CN114350722B - 一种制备染料木素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备染料木素的方法，通过含有豆粕的液态培养基培养砖红链霉菌，能够提高染料木素的含量。通过使用液态发酵培养基，在29℃下加入培养砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵3天，对发酵产物进行萃取浓缩及分离纯化，即可得到染料木素。本发明方法中首次发现砖红链霉菌CGMCC No.21851能够将染料木苷转化为染料木素，与同类砖红链霉菌相比具有新的性能，所用的原料豆粕资源丰富，廉价易得。本发明提高了大豆副产物的利用率，为染料木素的生产制备提供了新的方法和途径。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体的涉及一种制备染料木素的方法，用于从发酵产物中获得染料木素。
背景技术
染料木素（genistein）又称金雀异黄素、染料木黄酮、5,7,4′-三羟基异黄酮，是大豆和豆制品的主要活性成分，也是异黄酮类物质中活性功能最高的一种。染料木素具有雌激素样作用，对人类重大疾病具有潜在的有益作用，包括抗炎、抗氧化、抗骨质疏松、抗炎、阵痛、降尿酸、调血脂等作用，在临床疾病治疗中具有广阔的前景，因而染料木素的提取、纯化也越来越引起人们的关注。
现有技术中，CN113930466A公开了一种类芽孢杆菌源金雀异黄素，提供了其制备方法，但染料木素的得率并不高。CN112358461A公开了一种染料木素及其糖苷的提取方法，以大叶千斤拔根作为提取原料，以极性溶剂作为提取溶剂，使用超声波-负压空化协同操作对所述提取原料进行提取，但需要使用昂贵设备，技术要求高，生产成本较高。此外，从大豆中得到染料木素是目前工业化的方法，然而大豆中的染料木素主要以染料木苷的形式存在，占总量的97-98%。研究发现，糖苷形式的大豆异黄酮不能直接被小肠壁吸收，必须经去除糖基转化为游离性的苷元才可被小肠吸收，因而大豆异黄酮的药理活性主要来源于苷元。由于大豆中染料木素的含量极少，提取技术要求高，生产成本高，这使得大豆染料木苷的转化极具研究价值，如何高效地将染料木苷转换成生物活性更高的游离性苷元形式，提高染料木素的得率成为该领域的研究热点。
豆粕是大豆加工得到的副产品，中国豆粕产量体量巨大，产量呈波动上涨趋势，2020年度中国豆粕的产量接近7762万吨。目前，我国豆粕绝大部分用作牲畜饲料，附加值低，资源浪费严重，因此，研究豆粕的高附加值综合利用具有重要的经济价值和社会意义。为了开发一种经济有效的染料木素生产方法，提高豆粕的高附加值的开发利用，通过自身筛选获得的一株砖红链霉菌，将豆粕中高含量的染料木苷高效的转化为染料木素，提高豆粕中染料木素的含量。本发明首次发现砖红链霉菌（CGMCC No.21851）能够转化染料木苷得到染料木素产品，显著提高豆粕中染料木素的得率，具有成本低、效率高、便于实施等优点。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种本实验室自身分离的一株砖红链霉菌（A001）。该菌株保藏编号为：为CGMCC No.21851， 该菌株于2021年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.21851，分类命名为砖红链霉菌（Streptomyces lateritius）。菌株信息参见CN113215066A，并将其全部信息引入本申请。
在分离砖红链霉菌A001，并发现其抗衰老相关功能后，本实验室进一步探索该菌株的其他用途，其中包括利用该菌株发酵提高染料木素的功能。
本发明涉及的染料木素，其结构式如I所示：
式I
其分子式为：C15H10O5，分子量为270。
本发明的一个方面，是提供一种利用豆粕为原料，生产染料木素的方法。
本发明的一个方面，提供一种利用豆粕为原料，将豆粕中染料木苷转化为染料木素的发酵生产方法。
具体的，染料木素的制备方法，其包括如下步骤：
（1）菌株培养；
（2）液态发酵；
（3）染料木素的提取、分离和纯化。
进一步的，（1）菌株培养步骤具体为：
从-80℃冰箱中取出冷冻保藏的砖红链霉菌CGMCC No.21851孢子悬液，融化后接种于种子培养基中进行培养。
液体种子培养基的制备：葡萄糖（Glucose）3-6g /L，酵母浸粉（Yeast extract）3-6 g/L，麦芽浸粉（Malt extract）4-7g/L，维生素B（B-Vitamins）0.5-2g/L，氯化钠（Tracesalt）0.5-2g/L，pH7.0-7.5，120°C灭菌10-20min。
优选地，液体种子培养基组成为：葡萄糖（Glucose）4 g /L，酵母浸粉（Yeastextract）4 g/L，麦芽浸粉（Malt extract）5 g/L， 维生素B（B-Vitamins）1 g/L，氯化钠（Trace salt）1 g/L，pH 7.2或7.0。
砖红链霉菌CGMCC No.21851的孢子培养条件为29℃，24h。将新鲜种子培养基接种到发酵培养基。
进一步的，（2）液态发酵步骤具体为：
所述液态发酵方法为：将砖红链霉菌CGMCC No.21851的新鲜种子培养基悬液，接种于发酵培养基中。
豆粕发酵过程使用的豆粕发酵培养基的组成为：豆粕20-40g /L，葡萄糖3-5g /L，酵母浸粉3-5g/L，麦芽浸粉3-5g/L，维生素B0.5-2g/L，氯化钠0.5-2g/L，pH7.0-7.5，28°C-30°C下于转速为180-250转／分钟的摇床上摇瓶发酵3天，收获发酵培养物。
优选地，发酵培养基的组成为：豆粕30g /L，葡萄糖4g /L，酵母浸粉4g/L，维生素B1g/L，氯化钠1g/L，pH 7.2。
优选地，发酵培养基的组成为：豆粕30g /L，葡萄糖4g /L，酵母浸粉4g/L，维生素B1g/L，氯化钠1g/L，pH 7.0。
每个发酵培养瓶中装入灭菌后的培养基，接种量10%体积比接种种子培养基。
发酵培养瓶于29℃培养3天，收获发酵培养基，用于分离纯化染料木素。
进一步的，（3）染料木素的提取、分离和纯化步骤具体为：
（1）发酵培养物用有机溶剂如乙酸乙酯提取，减压悬蒸提取液得到乙酸乙酯粗提物；
（2）乙酸乙酯粗提物采用正相色谱柱以除去主要杂质，分别用10%二氯甲烷-甲醇、50%二氯甲烷-甲醇和90%二氯甲烷-甲醇洗脱2-3个柱体积，收集洗脱液，经TLC或HPLC分析后，分别合并含有染料木素的收集液；减压悬蒸除去洗脱溶剂后，得到含有染料木素的粗品。
（3）对染料木素粗品进行半制备HPLC纯化，得到染料木素，正相HPLC使用的流动相为35%乙腈-水，收集含染料木素的洗脱峰并经减压悬蒸或者冷冻干燥后，得到染料木素纯品。
砖红链霉菌CGMCC No.21851的发酵培养基约10L，经上述分离纯化步骤，可以得到染料木素纯品327.4mg。
为了提高砖红链霉菌CGMCC No.21851的染料木素含量，在发酵培养基中需要含有丰富的碳源与氮源。碳源包括各种单糖（如葡萄糖）、双糖（例如麦芽糖）和多糖（如淀粉）等；氮源、特别是有机氮源，包括氨基酸、蛋白胨、黄豆饼粉、棉籽饼粉、酵母粉、玉米浆和花生饼粉等，此外培养基中还需要含有丰富染料木苷，染料木苷原料包括大豆、槐角、葛根、金雀花等，这些培养基成分不仅为砖红链霉菌CGMCC No.21851的生长提供必需的营养物质和能量，也为染料木素的合体提供所需的前提或构造单元。因此，砖红链霉菌CGMCC No.21851的发酵培养包括但不仅限于上述的发酵培养基配方。
本发明提供了一种利用砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵制备染料木素的方法，能够将染料木苷高效率转化为染料木素，为染料木素的生产制备提供了新方法、途径，同时提高了大豆副产物豆粕的综合利用和附加值。
附图说明
图1实施例2中砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵制备得到的染料木素HPLC图
图2染料木素标准品的HPLC图
图3实施例2中砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵制备得到的染料木素和染料木素标准品的TLC图
图4实施例2中砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵制备得到的染料木素1H-NMR核磁谱图
图5实施例2中砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵制备得到的染料木素13C-NMR核磁谱图
图6实施例4中空白培养基乙酸乙酯提取物的HPLC图
图7实施例4中砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵培养基的乙酸乙酯粗提物的HPLC图
图8不同培养基对染料木素得率的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中使用的YIM38培养基的配方如下：葡萄糖（Glucose）4 g /L，酵母浸粉（Yeast extract）4 g/L，麦芽浸粉（Malt extract）5 g/L，维生素B（B-Vitamins）1 g/L，氯化钠（Trace salt）1 g/L，琼脂粉（Agar）20.0 g，pH 7.2。
实施例1: 砖红链霉菌CGMCC No.21851液态发酵培养
（1）制备种子培养基：将零下80℃冰箱中冷冻保藏的砖红链霉菌CGMCC No.21851悬液，融化后接种于种子培养基中（培养基成分种子培养基组成为：葡萄糖4 g /L，酵母浸粉4 g/L，麦芽浸粉5 g/L，维生素B1 g/L，氯化钠1 g/L，pH 7.2）。29℃培养1天，用于接种到发酵培养基中。
（2）液态发酵培养：以10%的比例将种子培养基加入到发酵培养基中（豆粕30 g /L，葡萄糖4 g /L，酵母浸粉4 g/L，维生素B1 g/L，氯化钠1 g/L，pH 7.2）。29℃培养3天，得到发酵培养物。
实施例2: 砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵物的提取与浸膏的获得
取实施例1中砖红链霉菌CGMCC No.21851的豆粕发酵物发酵用有机溶剂乙酸乙酯超声浸提3次，合并提取液，减压悬蒸提取液得到乙酸乙酯浸膏。
实施例3: 染料木素的分离、制备及结构鉴定
取实施例2中的乙酸乙酯浸膏采用正相色谱柱以除去主要杂质，分别用10%二氯甲烷-甲醇、50%二氯甲烷-甲醇和90%二氯甲烷-甲醇洗脱2-3个柱体积，收集洗脱液，经TLC或HPLC（用35％乙腈-水溶液进行洗脱50min）分析后，分别合并含有染料木素的收集液；减压悬蒸除去洗脱溶剂后，得到含有染料木素的粗品，然后对染料木素粗品进行半制备HPLC纯化，得到染料木素，正相HPLC使用的流动相为35%乙腈-水，收集含染料木素的洗脱峰并经减压悬蒸或者冷冻干燥后，得到染料木素纯品。
式I化合物的结构鉴定：式I化合物为黄色粉末。图1的砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵得到的染料木素的HPLC（用35％乙腈-水溶液进行洗脱50min）结果和图2染料木素标准品的HPLC结果可以看出式I化合物和染料木素标品保留时间相同；图3的TLC结果显示，式I化合物和染料木素标品位置相同；高分辨质谱给出准分子离子m/z 271.0601[M+H]+，提示分子组成为C15H10O4，结合1H-NMR（图4）、13C-NMR（图5），确定了式I化合物为染料木素。
实施例4: 染料木素的得率
将相同体积的空白培养基和加入砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵培养基根据实施例1-2处理，将得到的乙酸乙酯提取物合并蒸干，甲醇溶解后过甲醇溶解后过0.22μm滤膜，进行HPLC分析，计算染料木素的得率：染料木素质量（mg）/培养基体积。取染料木素标准品，用甲醇溶解定容，进行HPLC制作标准曲线。HPLC色谱条件如下：Agilent 1100，配有ELSD检测器和Chemstation色谱工作站；XDB-C18色谱柱(250×4.6mm，5μm)；用5-95％乙腈-水溶液进行洗脱50min，流速1mL/min，进样量10μL。图6为空白培养基的HPLC图，图7为砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵培养基的HPLC图，结果表明，空白培养基染料木素的得率为0.452mg/L，砖红链霉菌CGMCC No.21851发酵培养基染料木素的得率为32.65mg/L，发酵液中的染料木苷含量接近于0。
实施例5: 不同豆粕浓度对染料木素得率的影响
根据表1中的豆粕浓度，配置发酵发酵培养基（葡萄糖4 g /L，酵母浸粉4 g/L，维生素B1 g/L，氯化钠1 g/L），120°C灭菌30min后，以10%的比例将种子培养基加入到发酵培养基中，29℃培养3天，得到发酵培养物。对发酵培养物用乙酸乙酯浸提，HPLC分析染料木素，不同豆粕浓度的染料木素含量见表1，从表1可以看出，豆粕浓度在10-30g/L的范围内，豆粕浓度越高，染料木苷的浓度均为或接近于0，染料木素提高的幅度较大。
表1 不同豆粕浓度对染料木素得率的影响
实施例6: 不同培养基对染料木素得率的影响
以10%的比例将种子培养基分别接种到含有30%豆粕的马铃薯培养基、高氏1号培养基、YIM38培养基、沙氏培养基、查氏培养基中，考察不同培养基对染料木素得率的影响。如图8所示，在YIM38培养基中，染料木素的得率最高。
实施例7: 不同培养条件对染料木素的得率
以10%的比例将种子培养基加入到发酵培养基中（豆粕30 g /L，葡萄糖4 g /L，酵母浸粉4 g/L，维生素B1 g/L，氯化钠1 g/L），考察不同因素（A，培养温度；B，pH值 ；C, 接种量；D，培养时间）对染料木素得率的影响。最优参数为接种10%的种子培养基，在29℃、pH为7的条件下培养3天。
表2 正交设计对染料木素的得率
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.在一种制备染料木素的方法，其包括如下步骤：
（1）发酵培养链霉菌CGMCC No.21851，收获发酵物；
（2）从发酵物中提取、分离、纯化获得染料木素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养链霉菌CGMCC No.21851包括如下步骤：
（1）菌种液体种子培养：
液体种子培养基的制备：葡萄糖3-6g /L，酵母浸粉3-6 g/L，麦芽浸粉4-7g/L，维生素B0.5-2g/L，氯化钠0.5-2g/L，pH7.0-7.5，120°C灭菌10-20min；
（2）液体发酵所述链霉菌：
将链霉菌CGMCC No.21851的新鲜种子培养基，经豆粕发酵得到豆粕发酵产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，菌种液体种子培养条件：将菌株接种到灭菌后的培养基中，28-30°C下于转速为180-250转／分钟的摇床上摇瓶发酵1天。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液体种子培养基的制备：葡萄糖4g /L，酵母浸粉4g/L，麦芽浸粉5g/L，维生素B1g/L，氯化钠1g/L，pH7.2，120°C灭菌15min。
5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，菌种液体种子培养条件：将菌株接种到灭菌后的培养基中，29°C下于转速为200转／分钟的摇床上摇瓶发酵1天。
6.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，豆粕发酵过程使用的豆粕发酵培养基的组成为：豆粕20-40g /L，葡萄糖3-5g /L，酵母浸粉3-5g/L，麦芽浸粉3-5g/L，维生素B0.5-2g/L，氯化钠0.5-2g/L，pH7.0-7.5，28°C-30°C下于转速为180-250转／分钟的摇床上摇瓶发酵3天，收获发酵培养物，其中种子培养基的接种量为5-15%体积比。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，豆粕发酵过程使用的豆粕发酵培养基的组成为：豆粕30 g /L，葡萄糖4 g /L，酵母浸粉4 g/L，麦芽浸粉5 g/L，维生素B1 g/L，氯化钠1 g/L，pH 7.2，29°C下于转速为200转／分钟的摇床上摇瓶发酵3天，收获发酵培养物，其中种子培养基的接种量为10%体积比。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，豆粕发酵过程使用的豆粕发酵培养基的组成为：豆粕30 g /L，葡萄糖4 g /L，酵母浸粉4 g/L，麦芽浸粉5 g/L，维生素B1 g/L，氯化钠1 g/L，pH 7.0，29°C下于转速为200转／分钟的摇床上摇瓶发酵3天，收获发酵培养物，其中种子培养基的接种量为10%体积比。
9.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，从所述发酵物中提取、分离和纯化所述染料木素包括以下步骤：
（1）发酵培养物用有机溶剂提取，减压悬蒸提取液得到粗提物；
（2）对粗提物进行正相硅胶色谱柱分离和半制备HPLC纯化，得到染料木素。
10.根据权利要求 9所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
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