CN103755785A

CN103755785A - 一种新四聚肽化合物及其制备方法

Info

Publication number: CN103755785A
Application number: CN201410018290.2A
Authority: CN
Inventors: 李一青; 戎贺; 赵立兴; 徐丽华
Original assignee: Yunnan University YNU
Current assignee: Yunnan University YNU
Priority date: 2014-01-15
Filing date: 2014-01-15
Publication date: 2014-04-30
Anticipated expiration: 2034-01-15
Also published as: CN103755785B

Abstract

本发明是一种新的四聚肽化合物，其特点是通过发酵培养保藏登记号为CCTCCM2013728的一株链霉菌菌株（Streptomycessp.）YIMR8，再从其发酵液中分离、纯化提取物，得到分子式为C₃₀H₄₄N₄O₆，分子量为556的一种新的四聚肽化合物。

Description

一种新四聚肽化合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新的四聚肽化合物及其制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

植物内生菌为生活史中某一阶段生活在植物组织内，不对植物产生明显病害症状的一类微生物菌群。植物内生菌通过与宿主植物的长期共同进化，拥有特殊的代谢途径及独特的生物合成能力，从其次生代谢产物中发现新结构化合物的几率较大。云南西双版纳丰富的药用植物中蕴藏着大量植物内生菌，开展从中寻找新先导化合物的研究，为后续具有自主知识产权的新药研发奠定基础具有重要意义。

现有技术中发现的聚肽类化合物多源自土壤或海洋环境菌株，尚未从植物内生菌中发现聚肽类化合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种不同于已知聚肽类化合物结构的新四聚肽化合物。

本发明的另一个目的是提供一种新四聚肽化合物的制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种新四聚肽化合物，本化合物的产生菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心；保藏日期：2013年12月29日；保藏登记入册编号为CCTCC M2013728 ；通过培养一株分离自云南西双版纳药用植物组织内的链霉菌菌株(Streptomycessp.)YIM R8，再从其发酵液提取物中分离纯化化合物，得到本四聚肽化合物；本四聚肽化合物是分子式为C₃₀H₄₄N₄O₆，分子量为556的化合物，该化合物具有如下结构：

Figure 2014100182902100002DEST_PATH_IMAGE001

(I)

本发明的四聚肽化合物的制备方法，包括以下步骤：

(l) 菌种液体种子培养：①液体种子培养基的制备：取酵母膏2.0~6.0g ；葡萄糖2.0~6.0g ；麦芽膏3.0~7.0g ；复合维生素0.5~1.5ml ；加水至1000ml，pH 7.2，120°C灭菌30min ；②发酵：将菌株YIM R8接种到灭菌后的培养基中，28°C下于转速为190~250转／分钟的摇床上摇瓶发酵2天；

(2) 菌种发酵培养：①发酵培养基的制备：取淀粉20.0~30.0g ；牛肉膏1.0~5.0g ；葡萄糖0.5~1.5g ；酵母膏3.0~7.0g ；蛋白胨1.0~5.0g ；CaCO₃ 2.0~6.0g ；加水至1000ml，pH 7.0，120°C灭菌30 min ；②发酵：将上述方法(l)中得到的菌株YIM R8种子液加到灭菌后的发酵培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10 %，28°C下于转速为190~250转／分钟的摇床上摇瓶发酵6~8天；

(3) 发酵液处理：①发酵液经2500~3500转／分钟离心，离心时间为15~25分钟；②以等体积乙酸乙醋萃取3~5次，回收乙酸乙醋，得到棕褐色粗提取物；③进行硅胶柱层析，以三氯甲烷：甲醇40 ：1至1 ：1梯度洗脱，收集含有该化合物的组分，回收溶剂，得到粗品一种四聚肽化合物；④分别用石油醚、三氯甲烷依次对粗品一种四聚肽化合物进行洗涤，弃去分别溶解于石油醚、三氯甲烷中的杂质，得到一种四聚肽化合物较纯品；⑤将一种四聚肽化合物较纯品用甲醇溶解，滤去不溶物，滤液浓缩蒸干得到一种四聚肽化合物纯品。

在液体种子培养基的制备中最好是酵母膏为4.0g ；葡萄糖为4.0g ；麦芽膏为5.0g ；复合维生素为1.0ml。

在发酵培养基的制备中最好是淀粉为24.0g ；牛肉膏为3.0g ；葡萄糖为1.0g ；酵母膏为5.0g ；蛋白胨为3.0g ；CaCO₃为4.0g。

摇瓶发酵时摇床转数为220转／分钟为宜，发酵时间以7天为宜。

发酵液离心时，离心机转速以3000转／分钟为宜，所述的离心时间为20分钟为宜，所述的乙酸乙醋的萃取次数以4次为宜。

一种四聚肽化合物纯品经分析型HPLC检测，色谱柱（250′4.6mm，Luna 5μm，Phenomenex，C18)；甲醇：水7 ：3等度洗脱，检测波长254nm，流速1.0ml/min，证实一种四聚肽化合物纯品纯度高于98％。

附图说明

图 1 为本发明四聚肽化合物的化学结构式；

图 2 为本发明四聚肽化合物的红外吸收光谱；

图 3 为本发明四聚肽化合物的氢谱 (DMSO) ；

图 4 为本发明四聚肽化合物的碳谱 (¹³C-NMR、DEPT) ；

图 5 为本发明四聚肽化合物的HMBC谱；

图 6 为本发明四聚肽化合物的HSQC谱；

图 7 为本发明四聚肽化合物的H-H COSY谱；

图 8 为本发明四聚肽化合物的ROESY谱；

图 9 为本发明四聚肽化合物的TOCSY谱；

图 10 为本发明四聚肽化合物的质谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例 1

化合物(I)的制备

(l) 菌种液体种子培养：①液体种子培养基的制备：取酵母膏4.0g ；葡萄糖4.0g ；麦芽膏5.0g ；复合维生素1.0ml ；加水至1000ml，pH 7.2，120°C灭菌30min ；②发酵：将菌株YIM R8接种到灭菌后的培养基中，28°C下于转速为220转／分钟的摇床上摇瓶发酵2天。

(2) 菌种发酵培养：①发酵培养基的制备：取淀粉24.0g ；牛肉膏3.0 g ；葡萄糖1.0g ；酵母膏5.0g ；蛋白胨3.0g ；CaCO₃ 4.0g ；加水至1000ml，pH 7.0，120°C灭菌30 min ；②发酵：将上述方法(l)中得到的菌株YIM R8种子液加到灭菌后的发酵培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10 %，28°C下于转速为220转／分钟的摇床上摇瓶发酵7天。

(3) 发酵液处理：①发酵液经3000转／分钟离心，离心时间为20分钟；②以等体积乙酸乙醋萃取4次，回收乙酸乙醋，得到棕褐色粗提取物；③进行硅胶柱层析，以三氯甲烷：甲醇40 ：1至1 ：1梯度洗脱，收集含有该化合物的组分，回收溶剂，得到粗品一种四聚肽化合物；④分别用石油醚、三氯甲烷依次对粗品一种四聚肽化合物进行洗涤，弃去分别溶解于石油醚、三氯甲烷中的杂质，得到一种四聚肽化合物较纯品；⑤将一种四聚肽化合物较纯品用甲醇溶解，滤去不溶物，滤液浓缩蒸干得到一种四聚肽化合物纯品。

如上所得的本发明化合物，具有下述理化性质：

1．性状：白色粉末。

2．分子量：分子量为556。

3．分子式：分子式为C₃₀H₄₄N₄O₆。

4．元素分析：C 64.73％、H 7.97％、N 10.06％、O 17.24％。

5．红外吸收光谱中的特征官能团：(KBr) IR (3303，1727，1666，1642，1541cm^-1波数)证明分子结构中有氨基，羧羰基，酰胺羰基，烯双键和苯环。

6．综合¹H谱、¹³C谱、HMBC、HSQC、H-H COSY谱、ROESY谱、TOCSY谱及质谱 (ESI-MS) [M+Na]⁺= 579分析数据，确定了本发明四聚肽化合物的分子量为556，分子式为C₃₀H₄₄N₄O₆，其结构如附图1所示。

实施例2

化合物(I)的制备

(l) 菌种液体种子培养：①液体种子培养基的制备：取酵母膏2.0g ；葡萄糖2.0g ；麦芽膏3.0g ；复合维生素0.5ml ；加水至1000ml，pH 7.2，120°C灭菌30min ；②发酵：将菌株YIM R8接种到灭菌后的培养基中，28°C下于转速为190转／分钟的摇床上摇瓶发酵2天。

(2) 菌种发酵培养：①发酵培养基的制备：取淀粉20.0g ；牛肉膏1.0g ；葡萄糖0.5g ；酵母膏3.0g ；蛋白胨1.0g ；CaCO₃ 2.0g ；加水至1000ml，pH 7.0，120°C灭菌30 min ；②发酵：将上述方法(l)中得到的菌株YIM R8种子液加到灭菌后的发酵培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10 %，28°C下于转速为190转／分钟的摇床上摇瓶发酵6天。

(3) 发酵液处理：①发酵液经2500转／分钟离心，离心时间为15分钟；②以等体积乙酸乙醋萃取3次，回收乙酸乙醋，得到棕褐色粗提取物；③进行硅胶柱层析，以三氯甲烷：甲醇40 ：1至1 ：1梯度洗脱，收集含有该化合物的组分，回收溶剂，得到粗品一种四聚肽化合物；④分别用石油醚、三氯甲烷依次对粗品一种四聚肽化合物进行洗涤，弃去分别溶解于石油醚、三氯甲烷中的杂质，得到一种四聚肽化合物较纯品；⑤将一种四聚肽化合物较纯品用甲醇溶解，滤去不溶物，滤液浓缩蒸干得到一种四聚肽化合物纯品。

实施例3

化合物(I)的制备

(l) 菌种液体种子培养：①液体种子培养基的制备：取酵母膏6.0g ；葡萄糖6.0g ；麦芽膏7.0g ；复合维生素1.5ml ；加水至1000ml，pH 7.2，120°C灭菌30min ；②发酵：将菌株YIM R8接种到灭菌后的培养基中，28°C下于转速为250转／分钟的摇床上摇瓶发酵2天。

(2) 菌种发酵培养：①发酵培养基的制备：取淀粉30.0g ；牛肉膏5.0g ；葡萄糖1.5g ；酵母膏7.0g ；蛋白胨5.0g ；CaCO₃ 6.0g ；加水至1000ml，pH 7.0，120°C灭菌30 min ；②发酵：将上述方法(l)中得到的菌株YIM R8种子液加到灭菌后的发酵培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10 %，28°C下于转速为250转／分钟的摇床上摇瓶发酵8天。

(3) 发酵液处理：①发酵液经3500转／分钟离心，离心时间为25分钟；②以等体积乙酸乙醋萃取5次，回收乙酸乙醋，得到棕褐色粗提取物；③进行硅胶柱层析，以三氯甲烷：甲醇40 ：1至1 ：1梯度洗脱，收集含有该化合物的组分，回收溶剂，得到粗品一种四聚肽化合物；④分别用石油醚、三氯甲烷依次对粗品一种四聚肽化合物进行洗涤，弃去分别溶解于石油醚、三氯甲烷中的杂质，得到一种四聚肽化合物较纯品；⑤将一种四聚肽化合物较纯品用甲醇溶解，滤去不溶物，滤液浓缩蒸干得到一种四聚肽化合物纯品。

Claims

1. 一种四聚肽化合物的制备方法，其特征是该方法包括如下步骤 :

(l) 菌种液体种子培养：

①液体种子培养基的制备 :取酵母膏2.0~6.0g、葡萄糖2.0~6.0g、麦芽膏3.0~7.0g、复合维生素0.5~1.5ml、加水至1000ml，pH 7.2，120°C灭菌30min ；②发酵 :将菌株YIM R8接种到灭菌后的培养基中，28°C下于转速为190~250转／分钟的摇床上摇瓶发酵2天；

(2) 菌种发酵培养：

①发酵培养基的制备 :取淀粉20.0~30.0g、牛肉膏1.0~5.0g、葡萄糖0.5~1.5g、酵母膏3.0~7.0g、蛋白胨1.0~5.0g、CaCO₃ 2.0~6.0g、加水至1000ml，pH 7.0，120°C灭菌30min ；②发酵：将上述方法(l)中得到的菌株YIM R8种子液加到灭菌后的发酵培养基中，加菌种量为发酵培养基重量的10 %，28°C下于转速为190~250转／分钟的摇床上摇瓶发酵6~8天；

(3) 发酵液处理：

①发酵液经2500~3500转／分钟离心，离心时间为15~25分钟；②以等体积乙酸乙醋萃取3~5次，回收乙酸乙醋，得到棕褐色粗提取物；③进行硅胶柱层析，以三氯甲烷：甲醇40 ：1至1 ：1梯度洗脱，收集含有该化合物的组分，回收溶剂，得到粗品一种四聚肽化合物；④分别用石油醚、三氯甲烷依次对粗品一种四聚肽化合物进行洗涤，弃去分别溶解于石油醚、三氯甲烷中的杂质，得到一种四聚肽化合物较纯品；⑤将一种四聚肽化合物较纯品用甲醇溶解，滤去不溶物，滤液浓缩蒸干得到一种四聚肽化合物纯品，所述四聚肽化合物的结构为：

。

2. 根据权利要求1所述的一种四聚肽化合物的制备方法，其特征是所述的酵母膏为4.0g、葡萄糖为4.0g、麦芽膏为5.0g、复合维生素为1.0ml。

3. 根据权利要求1所述的一种四聚肽化合物的制备方法，其特征是所述的淀粉为24.0g、牛肉膏为3.0g、葡萄糖为1.0g、酵母膏为5.0g、蛋白胨为3.0g、CaCO₃为4.0g。

4. 根据权利要求1所述的一种四聚肽化合物的制备方法，其特征是所述的摇床转数为220转／分钟，所述发酵时间为7天。