CN1342774A - 一种微生物发酵制备的抗肿瘤抗生素 - Google Patents

一种微生物发酵制备的抗肿瘤抗生素 Download PDF

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元英进
石炳兴
胡宗定
陈海涛
马忠海
赵红
路明
刘喜朋
牛晋阳
陈贵斌
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Abstract

本发明公开了一种微生物发酵制备的抗肿瘤抗生素。该抗生素是从我国海南省三亚地区土壤中筛选得到的链霉菌菌株经菌种培养、发酵、发酵液的过滤、吸附洗脱、萃取、浓缩、层析分离纯化、冷冻干燥等步骤得到的,纯度达到95%以上,该抗生素的结构式下式所示,其分子式为C32H44N2O9,分子量为600,熔点大于240℃,外观呈淡亮黄色结晶;它在药学上接受的盐是盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐。该抗生素体外抗白血病和抗非小细胞肺癌等活性较紫杉醇高出100－1000倍,具有显著的抗肿瘤活性和抗菌活性;并且制备方法简单,原料来源方便。

Description

一种微生物发酵制备的抗肿瘤抗生素
                        技术领域
本发明涉及一种微生物发酵制备的抗肿瘤抗生素。属于生物制药。
                        背景技术
迄今发现的微生物来源的抗生素近万种，其中许多已作为医药、农药得到广泛应用，但疗效好、毒性低的抗肿瘤抗生素为数甚少。病原微生物的抗药性在广泛传播。筛选抗肿瘤抗生素、抗病原微生物的新抗生素任日趋迫切。
                        发明内容
本发明的目的在于提供一种微生物发酵制备的抗肿瘤抗生素。经初步测试，该抗生素体外抗白血病和抗非小细胞肺癌等活性较紫杉醇高出100-1000倍，具有显著的抗肿瘤活性。
本发明是通过下述技术方案加以实现的：从我国海南省三亚地区土壤中筛选得到的链霉菌菌株经菌种培养、发酵、发酵液的过滤、吸附洗脱、萃取、浓缩、层析分离纯化、冷冻干燥等步骤得到纯度为95％以上的抗生素。其特征在于：该抗生素的结构式如式(1)所示。其分子式为C32H44N2O9，分子量为600，熔点大于240℃，外观呈淡亮黄色结晶；它在药学上接受的盐是盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐。
本发明抗生素的结构采用核磁共振、红外、紫外等光谱学方法和质谱方法确定。
                        式(1)
Figure A0114144300031
本发明抗生素的抗肿瘤活性如表(1)所示，抗菌活性如表(2)所示。
             表(1)    本发明抗生素的体外抗肿瘤活性
          肿瘤细胞系                           IC50
非小细胞肺癌细胞PG-49                       6×10-13M
淋巴白血病细胞L1210                         5×10-12M
乳腺癌细胞MCF-7                             ＞10-6M
             表(2)本发明抗生素的抗菌活性
             Microorganism                   MIC(μg/ml)
          Staphylcoccus aureus ATCC29213         128
          Staphylcoccus aureus ATCC25923         128
          Staphylcoccus aureus 15                128
          Staphylcoccus epidermidis ATCC12228    128
          Staphylcoccus epidermidis 99-57        128
          Staphylcoccus epidermidis 99-58        128
          Bacillus subtillu 3351                 0.25
革兰氏阳  Streptococcus pneumoniae 31920         0.5
性菌      Streptococcus pneumoniae 01-1          0.5
          Streptococcus pneumoniae 00-2          0.25
          Streptococcus pyogenes A-1             1
          Streptococcus pyogenes 556             1
          Streptococcus pyogenes 00-19           1
          Enterococcus faecalis 32221            4
          Enterococcus faecalis 99-43            4
          Enterococcus faecalis 99-48            0.5
革兰氏阴  Escherichia coli ATCC25922             ＞128
性菌      Escherichia coli 1515                  ＞128
          Pseudomonas aeruginosa29               ＞128
          Pseudomonas aeruginosa ATCC27853       ＞128
          Klebsiella pneumoniae 99-35            ＞128
          Klebsiella pneumoniae 99-34            ＞128
          Acinetobacter calcoaceticus 25001      ＞128
          Acinetobacter calcoaceticus 99-33      ＞128
          Acinetobacter cloacae 45301            ＞128
          Acinetobacter cloacae 99-50              ＞128
          Eterobacter aerogenes 45102              ＞128
          Citrobacter freundii 45301               ＞128
          Serratia marcescens 41002                ＞128
          Salmonella typhi H901                    ＞128
本发明抗生素的NMR光谱解析数据见表(3)。
            表(3)本发明抗生素NMR光谱解析数据
      C-NMR         HMQC-H       COSY-H       HMBC-H
C      δ           DEPT    δ            H     δ            H      δ
1     185.8    C                          2     7.40
                                          3     7.55
2     124.8    CH    7.55    3    7.40    3     7.40
3     148.0    CH    7.40    2    7.55    32    1.82
                                          5     5.92
                                          2     7.40
4     135.4    CH    6.34    11   5.57    32    1.82
                                          6     2.79
                                          3     7.40
5     142.7    CH    5.92    6    2.79    31    0.98
                             32   1.82    32    1.82
                                          6     2.79
                                          7     3.60
                                          3     7.40
6     34.9    CH     2.79    5    5.92    31    0.98
                             31   0.98    7     3.65
7     77.1    CH     3.65    32   1.82    26    0.67
                                          31    0.98
                                          25    1.10
                                          32    1.82
                                          9     4.30
8     36.5    CH     1.82    7    3.65    26    0.67
                                          9     4.30
9    72.8     CH    4.30    8     1.82    26    0.67
                            10    6.34    32    1.82
                                          7     3.65
                                          11    5.57
                                          10    6.34
10   135.0    CH    6.34    9     4.30    6     2.79
                            11    5.57    9     4.30
                                          8     1.82
11   131.5    CH    5.57    10    6.34    23    2.92
                                          23    2.79
                                          9     4.30
12   56.1     C                           25    1.10
                                          23    2.92
                                          23    2.79
                                          10    6.34
13   104.6    C
14   63.5     CH    4.30                  30    1.13
                                          27    3.02
15   195.6                                14    4.30
                                          27    3.02
16   62.5     CH    4.18                  17    5.45
17   81.6     CH    5.45                  21    3.68
18   23.2     CH2  1.10                        0.98
19   31.7     CH2  1.82    20    3.47    26    0.67
20   67.4     CH    3.47    19    1.82    22    1.10
                                          7     3.65
21   76.7     CH    3.68    22    1.10    22    1.10
                                          17    5.45
22   22.7     CH3  1.10    21    3.68
23   51.3     CH2  2.92                  11    5.57
                    2.79
24    100.1   C                           25    1.10
                                          23    2.79
                                          11    5.57
                                          9     4.30
                                          23    2.92
25    22.7    CH3  1.10
26    12.7    CH3  0.65                  7     3.65
                                          8     1.82
27    43.3    CH    3.15    30    1.13    30    1.13
                                          20    4.35
28    177.1   C                           30    1.13
                                          29    2.68
                                          27    3.02
                                          20    4.35
29    26.8    CH3   2.68                 NH    7.75
30    17.6    CH3   1.13    27   1.13    23    2.79
31    17.6    CH3   0.98    6    2.79    7     3.65
                                          8     1.82
32    12.7    CH3   1.82                 5     5.92
                                          3     7.40
本发明抗生素的制备过程包括产生菌的培养，发酵，分离纯化。
1.产生菌种子培养和发酵孢子传代培养采用Isp.5号培养基，28℃培养10-15天。种子培养采用培养基成分为葡萄糖0.5％，可溶性淀粉2.0％，牛肉膏0.4％，蛋白胨0.4％，玉米浆0.2％，MgSO4 0.1％，K2HPO4 0.05％，NaCl 0.1％，自来水。培养条件为pH6.0，28℃振荡培养48小时。发酵培养基成分为葡萄糖0.5％，玉米淀粉2.5％，黄豆饼粉2.5％，玉米浆0.2％，MgSO4 0.1％，K2HPO4 0.05％，NaCl 0.1％，自来水。发酵条件为pH6.0，28℃振荡培养或液体搅拌深层发酵96小时。
2.分离纯化方法
链霉菌菌株的发酵液之滤液，经大孔树脂吸附、甲醇/水溶液洗脱液或乙酸乙酯萃取液，减压真空浓缩，以硅胶柱层析展开，收集活性部分，浓缩，冷冻干燥即得式(1)所示抗生素，纯度可达95％以上。
本发明的优点在于该抗生素体外抗白血病和抗非小细胞肺癌等活性较紫杉醇高出100-1000倍，具有显著的抗肿瘤活性和抗菌活性；并且制备方法简单，原料来源方便。
                        附图说明
图1为本发明抗生素的紫外吸收光谱；
图2为本发明抗生素的红外吸收光谱；
                    具体实施方式
实施例一、
孢子传代在ISP5号培养基上，28℃振荡培养10-15天；种子培养基成分为葡萄糖 0.5％，可溶性淀粉 2.0％，牛肉膏 0.4％，蛋白胨 0.4％，玉米浆0.2％，MgSO4 0.1％，K2HPO4 0.05％，NaCl 0.1％，自来水。PH6.0，28℃振荡培养48小时的种子转接于成分为葡萄糖0.5％，玉米淀粉2.5％，黄豆饼粉2.5％，玉米浆 0.2％，MgSO4 0.1％，K2HPO4 0.05％，NaCl 0.1％，自来水的发酵培养基；pH6.0，28℃振荡培养72-96小时。发酵液经离心或过滤，取滤液，1-3倍体积的乙酸乙酯萃取三遍，减压浓缩萃取液，经硅胶柱层析，三氯甲烷/甲醇展开，收集活性组分，去流动相，即得本发明抗生素。
实施例二、
孢子传代在ISP5号培养基上，28℃振荡培养10-15天；种子培养基成分为葡萄糖 0.5％，可溶性淀粉 2.0％，牛肉膏 0.4％，蛋白胨 0.4％，玉米浆0.2％，MgSO4 0.1％，K2HPO4 0.05％，NaCl 0.1％，自来水。PH6.0，28℃振荡培养48小时的种子转接于成分为葡萄糖0.5％，玉米淀粉2.5％，黄豆饼粉2.5％，玉米浆 0.2％，MgSO4 0.1％，K2HPO4 0.05％，NaCl 0.1％，自来水的发酵培养基；pH6.0，28℃发酵罐液体搅拌深层发酵72-96小时。发酵液经离心或过滤，取滤液，1-3倍体积的乙酸乙酯萃取三遍，减压浓缩萃取液，经硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇展开，收集活性组分，去流动相，即得本发明抗生素。
实施例三、
孢子传代在ISP5号培养基上，28℃振荡培养10-15天；种子培养基成
分为葡萄糖 0.5％，可溶性淀粉 2.0％，牛肉膏 0.4％，蛋白胨 0.4％，玉米浆 0.2％，MgSO4 0.1％，K2HPO4 0.05％，NaCl 0.1％，自来水。PH6.0，28℃振荡培养48小时的种子转接于成分为葡萄糖 0.5％，玉米淀粉 2.5％，黄豆饼粉2.5％，玉米浆 0.2％，MgSO4 0.1％，K2HPO4 0.05％，NaCl 0.1％，自来水的发酵培养基；pH6.0，28℃发酵罐液体搅拌深层发酵72-96小时。发酵液经离心或过滤，取滤液，1-3倍体积的二氯甲烷萃取三遍，减压浓缩萃取液，经硅胶柱层析，二氯甲烷/甲醇展开，收集活性组分，去流动相，即得本发明抗生素。

Claims (1)

1.一种微生物发酵制备的抗肿瘤抗生素，该抗生素是从我国海南省三亚地区土壤中筛选得到的链霉菌菌株经菌种培养、发酵、发酵液的过滤、吸附洗脱、萃取、浓缩、层析分离纯化、冷冻干燥等步骤得到的，纯度达95％以上，其特征在于：该抗生素的结构式下式所示，其分子式为C32H44N2O9，分子量为600，熔点大于240℃，外观呈淡亮黄色结晶；它在药学上接受的盐是盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐。
Figure A0114144300021
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