层监测，将含宝藿苷Ι单一成分的流份合并，50℃以下浓缩成膏，抽松，乙醇溶解，过滤，滤液加蒸馏水，析出晶体，滤取晶体，45℃以下真空干燥至恒重，得到宝藿苷Ι纯品0.8706千克，产品含量99.44%，收率83.20%。

如图1所示，为该产品的HPLC分析图谱，其检测结果如下表所示：

峰#	保留时间	面积	面积%
				1	2.144	4366	0.03
2	3.555	882	0.01
				3	3.891	1720	0.01
4	4.624	7928	0.05
				5	5.594	1324	0.01

6	6.258	1185	0.01
				7	6.941	426	0.00
8	7.671	1556	0.01
				9	8.205	2111	0.01
10	9.639	6908	0.04
				11	10.103	35762	0.21
12	10.486	1122	0.01
				13	11.390	871	0.01
14	12.214	17100106	99.44
				15	12.739	1814	0.01
16	14.075	1459	0.01
				17	14.425	2191	0.01
18	14.571	1694	0.01
				19	15.467	2815	0.02
20	15.872	1026	0.01
				21	16.358	2214	0.01
22	17.014	7439	0.04
				23	17.426	3851	0.02
24	17.857	2998	0.02
				25	18.213	1165	0.01
26	19.342	1864	0.01

实施例2：

淫羊藿发酵生产宝藿苷I的方法，它包括以下步骤：

S1、取300g高活性干酵母在培养基中扩繁8小时，扩繁培养条件为pH6～7、温度35℃，静态发酵，然后按扩繁液体积加2.5倍量的水稀释得到培养液；所述的培养基用淀粉加水配成，淀粉的用量为酵母菌重量的666.7倍（200kg），淀粉中加入的水与淀粉重量比为5:1，所述的淀粉为小麦粉；高活性干酵母为中华人民共和国行业标准<面包酵母>QR/T1501-92规定的“高活性干酵母”，优级或一级品；发酵力≥750ml（CO₂)。

S2、将步骤S1得到的培养液与2.4吨粉碎至10～20目的淫羊藿干原料混合，搅拌均匀，淫羊藿干原料与培养液的重量比为1:1.2，然后置于15立方米的发酵罐密闭静态厌氧发酵；罐内温度保持40℃，发酵时间65小时；

S3、检测，当淫羊藿苷残留量降至6PPm时，将发酵原料转入提取器用提取溶剂提取，提取液浓缩，得含宝藿苷Ι的浸膏；淫羊藿苷残留量按《中华人民共和国药典》2010年版规定方法检测。

所述的提取溶剂为乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯或比乙酸乙酯含碳量更高的酯，也可为乙醇、甲醇、异丙醇或丙醇，也可为丙酮，也可为乙醚。本实施例中采用的提取溶剂为乙酸乙酯。提取，浓缩的具体过程为：将发酵原料转入提取罐，加乙酸乙酯至没过原料面30厘米，冷浸4小时或50℃以下温浸2小时，放出溶剂，送去蒸馏；提取罐内再补充溶剂至原液位，冷浸4小时或50℃以下温浸1.5～2小时，放出溶剂，该溶剂不再浓缩，而是送入另一只提取罐作第一次提取原料的试剂使用，以节省能源，并减少试剂和敏感成分损失；同样，第三、四次提取液分别做另一只罐第二、三次提取试剂。第四次提后残渣中有效成分如已按要求提净，就可加热蒸馏回收残留溶剂至净。放出残渣，再加新提取原料，如上重复操作，继续提取。残渣因发酵菌蛋白含量高，为优质饲料；提取液浓缩至无乙酸乙酯，得到浸膏。

S4、浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮，再用乙酸乙酯萃取得到较纯的宝藿苷Ι部分；并且，浸膏先用石油醚洗涤除去油脂、蜡质、叶绿素，再用二氯甲烷萃取得到较干净的淫羊藿黄酮。

洗涤方法是将浸膏投入加有2～3倍量的60～90℃沸程的石油醚的萃取罐中，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在石油醚中即止。静置让分层，放出上层石油醚层；再加放出量的石油醚，同上操作，至石油醚色浅为止。在放净石油醚后的罐中加入2～3倍体积比的二氯甲烷，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在二氯甲烷中为止。静置使分层，放出下层二氯甲烷；再加放出量的二氯甲烷，同上操作，至二氯甲烷无色为止。

二氯甲烷萃取出黄酮完成后，在放干净二氯甲烷的罐中（内留有浸膏）再加入2～3倍体积的乙酸乙酯，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在乙酸乙酯中即止；静置使分层，放出上层的乙酸乙酯；再加放出量的乙酸乙酯，同上操作。如无乳化，可延长每次搅拌时间3～5分钟。萃取至乙酸乙酯无色，且检测宝藿苷Ι低于规定值为止。

S5、将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱过滤除去残存的鞣质等杂质，滤液50℃减压浓缩成干浸膏；按200～300目工业层析硅胶：干浸膏重量比为40：1的比例上柱，用含乙醇依次为4%、6%、8%的二氯甲烷洗脱，流出液薄层监测，将含宝藿苷Ι单一成分的流份合并，50℃以下浓缩成膏，抽松，乙醇溶解，过滤，滤液加蒸馏水，析出晶体，滤取晶体，45℃以下真空干燥至恒重，得到宝藿苷Ι纯品8.612千克，产品含量99.18%，收率82.26%。

同法连续生产第二批原料2.4吨，淫羊藿苷残留量为8PPm，得产品8.629千克，第三批原料2.4吨，淫羊藿苷残留量为3.6PPm，得产品8.6880千克，含量99.23%，收率83.22%。

经批量生产证明，本生产工艺适宜工业性生产。具有设备普通，生产操作控制性强，以及产品收率较高、质量优、生产成本低等优点。

实施例3：

淫羊藿发酵生产宝藿苷I的方法，它包括以下步骤：

S1、取40g高活性干酵母在培养基中扩繁12小时，扩繁培养条件为pH6～7、温度15℃，静态发酵，然后按扩繁液体积加2倍量的水稀释得到培养液；所述的培养基用淀粉加水配成，淀粉的用量为酵母菌重量的800倍，淀粉中加入的水与淀粉重量比为4:1，所述的淀粉为小麦粉；高活性干酵母为中华人民共和国行业标准<面包酵母>QR/T1501-92规定的“高活性干酵母”，优级或一级品；发酵力≥750ml（CO₂)。

S2、将步骤S1得到的培养液与1000kg粉碎至10～20目的淫羊藿鲜品混合，搅拌均匀，淫羊藿鲜品与培养液的重量比为1:0.2，然后置于2.5立方米的发酵罐密闭静态厌氧发酵；罐内温度保持45℃，发酵时间48小时；

S3、检测，当淫羊藿苷残留量降至发酵物料液重量的十万分之一以下时，将发酵原料转入提取器用提取溶剂提取，提取液浓缩，得含宝藿苷Ι的浸膏；淫羊藿苷残留量按《中华人民共和国药典》2010年版规定方法检测。

所述的提取溶剂为乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸甲酯或比乙酸乙酯含碳量更高的酯，也可为乙醇、甲醇、异丙醇或丙醇，也可为丙酮，也可为乙醚。本实施例中采用的提取溶剂为乙酸乙酯。提取，浓缩的具体过程为：将发酵原料转入提取罐，加乙酸乙酯至没过原料面10～30厘米，冷浸4小时或50℃以下温浸2小时，放出溶剂，送去蒸馏；提取罐内再补充溶剂至原液位，冷浸4小时或50℃以下温浸1.5～2小时，放出溶剂，该溶剂不再浓缩，而是送入另一只提取罐作第一次提取原料的试剂使用，以节省能源，并减少试剂和敏感成分损失；同样，第三、四次提取液分别做另一只罐第二、三次提取试剂。第四次提后残渣中有效成分如已按要求提净，就可加热蒸馏回收残留溶剂至净。放出残渣，再加新提取原料，如上重复操作，继续提取。残渣因发酵菌蛋白含量高，为优质饲料；提取液浓缩至无乙酸乙酯，得到浸膏。

S4、浸膏用二氯甲烷洗涤除去叶绿素等低极性成分和黄酮，再用乙酸乙酯萃取得到较纯的宝藿苷Ι部分；并且，浸膏先用石油醚洗涤除去油脂、蜡质、叶绿素，再用二氯甲烷萃取得到较干净的淫羊藿黄酮。

洗涤方法是将浸膏投入加有2～3倍量的60～90℃沸程的石油醚的萃取罐中，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在石油醚中即止。静置让分层，放出上层石油醚层；再加放出量的石油醚，同上操作，至石油醚色浅为止。在放净石油醚后的罐中加入2～3倍体积比的二氯甲烷，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在二氯甲烷中为止。静置使分层，放出下层二氯甲烷；再加放出量的二氯甲烷，同上操作，至二氯甲烷无色为止。

二氯甲烷萃取出黄酮完成后，在放干净二氯甲烷的罐中（内留有浸膏）再加入2～3倍体积的乙酸乙酯，开动搅拌器搅拌，搅拌器转速控制在60～120转/分，至浸膏完全分散在乙酸乙酯中即止；静置使分层，放出上层的乙酸乙酯；再加放出量的乙酸乙酯，同上操作。如无乳化，可延长每次搅拌时间3～5分钟。萃取至乙酸乙酯无色，且检测宝藿苷Ι低于规定值为止。

S5、将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱过滤除去残存的鞣质等杂质，滤液50℃减压浓缩成干浸膏；按200～300目工业层析硅胶：干浸膏重量比为40：1的比例上柱，用含乙醇依次为4%、6%、8%的二氯甲烷洗脱，流出液薄层监测，将含宝藿苷Ι单一成分的流份合并，50℃以下浓缩成膏，抽松，乙醇溶解，过滤，滤液加蒸馏水，析出晶体，滤取晶体，45℃以下真空干燥至恒重，得到宝藿苷Ι纯品1.520千克，含量99.34%。

实施例4：发酵收率验证

取50克淫羊藿原料，淫羊藿苷含量为0.55%，游离宝藿苷I为0.019%，淫羊藿苷总量为0.275克。按水解理论收率76.0378%计算，应收宝藿苷I为0.2091克。加游离宝藿苷I0.0095克，共0.2186克。

按前述操作，得到与发酵液混合均匀的原料，置塑料袋密封。密封前尽量排出袋内空气。然后置于培养箱或水浴中，保温40℃，发酵48小时。取出，置三角瓶中，甲醇常温提取5次，首次加甲醇250ml提取，浸提2小时，其后4次每次加200ml，浸提1.5小时。提取液浓缩至小体积，减压蒸馏为无明显水分的浸膏。称重，膏重为9.08克。

如图2所示，发酵原料醇提为膏送检宝藿苷I及相近成分HPLC图谱，其检测结果如下表所示：

名称	保留时间	面积	含量	单位
					淫羊藿苷	9.609	90824	0.151	%
宝霍苷	21.173	2123396	2.372	%

检测浸膏宝藿苷I含量为2.372%，计0.2154克，淫羊藿苷残留0.151%。将残留的淫羊藿苷也折算为宝藿苷I，共0.2298克。收率为105.12%。

经加淫羊藿苷单体共发酵计算，淫羊藿苷水解收率99.31%，系另有淫羊藿苷的葡糖基位置异构体宝藿苷VII等也转化成了宝藿苷I。

Claims (1)

1.淫羊藿发酵生产宝藿苷I的方法，其特征在于：它包括以下步骤：

S1、酵母菌在培养基中扩繁8～12小时，扩繁培养条件为pH6～7、温度15～35℃，静态发酵，然后按扩繁液体积加2～2.5倍量的水稀释得到培养液；所述的培养基用淀粉加水配成，淀粉的用量为酵母菌重量的400～800倍，淀粉中加入的水与淀粉重量比为4～6:1；所述的酵母菌为高活性干酵母；所述的淀粉为全薯粉或全麦粉；

S2、将步骤S1得到的培养液与粉碎至10～20目的淫羊藿混合，搅拌均匀，淫羊藿与培养液的重量比为1:0.2～1.5，然后置于发酵罐密闭静态厌氧发酵；罐内温度保持 35～45℃，发酵时间48～72小时；所述的淫羊藿为淫羊藿干原料时，淫羊藿干原料与培养液的重量比为1:1.2～1.5；淫羊藿为淫羊藿鲜品时，淫羊藿鲜品与培养液的重量比为1:0.2；

S3、检测，当淫羊藿苷水解完全时，将发酵原料转入提取器用提取溶剂提取，提取液浓缩，得含宝藿苷Ι的浸膏；所述的提取溶剂为酯、醇、酮或醚； 

S4、浸膏先用石油醚洗涤除去油脂、蜡质、叶绿素，再用二氯甲烷萃取得到较干净的淫羊藿黄酮，再用乙酸乙酯萃取得到较纯的宝藿苷Ι部分；

S5、将乙酸乙酯萃取液经氧化铝短柱过滤除去残存的鞣质等杂质，滤液在≤50℃温度下减压浓缩成干浸膏；按200～300目工业层析硅胶：干浸膏重量比为40：1的比例上柱，用含乙醇依次为4%、6%、8%的二氯甲烷洗脱，流出液薄层监测，将含宝藿苷Ι单一成分的流份合并，50℃以下浓缩成膏，抽松，乙醇溶解，过滤，滤液加蒸馏水，析出晶体，滤取晶体，45℃以下真空干燥至恒重，得到含量99%以上的宝藿苷Ι纯品。