发明内容
为了克服现有技术的不足和满足市场的需求,本发明的目的在于提供一种能以高产率生产紫杉醇的方法。
本发明的另一目的是提供一种可产生紫杉醇的新菌种。
本发明人经过多年大量深入细致地研究,发现、培养、诱变出一种新的菌种,其可产生紫杉醇,本发明人经过大量的实验研究出利用该新菌种来发酵生产紫杉醇的方法,可以较高产率生产紫杉醇。
本发明提供的一种能生产紫杉醇的菌种是链格孢单孢变种(Alternariaalternate var.monosporus)ST-026-R CGMCC No.0899。
本发明人从自云南省丽江地区的老君山海拔2500~3000米的针阔混交林中的7株300年以上的云南红豆杉(Taxus yunnanensis)树的树枝、树皮、叶和根皮采集样品310个。将树皮在无菌条件下,用60%酒精消毒,无菌水冲洗,吸干多余水分,将韧皮部一层层撕成薄片,再将样品切成小块,按内韧皮部至表皮层顺序排列,接种在水琼脂培养基上,在25℃恒温条件下培养7~15天,相继长出不同类型的微生物,对不同形态、不同颜色的菌落经纯化后进行发酵实验,从中选出紫杉醇产率较高的菌株作为出发菌株。对该菌株进行紫外诱变,紫外诱变数代后,得形态变异菌株,再以此为出发菌株继承诱变,得产紫杉醇较稳定的单孢菌株,以上形态变异经数代傅代培养较稳定,得到本发明的新单孢菌株。根据植物命名法规该菌株命名为链格孢单孢变种,学名为Alternaria alernata var.monosporus,代号为ST-026-R,菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市中关村北一条13号,保藏号为:CGMCC No.0899。
本发明提供的新菌株CGMCC 0899,具有以下微生物学特性:
菌丝细胞长宽大约相等或长大于宽2倍左右,细胞中间缢缩,两端膨大,在横隔处也缢缩,整条菌丝似链条状。菌丝分枝短,呈锐角状分枝。分生孢子链短,为复二叉分枝,孢子多为单细胞,大小约为20-25um,无色透明,无疣状物,卵形或棍棒状,孢痕清晰。
本发明的菌株在PDA琼脂培养基上,铺展、致密、圆形、有明显的两层轮纹,边缘整齐,内层黑褐色,边缘灰白色。菌丝无色或橄榄褐色,分枝,具横隔膜。具粗细两种菌丝,明显。菌丝生长快,孢子丰富,五天即可长满9cm的培养基表面。菌丝在培养基表面形成木质状硬块。幼菌丝常形成单个或成串的透明、长囊状或念珠状芽孢,比菌丝粗2~3倍以上。芽孢可萌发成新菌丝。菌丝顶部为一个尖、细、透明的长细胞。
本发明的菌株产生三种孢子,第一种为分生孢子(气生孢子),由菌丝分枝顶端长出孢子链,每个分枝顶部皆能形成孢子链,孢子链一般由4~6个孢子组成,少数可达8~10个,分生孢子梗多为4个细胞,圆柱形、透明、单生、直立。幼分生孢子为倒卵形或椭圆形,表明密布颗粒状点纹,颜色深,看不清分隔,大小约21~25×11~15um,菌丝宽为4um,喙长2.0um。自孢子顶部或侧面再形成孢子链。成熟的分生孢子为倒卵形,色浅,约25~15um,有4~6~8个横隔,1~2个纵隔。孢子细胞间有缢缩,喙长2.0um。第二种为芽孢,在菌丝生长初期和液体培养基中产生。应为内生真菌的特有孢子,长囊状或圆球状,能从侧面萌发形成菌丝。第三种孢子是初次发现,尚未见报导,即两条菌丝相平行,产生一接合管,在接合管中部产生一个透明、浅褐色的长椭圆形孢子,成熟的孢子由4~6个横隔,2~3个纵隔。其生长方式类似于藻类水绵的接合生殖,但不同于根霉的有性生殖。
本发明的菌株经基因分析鉴定为簇生链格孢(Alternaria fasciculata)。其形态见图1、图2和图3。
本发明提供的一种应用本发明的新菌株CGMCC 0899生产紫杉醇的方法,其包括在培养基中培养本发明菌株CGMCC 0899以使在所述菌株细胞内和所述培养基中产生和聚集紫杉醇,以及从所述细胞内和培养基中回收并提纯紫杉醇。
所述培养基可以是本领域常规或已知的培养基。所述培养基可含有碳源、氮源物质。还可以向培养基中加入其它有机或无机物质以促进微生物的生长和提高紫杉醇的产率。所述碳源包括但不限于葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘油、淀粉、乳糖、半乳糖。可使用的氮源包括但不限于花生粉、黄豆粉、玉米浆、酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、硝酸氨、氯化铵。碳源与氮源的比例可以优选为150∶1~40∶1。所述的无机物包括但不限于磷酸盐,镁盐,例如硫酸镁,铁盐,例如硫酸亚铁、三氯化铁,钠盐,如酒石酸钾钠。所述的培养基可包括但不限于微量元素,例如硼酸、碘化钾、二氯化钴、硫酸锌、硫酸锰,诱导子,例如甲基茉莉酮酸、花生四烯酸、柠檬酸铵、硝酸铈铵、高锰酸钾、丙酮酸、对-香豆酸、硫酸钒、马尿酸、α-萘乙酸、6-苄氨基嘌呤、硝酸银、肉硅酸等,前体物质,例如苯丙氨酸、苯甲酰胺、苯甲酸钠、乙酸钠、乙酰胺、丙酰胺、苯甲酸、乙酸铵等。
所述的培养可以在本领域的常规或已知条件下进行。所述的发酵可以在需氧条件下,温度可以为23~29℃,发酵初始pH值可为5.5~11.0,优选6.0~7.0,在发酵中后期可调节pH值为6.0~7.5。培养时间依培养条件而定,例如,发酵可进行6~9天。在所述发酵过程中优选在接种时加入诱导子甲基茉莉酮酸、花生四烯酸、柠檬酸铵、硝酸铈铵、高锰酸钾;优选其浓度为(占培养基)0.005%~0.1%。在所述发酵过程中,菌体生长至对数生长后期时,可加入前体物质苯丙氨酸、苯甲酰胺、苯甲酸钠、乙酸钠、乙酰胺等物质;优选其浓度为(占培养基)0.005%~0.1%。在发酵过程中可用碱性溶液调节pH值。
所述的发酵过程可以在本领域常规或已知的装置和条件下进行,例如可使用摇瓶在本领域常规或已知的转速下进行;也可以在常规的发酵罐中进行,例如7L、50L发酵罐。
在所述发酵过程中需要使用7L、50L发酵罐时,可在发酵过程中流加补充碳源,在发酵前期不用调节pH值,在发酵中后期可调节pH值为6.0~7.0。可以采用菌丝体进罐的接种方式。在接种后到菌体生长至平台前期可使用较大通气量,平台期后通气量可降低。
为了从培养基中分离出紫杉醇,可以使用本领域常规或已知的用于从微生物的培养基中分离代谢物的任何分离方法。例如,菌丝体可以通过离心或过滤从发酵液中分离出来,紫杉醇可以用一种或一种以上不与水相混的有机溶剂(例如卤化烃如二氯甲烷、三氯甲烷等)从滤液中萃取出来。另一方面,分离出的菌丝体中所包含的紫杉醇可以通过例如用一种或一种以上溶剂(例如丙酮或甲醇)从菌丝体中提取出来。所得紫杉醇粗产物可以使用本领域常规或已知的纯化方法纯化,例如色谱法、结晶法。
从所述细胞和培养基中提取和纯化紫杉醇的方法可包括以下步骤:(1)将所述培养过程所得培养液分离出发酵菌体和发酵上清液;(2)用第一有机溶剂提取所得发酵菌体,用第二有机溶剂萃取所得发酵上清液,挥干溶剂;(3)将第(2)步所得物用色谱纯化的方法和结晶的方法纯化,得产物紫杉醇。
在所述发酵过程结束后,可以在室温或低于室温的温度下,优选低于室温,用稀酸或稀碱溶液调节所得发酵液的pH值为2~9,正常或避光下,优选避光,进行预处理后再进行所述分离过程。。所述第(1)步中可以按本领域常规或已知的方法进行分离,例如,将所得发酵液离心或过滤。
所述第(2)步中可将所得发酵菌体干燥粉碎后,再用有机溶剂提取。所述干燥可按照本领域常规或已知的方法进行,例如自然干燥、60℃以下温度下的烘干、真空冷冻干燥等,优选真空冷冻干燥,优选在避光条件下进行。所述从发酵菌体中提取紫杉醇用的第一有机溶剂可以是本领域常规或已知的溶剂,例如丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷等,优选用丙酮+乙酸乙酯。所述从发酵上清液中萃取紫杉醇用的第二有机溶剂可以是本领域常规或已知的溶剂,例如二氯甲烷、三氯甲烷等。所述挥干溶剂可按照本领域常规或已知的方法进行,例如自然挥发、减压浓缩等。
所述第(3)步中所述的色谱纯化可以按照本领域的常规或已知的方法进行,色谱柱填料可以用硅胶或氧化铝等,流动相可以用甲醇/二氯甲烷、乙醇/二氯甲烷、或丙酮/二氯甲烷等,也可以使用一个以上的色谱柱。
所述重结晶的方法是本领域常规或已知的方法进行。所述重结晶过程可以是:将所得物溶解于甲醇等溶剂中,可以加热至40~60℃,加入纯水,使紫杉醇晶体析出,降温至4~10℃,过滤。重复前述重结晶过程,直到达到一定纯度,过滤,真空干燥,即得紫杉醇纯品。所述重结晶过程可以是:将所得物溶解溶于丙酮等溶剂中,加入正己烷等溶剂,使紫杉醇结晶析出,溶液降温至4~10℃,过滤,重复前述重结晶过程,直到达到一定纯度,过滤得到晶体,减压干燥,即得纯化产品。
本发明的新菌株CGMCC 0899所产生的紫杉醇,主要是以胞内形式存在(胞内约为70%,胞外约为30%),因此单位发酵体积的高密度、高表达,是发酵工艺的目标。本发明的方法在发酵生长期采用高营养及最适生长pH值,发酵生长期是获得目的产物紫杉醇的时期,通过补料及pH值的调节,使菌体既保持了旺盛的生命力,又提高了生物合成紫杉醇的关键酶活性,最终达到高产的目的。
采用本发明的菌种CGMCC 0899及本发明的发酵方法,每升发酵体积可得120-227mg紫杉醇粗品,产率远高于现有的组织培养法及微生物发酵法。本技术周期短,成本低,产率高,应用于工业化生产,可彻底解决紫杉醇的工艺问题,既保护了自然资源,又可满足临床用药的需要。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述,这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解,对本发明技术特征所作的等同替换,或相应的改进,仍属于本发明的保护范围之内。
实施例1 从红豆杉树样品分离产紫杉醇的微生物
我们从云南省丽江地区的老君山海拔2500~3000米的针阔混交林中的7株300年以上的云南红豆杉(Taxus yunnanensis)树的树枝、树皮、叶和根皮采集样品310个,各剪成1cm×1cm大小的小块,经50~90%酒精消毒5分钟后,用匀浆器匀浆,之后,涂布于PDA培养基上,25℃培养4-5天后,长出的菌丝转移到斜面,20℃~35℃培养4天,取1cm2菌体接种于发酵培养基中(250ml三角瓶装量100ml,培养基配方:葡萄糖2%、黄豆饼粉0.5%、花生饼粉0.2%、MgSO4:0.01%、KH2PO4:0.05%),25℃,300rpm于摇床培养16天,用双层纱布过滤,得湿菌体,湿菌体于烘箱中(60℃)烘干,再用氯仿浸提(20克干菌体加入100ml氯仿)12小时,真空干燥得浸膏样品,加入1ml甲醇溶液,取5ul点样于硅胶平板,在三种不同层析系统中展开(乙酸乙酯∶异丙醇=95∶5v/v,氯仿∶甲醇=7∶3v/v,氯仿∶乙腈=7∶3v/v)之后60℃,30分钟烘干,用香草醛试剂(香草醛∶硫酸∶甲醇=1∶3∶96,v/v)显色(100℃,10分钟),挑选与标准品(Taxol)相同迁移率的斑点所对应的菌体,进行进一步的鉴定。得到红豆杉树内分离出的微生物数种(细菌、真菌),最终鉴定、选出几种产紫杉醇的内生真菌。
实施例2 产紫杉醇的新菌株的纯化鉴定
按实施例1所得到产紫杉醇几种菌株在PDA培养基平板上分离纯化三代(20~35℃,4~10天)之后,得到ST-026菌株。ST-026菌株在PDA培养基上生长迅速,产生丰富的孢子,孢子通常黑色或橄榄绿色。分生孢子梗直接从琼脂培养基长出,并在菌丝的侧枝上长出分枝的分生孢子链,孢子链由50-70个孢子组成,最初的孢子直接从孢子梗产生,或从1-2个孢子土面产生,孢子棒状,卵形椭圆形,大小约为22-31(25)X 9-13(11)UM,有4-5个横隔,2-3个比值隔或斜的隔膜。最初形成的幼孢子为狭卵圆形,有密集的、细小的疣突起物,这种密集的突起物致使在100倍显微镜下看不清孢子内部的横隔。菌丝通常无色或橄榄绿色,分隔,平直,菌丝细胞长约为宽的5倍左右,菌丝分枝初时为水平状分枝,顶端细长、尖。根据以上特征和KEISSLER 1912年建立的链格孢属的模式种ALTERMARIA ALTERNATA相对照,将这个菌株鉴定为链格孢属的链格孢。
以该菌株为出发菌株进行紫外诱变,经12代诱变得一形态变异菌株UV-012,再以UV-012为出发菌株继承诱变,得一产紫杉醇较稳定的单孢菌株,代号为ST-026。以上形态变异经5代傅代培养较稳定。根据植物命名法规命名为链格孢单孢变种,学名为Aternaria alernata var.monosporus,代号为ST-026-R,菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市中关村北一桥13号,保藏号为:CGMCC No.0899。
实施例3 种子培养
接种实施例2所得CGMCC No.0899冻干菌至装有100ml种子培养基(见表1)的250ml三角瓶中,于20~30℃,100-300rpm摇床培养24-28小时,即得待接种的菌种。
表1:种子培养基
成分 |
% |
葡萄糖黄豆饼粉花生饼粉MgSO4NaH2PO4无菌水调节pH值 |
20.50.20.010.05100ml7.0~7.2 |
实施4 摇瓶发酵
将实施例3所得种子按接种量占发酵生产培养基量的5-15%接种至发酵生产培养基(见表2)中,20~30℃,100-350rpm培养16天。
表2:生产培养基配方
成分 |
% |
葡萄糖黄豆饼粉花生饼粉MgSO4NaH2PO4无菌水调节PH值 |
1.52.00.010.030.02100ml7.8~8.0 |
将所得发酵液转移至200ml离心管中,离心10分钟(5000rpm,25℃),收集发酵菌体和发酵上清液。将所得发酵菌体于恒温箱中烘干(60℃,16小时),经粉碎机粉碎为菌粉,1克干菌粉加入丙酮10ml,浸泡振摇12小时(120rpm,25℃),得丙酮提取液,真空干燥得发酵浸膏。
将所得发酵上清液加入相同体积的氯仿,振摇萃取2小时,离心(8000rpm,10min),静置10分钟,吸取氯仿层,氯仿层减压干燥10分钟,得浸膏。
将前面所得物用流动相溶解后,溶液分别装入色谱柱硅胶(200~400目,柱径高(CM)5×40)中,流动相为1~5%乙醇/CH2Cl2,在中压下梯度洗脱,流速20~60ml/min,收集纯化产物,减压浓缩,得纯度约92%的紫杉醇初产品。
将所得紫杉醇初产品溶于甲醇中,加热至50℃,慢慢加入纯水,当紫杉醇晶体形成时,停止加水,将溶液缓慢降温至4℃,过滤。减压干燥,即得纯度为95%的紫杉醇。重复前述重结晶过程2次,过滤,减压干燥,即得纯度为99%的紫杉醇。
实施例5 摇瓶发酵
将实施例2所得菌种在斜面种子培养基PDA上培养。采用孢子直接接种的方法,将种龄7天的菌种按接种量2×106个孢子/100ml培养基,接种到培养基(含蔗糖50g/L,黄豆饼粉2.5g/L,酵母粉0.5g/L,硫酸镁0.3g/L,磷酸二氢钾0.35g/L,磷酸氢二钾0.56g/L,VB1 10mg/L,三氯化铁2mg/L,硫酸锰5mg/L,硫酸锌2.5mg/L,碘化钾0.7mg/L,硼酸1.4mg/L,pH6.8)中。接种时加入诱导子花生四烯酸(占培养基浓度0.01%)、硝酸铈铵(浓度0.02%)、高锰酸钾(浓度0.02%)。
装量为100ml/250ml三角瓶、培养温度为25℃、转速150rpm。接种后第4天加入前提物质0.005%苯甲酰胺、0.01%苯丙氨酸、0.04%乙酸钠。发酵周期为9天。按照实施例4的方法纯化产物。结果:菌体生物量为50g/L,目标产物紫杉醇的产量为202.3mg/L。
实施例6至9 摇瓶发酵
按照实施例5的方法进行摇瓶发酵,只是培养基分别为:
实施例6:蔗糖50g/L、黄豆饼粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙1.2g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8。
实施例7:葡萄糖10g/L、蔗糖30g/L、黄豆饼粉10g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、维生素B110mg/L、磷酸氢二钾0.56g/L、磷酸二氢钾0.35g/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8。
实施例8:蔗糖40g/L、黄豆饼粉5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁1g/L、磷酸氢二钾0.6g/L、酒石酸钾钠5g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8。
实施例9:葡萄糖5g/L、蔗糖20g/L、可溶性淀粉10g/L、黄豆饼粉3g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、维生素B110mg/L、磷酸氢二钾0.56g/L、磷酸二氢钾0.35g/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8。
接种时加入诱导子的量分别为:
实施例6:花生四烯酸0.005%、硝酸铈铵0.06%、高锰酸钾0.01%;
实施例7:甲基茉莉酮酸0.01%、硝酸铈铵0.006、高锰酸钾0.02%;
实施例8:花生四烯酸0.05%、柠檬酸铵0.005%、高锰酸钾0.008%;
实施例9:柠檬酸铵0.05%、硝酸铈铵0.02%。
接种后第4天加入的前提物质分别为:
实施例6:苯甲酰胺0.008%、苯丙氨酸0.02%、乙酸钠0.02%;
实施例7:苯丙氨酸0.007%、苯甲酸钠0.05%、乙酰胺0.01%;
实施例8:苯甲酰胺0.02%、乙酸钠0.03%、乙酰胺0.005%;
实施例9:苯丙氨酸0.002%、乙酸钠0.01%、乙酰胺0.09%。
实施例10 7L罐发酵
按照实施例3的方法,只是温度为25℃,150rpm、培养24小时,得到一级种子的菌丝体,采用菌丝体进罐方法,接种量10%,接种到7L发酵罐中的培养基(葡萄糖10g/L,蔗糖20g/L,黄豆饼粉2.5g/L,酵母粉0.5g/L,硫酸镁0.3g/L,磷酸二氢钾0.35g/L,磷酸氢二钾0.56g/L,VB1 10mg/L,三氯化铁2mg/L,硫酸锰5mg/L,硫酸锌2.5mg/L,碘化钾0.7mg/L,硼酸1.4mg/L,pH6.8)中。在接种同时加入诱导子:花生四烯酸(占培养基浓度0.01%)、硝酸铈铵(0.02%)、高锰酸钾(0.02%)。发酵过程中前期pH值自然(不用控制),菌体生长达平台期后24小时后,用2N的氢氧化钠溶液控制pH值在6.0~7.0之间。在接种后到菌体生长至平台前期通气量要求较大,例如控制溶氧值达30%以上,平台期后通气量降低,例如控制溶氧值达20%以下,有利于紫杉醇的合成。于接种后36小时用流加方法加入1%的蔗糖,持续24小时。于接种后第6天一次性加入2%的蔗糖和2%的麦芽糖。在发酵到96小时,一次性加入前体物质0.005%苯甲酰胺、0.01%苯丙氨酸、0.04%乙酸钠。发酵周期为9天。结果:终产物紫杉醇的产量为185mg/L。
实施例11 7L罐发酵
菌种为实施例2所得菌种用常规孢子培养基(大米、葡萄糖、琼脂)于23~29℃培养5~9天的菌种斜面,接种量为2×107个孢子/1L培养基。采用孢子直接进罐的方法,将所得孢子接种到7L发酵罐的培养基(葡萄糖10g/L、蔗糖20g/L、黄豆饼粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L硫酸镁0.3g/L、磷酸二氢钾0.35g/L、磷酸氢二钾0.56g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)中,接种时加入0.01%的乙酰胺。整个发酵过程用2N的氢氧化钠和2N的盐酸控制pH6.0~7.0,在接种后到生长平台后期通过调整通气量控制溶氧值在30%以上,在生长平台后期以后控制溶氧值在20%以下。并于接种后36小时,用流加的方法加入1%蔗糖,持续24小时;于接种后第6天流加1%的培养基,持续24小时,在发酵到生长平台后期加前体0.1%的乙酰胺。发酵周期为9天。结果:终产物紫杉醇产量为:185mg/L。
实施例12 7L罐发酵
按照实施例11的方法发酵,只是发酵培养基为:蔗糖50g/L、黄豆饼粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙3.0g/L、维生素B1 10mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8。接种时加入诱导子为:乙酰胺(占培养基浓度0.09%)、高锰酸钾(0.01%)、硝酸铈铵(0.01%)、花生四烯酸(0.005%)。发酵过程中用2N氢氧化钠和2N盐酸控制PH6.0~7.0之间。在接种后至生长平台后期,溶氧值控制在30%以上,平台后期以后控制溶氧值在20%以下,并于生长平台后期一次性加前体0.1%乙酰胺,发酵周期为9天。结果:终产物紫杉醇的产量为200mg/L。
实施例13 7L罐发酵
按照实施例3的方法培养种子,种子培养基为:葡萄糖20g/L、黄豆饼粉5g/L、花生饼粉2g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钠0.5g/L,pH6.8。种子于25℃,250rpm培养16小时。
采用常规的菌丝体进罐方法,将所得种子接种于7L发酵罐中,接种量为15%,发酵培养基为(蔗糖20g/L、黄豆饼粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙3.0g/L、维生素B1 10mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)。接种时加入诱导子:乙酰胺(占培养基浓度0.01%)、高锰酸钾(0.002%)、硝酸铈铵(0.005%)、花生四烯酸(0.005%)。发酵过程中用2N氢氧化钠和2N盐酸控制pH6.0~7.0之间。在接种后至生长平台后期,溶氧值控制在30%以上,平台后期以后控制溶氧值在20%以下。接种后36小时开始流加2%蔗糖,持续24小时,于96小时一次性加入前体0.1%乙酰胺,同时流加1%培养基,持续12小时。发酵周期为9天,结果:终产物紫杉醇的产量为:189mg/L。
实施例14 7L罐发酵
按照实施例13的方法进行7L罐发酵,只是接种时加入诱导子:高锰酸钾(0.02%)、硝酸铈铵(0.05%)、花生四烯酸(0.005%);接种后36小时开始流加2%蔗糖,持续24小时,于96小时一次性加入前体0.01%苯丙氨酸、0.04%苯甲酸钠,0.01%乙酰胺,同时流加1%的培养基,发酵周期为9天,结果:终产物紫杉醇的产量为:220mg/L。
实施例15 50L罐发酵
按照实施例3的方法培养种子,将所得一级种子接种到培养基(葡萄糖10g/L,蔗糖20g/L,黄豆饼粉2.5g/L,酵母粉0.5g/L,硫酸镁0.3g/L,磷酸二氢钾0.35g/L,磷酸氢二钾0.56g/L,VB1 10mg/L,三氯化铁2mg/L,硫酸锰5mg/L,硫酸锌2.5mg/L,碘化钾0.7mg/L,硼酸1.4mg/L,pH6.8)中。在接种同时加入诱导子:花生四烯酸(0.01%)、硝酸铈铵(0.05%)、高锰酸钾(0.02%)。发酵过程中前期pH自然(8.0)。于接种后36小时用流加方法加入1%的蔗糖和0.2%酵母粉,持续24小时。于接种后第6天一次性加入2%的蔗糖和2%的麦芽糖。在发酵到96小时,一次性加入前体物质0.005%苯甲酰胺、0.01%苯丙氨酸、0.04%乙酸钠。加完前体后,用2N的氢氧化钠溶液控制pH值在6.0~7.0之间。发酵周期为9天。在接种后到菌体生长至平台前期通气量要求较大,如控制溶氧值达30%以上,平台期后通气量降低,如控制溶氧值达20%以下,有利于紫杉醇的合成。结果终产物紫杉醇的产量为168mg/L。
实施例16 50L罐发酵
按照实施例15的方法进行50L罐发酵,只是有以下不同:
种子培养基为:葡萄糖20g/L、黄豆饼粉5g/L、花生饼粉2g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钠0.5g/L,pH6.8。种子于25℃,250rpm培养16小时。
采用常规的菌丝体进罐方法,将所得菌丝体接种到50L发酵罐中,接种量为15%,发酵培养基为(葡萄糖10g/L、蔗糖20g/L、黄豆饼粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙3.0g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)。接种时加入诱导子:乙酰胺(0.01%)、高锰酸钾(0.02%)、硝酸铈铵(0.05%)、花生四烯酸(0.005%);发酵过程中用2N氢氧化钠和2N盐酸控制pH6.0~7.0之间。在接种后至生长平台后期,溶氧值控制在30%以上,平台后期以后控制溶氧值在20%以下。接种后36小时开始流加2%蔗糖+0.1%酵母提取物,持续24小时,于96小时一次性加入前体0.1%乙酰胺,同时流加1%培养基,持续12小时。发酵周期为9天,结果:终产物紫杉醇的产量为:198mg/L。
实施例17 50L罐发酵
按照实施例15的方法进行50L罐发酵,只是有以下不同:
种子培养基为:葡萄糖10g/L、蔗糖30g/L、黄豆饼粉5g/L、花生饼粉2g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钠0.5g/L,pH6.8。种子于25℃,250rpm培养16小时。
采用常规的菌丝体进罐方法,将所得菌丝体接种到50L发酵罐中,接种量为15%,发酵培养基为(葡萄糖10g/L、蔗糖40g/L、黄豆饼粉5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙3.0g/L、维生素B1 10mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)。接种时加入诱导子:乙酰胺(0.01%)、高锰酸钾(0.02%)、硝酸铈铵(0.05%)、花生四烯酸(0.005%);发酵过程中用2N氢氧化钠和2N盐酸控制pH6.0~7.0之间。在接种后至生长平台后期,溶氧值控制在30%以上,平台后期以后控制溶氧值在20%以下。于96小时一次性加入前体0.1%乙酰胺,同时流加1%培养基,持续12小时。发酵周期为9天,结果:终产物紫杉醇的产量为:215mg/L。
实施例18 50L罐发酵
按照实施例15的方法进行50L罐发酵,只是有以下不同:
种子培养基为:葡萄糖10g/L、蔗糖30g/L、黄豆饼粉5g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钠0.5g/L,pH6.8,也可为常规种子培养基。种子于25℃,250rpm培养16小时。
采用常规的菌丝体进罐方法,将所得菌丝体接种到50L发酵罐中,接种量为15%,发酵培养基为(蔗糖50g/L、黄豆饼粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、碳酸钙3.0g/L、维生素B110mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)。接种时加入诱导子:乙酰胺(0.03%);发酵过程中用2N氢氧化钠和2N盐酸控制pH6.0~7.0之间。在接种后至生长平台后期,溶氧值控制在30%以上,平台后期以后控制溶氧值在20%以下。于96小时一次性加入前体0.1%乙酰胺,同时流加1%培养基,持续12小时。发酵周期为9天,结果:终产物紫杉醇的产量为:223mg/L。
实施例19 50L罐发酵
按照实施例15的方法进行50L罐发酵,只是有以下不同:
种子培养基为:葡萄糖20g/L、黄豆饼粉5g/L、花生饼粉2g/L、硫酸镁0.1g/L、磷酸二氢钠0.5g/L,pH6.8。种子于25℃,250rpm培养16小时。
采用常规的菌丝体进罐方法,将所得菌丝体接种到50L发酵罐中,接种量为15%,发酵培养基为(葡萄糖10g/L、蔗糖20g/L、黄豆饼粉2.5g/L、酵母提取物0.5g/L、硫酸镁0.06g/L、磷酸氢二钾0.56g/L、磷酸二氢钾0.35g/L、维生素B1 10mg/L、三氯化铁2mg/L、硫酸锰5mg/L、硫酸锌2.5mg/L、碘化钾0.7mg/L、硼酸1.4mg/L,pH6.8)。发酵过程中用2N氢氧化钠和2N盐酸控制pH6.0~7.0之间。在接种后至生长平台后期,溶氧值控制在30%以上,平台后期以后控制溶氧值在20%以下。接种后36小时开始流加2%蔗糖+0.1%酵母提取物,持续24小时,于96小时一次性加入前体0.01%苯丙氨酸、0.04%苯甲酸钠、0.05%乙酸钠,同时流加1%培养基,持续12小时。发酵周期为9天,结果:终产物紫杉醇的产量为:227mg/L。
实施例20至24 产物的分离和纯化
将实施例10至14所得发酵液用板框压滤机过滤,收集过滤出的发酵菌体和发酵上清液。将所得菌体分别通过自然吹干、60℃烘干、真空冷冻干燥、100℃烘干,分别得干燥菌体185、186、180、185、178g/7L,将干燥菌体粉碎,分别加入(菌丝体∶溶剂=1∶20)丙酮+乙酸乙酯(1∶1或2∶1)、丙酮、乙醇、甲醇、乙酸乙酯,分别提取24、26、30、30、25小时,减压旋转蒸发溶剂得浸膏。实施例20所得提取浸膏的TLC图见图4,HPLC图谱见图5(a)。由图可见样品中含有相当大含量的紫杉醇。
将前面过滤所得的发酵上清液加入相同体积的三氯甲烷或二氯甲烷、振摇萃取1~2小时,高速离心(8000rpm,10~30min),静置10分钟,分离出有机溶剂层,减压浓缩得浸膏。
将前面所得物用流动相溶解后,溶液分别装入色谱柱:硅胶或氧化铝(200~400目,柱径高(CM)5×40)中,流动相分别为:1%~10%乙醇/CH2Cl2或甲醇/CH2Cl2、1%~30%丙酮/CH2Cl2、在中压下梯度洗脱,流速20~60ml/min,收集纯化产物,减压浓缩,得纯度约92%的紫杉醇。
将所得纯度约92%的紫杉醇溶于甲醇中,加热至40~60℃,慢慢加入纯水,当紫杉醇晶体形成时,停止加水,将溶液缓慢降温至4℃~10℃,过滤。减压干燥,即得纯度为95%的紫杉醇。重复前述重结晶过程2至3次,过滤,减压干燥,即得纯度为99%的紫杉醇。
实施例25-26 产物的分离和纯化
将实施例15、16所得发酵液离心分离,收集发酵菌体和发酵上清液。将所得发酵菌体冷冻干燥,经粉碎机粉碎为菌粉,干菌粉加入丙酮+乙酸乙酯(1∶1或2∶1)中,浸泡振摇12小时,过滤得提取液,真空旋转蒸发得浸膏。
将所得发酵上清液分别加入相同体积的氯仿或二氯甲烷,振摇萃取1~2小时,高速离心后分离出有机溶剂层,减压旋转蒸发得浸膏。
将前面由菌体或发酵上清液所得物浸膏用流动相溶解后,溶液分别装入色谱柱:硅胶或氧化铝(200~400目,柱径高(CM)5×40)中,流动相分别为:1%~10%乙醇/CH2Cl2,在中压下梯度洗脱,流速20~60ml/min,收集纯化产物,减压干燥,得纯度约92%的紫杉醇。
将所得纯度约92%的紫杉醇溶于丙酮中,缓慢加入1.5~5倍体积的正己烷,当紫杉醇结晶出现时,溶液缓慢降温至4℃~9℃,过滤,重复前述重结晶过程2~4次,过滤,减压干燥,即得纯度为99%以上的紫杉醇。
实施例27
按照实施例25的方法,对实施例17至19所得物进行分离纯化,得紫杉醇纯品。
实施例28
按照实施例22-27的方法,对实施例12至18所得物进行分离纯化,只是在实施例12至18所得发酵液分离前,用1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH溶液慢慢滴入发酵液中,不断搅拌,调其pH分别为6.8(操作时避光进行),5.5,4.5(操作时避光进行),3.0,7.5(操作时避光进行),8.0,6.0(操作时避光进行)。得紫杉醇纯品。
实施例29 紫杉醇产物的鉴定
对实施例20至28所得紫杉醇进行紫外光谱、红外光谱、质谱、核磁共振分析,并与紫杉醇标准样品进行对比,结果见图6至图9。由图可见本发明方法制得的紫杉醇的谱图与紫杉醇标准样品(购自Sigma公司的Paclitaxel T1912)相同。
体外生物学活性分析测定:紫杉醇对乳腺癌细胞具有一定的杀伤作用。结果见图10。由图可见本发明实施例20至24所得紫杉醇对卵巢癌细胞的杀伤百分率与紫杉醇标准样品基本一致。