CN1187357C

CN1187357C - 齿梗孢素b1及提取方法和在抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN1187357C
Application number: CNB021007780A
Authority: CN
Inventors: 郭顺星; 于能江; 逯海燕; 林晨; 王春兰; 肖培根
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2005-02-02
Anticipated expiration: 2022-01-25
Also published as: CN1434047A

Abstract

齿梗孢素B1及提取方法和在抗肿瘤药物中的应用，主要包括该新化合物的来源菌齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)，该菌的发酵培养工艺，化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)的提取分离方法、结构和物理化学性质及对肿瘤细胞的抑制活性。结果显示该化合物抑制BEL-7402肝癌细胞的IC₅₀为0.35-0.75μg/ml，提示对其活性和作用机理作更深入的研究，有望从中找到抗癌或用于其它目的的有效新药物。

Description

齿梗孢素B1及提取方法和在抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)，具体地说是涉及菌生真菌来源的一新倍半萜内酯齿梗孢素B1；

本发明还涉及化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)的提取方法；

本发明还涉及化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)在制备治疗肿瘤细胞的药中的应用。

背景技术

对菌生真菌化学成分进行研究，可为寻找新结构的化合物提供一个新的研究领域，因为其与另外的真菌共生、加之特殊的生态环境可能会产生特殊的代谢产物。真菌具有生长速度快，不受季节限制，可以工业化生产的优点，所以，研究真菌的次生代谢，又可以为生产某一物质提供技术条件。同时，真菌培养条件容易实现人工化，这为保持生产的重现性和大规模生产提供了可能。

肿瘤严重威胁着人类的生命健康，世界各国都投入大量人力物力开发研制新的高效抗肿瘤药。化学治疗在肿瘤治疗中起着不可替代的作用，寻找高效低毒的抗肿瘤化疗药是许多药学工作者的追求。

从动物组织中可以提取获得结构独特而作用机理新颖的抗肿瘤化合物，但受来源限制；从植物中可发现和获得有应用价值的天然产物，但易破坏自然植被和生态环境。如前所述，真菌具有生长速度快，不受季节限制，可以工业化生产的优点，同时，真菌培养条件容易实现人工化，这为保持生产的重现性和大规模生产提供了可能。利用发酵法从真菌中获得原料药，还具有大规模发酵生产和容易控制质量等特点。过去从真菌发酵产物中开发的抗肿瘤药大多是一些多糖类化合物，它们通过提高人体免疫力来抗肿瘤。自然界存在的真菌种类繁多，从这些真菌的发酵产物中是否能寻找到作用机理新颖的活性成分，是开发抗肿瘤新药或应用于其它新药研制的基础工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种化合物齿梗孢素B1(calcarisporinB1)。

本发明的又一目的在于提供化合物齿梗孢素B1(calcarisporinB1)的提取方法。

本发明的再一目的在于提供化合物齿梗孢素B1(calcarisporinB1)在制备治疗肿瘤细胞的药中的应用。

用来实现本发明目的的化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)由野生灵芝(Ganoderma lucidum)子实体中分离得到，经培养鉴定为齿梗孢属齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)。其于2002年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为：0686。

化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)具有以下理化性质：

(1)形状：白色无定形粉末

(2)熔点：320℃

(3)分子量：570

(4)分子式：C₃₁H₃₈O₁₀

(5)化学结构式：

提取上述化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)的方法，其主要步骤为(本发明中除有特殊说明外，所述比例均为重量百分比)：

(1)用齿梗孢属齿梗孢霉采用液体发酵培养，其培养基配方：葡萄糖1-3％，KH₂PO₄ 0.1-0.5％，K₂HPO₄ 0.08-0.3％，MgSO₄ 0.08-0.3％；天然物为麦麸1-5％(煮汁)或土豆10-25％(煮汁)；培养条件：培养基pH4-7；三角瓶摇床培养瓶装量20-60％；转速100-120转/分钟；温度：18-25℃；培养6-10天，以7天为佳；发酵罐培养接种量5-10％，其余参数同上；发酵产物过滤，得到菌丝体和发酵液两部分；

(2)步骤(1)得到的菌丝体部分按下述方法提取：

(a)用清水洗2-3遍后，挤掉大部分水分，常温下凉干或80℃以下烘干；

(b)菌丝体用甲醇热提取4次，提取物减压浓缩，水浴挥掉溶剂，得到浸膏；

(c)浸膏用蒸馏水分散，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，各萃取液浓缩后得到石油醚和二氯甲烷两个萃取段；

其中石油醚萃取段经100-200目硅胶柱(流动相为石油醚至石油醚-乙酸乙酯(1∶1)梯度洗脱)分离和重结晶纯化，得到化合物齿梗孢素B1；

其中二氯甲烷萃取段经100-200目硅胶柱(流动相为氯仿至氯仿-甲醇(8∶2)梯度洗脱)分离和重结晶纯化，得到化合物齿梗孢属B1，该化合物在齿梗孢霉菌丝体中的含量为0.3％-0.8％；

(3)步骤(1)得到的发酵液部分按下述方法提取：

(a)经常压热浓缩或减压浓缩较小体积，加入95％乙醇或无水乙醇进行醇沉，使得溶液中含有70％-80％的乙醇，震摇或剧烈搅拌后放置过夜，收集上清液，沉淀部分加入95％乙醇或无水乙醇如前操作，反复3-5次，收集上清液后减压浓缩，浓缩物置于水浴锅上挥掉溶剂，得到所需浸膏；

(b)浸膏用蒸馏水分散后，用乙酸乙酯萃取；萃取液浓缩后，经100-200目硅胶柱(流动相为石油醚至石油醚∶乙酸乙酯＝7∶3梯度洗脱)分离和重结晶纯化，可得到化合物齿梗孢素B1。

本发明提供的化合物齿梗孢素B1对肿瘤细胞的半数抑制浓度IC₅₀均低于0.9μg/ml，其中BEL-7402肝癌细胞系对该化合物最敏感，其IC₅₀为0.35-0.75μg/ml。

具体实施方式

通过下面的描述，将有助于进一步理解本发明的实质内容。

本发明所述的化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)具有以下物理、化学性质：

(1)形状：白色无定形粉末

(2)熔点：320℃

(3)分子量：570

(4)分子式：C₃₁H₃₈O₁₀

(5)比旋度：[α]²D⁰＝+70.0°(C＝0.95，CHCl₃)。

(6)紫外吸收光谱：

λ_{\max}^{MeOH} (\log ϵ) = 246.0 nm (4.23)

210.0nm(4.45)

(7)红外吸收光谱：v_max ^KBrcm^-1

2970，1725，1705，1650，1600，1430，1370，1240，1223，1188，1158，1120，1072，998，970

HREI-MS m/z：570.2452(calcd.for C₃₁H₃₈O₁₀，570.2465)

TOF-MS m/z：593.67(M+Na⁺)，609.63(M+K⁺)。

EI-MS m/z(％)：526，510，466，388(5)，264(4)，247(5)，220(3)，182(3)，161(5)，137(12)，121(11)，95(8)，82(100)。

(8)¹H-核磁共振谱：(见表1)

表1：化合物calcarisporin B1的NMR数据(400MHz for ¹HNMR and 100MHz

for ¹³CNMR in CDCl₃)

Position ¹HNMR(J in Hz) ¹³CNMR COSY HMBC

correlation

2 3.83(1H，d，5.0) 78.9d H-3b C-4，C-5，C-11，C-

3a 2.48(1H，dd，8.4，15.4) 34.6t H-3b，H-4 12

3b 2.20(1H，m) C-2，C-5，C-12

4 5.90(1H，dd，8.4，4.5) 73.3d H-3a，H-3b

5 48.9s C-12

6 42.0s

7 2.20(2H，m) 26.2t

8 5.19(1H，d，4.3) 68.6d H-7，H-16

9 136.3s C-6，C-9

10 5.69(1H，br.d，5.5) 123.9d H-11，H-16

11 3.75(1H，d，5.5) 67.1d H-10，H-16 C-6，C-8，C-16

12 65.2s C-7.C-9，C-10

13 3.10，2.83(2H，AB，4.0) 47.7t

14 0.83(3H，s) 7.1q

15 4.35，4.39(2H，AB，12.5) 64.3t C-4，C-5，C-6，C-12

16 1.76(3H，s) 20.3q H-8，H-10，H-11 C-5，C-7

1’ 166.1s C-8，C-9，C-10

2’ 5.63(1H，s) 118.5d H-4’a，H-12’

3’ 155.0s C-4’，C-12’

4’a 2.65(1H，dd，12.4，3.3) 47.6t H-2’，H-5’

4’b 2.20(1H，m) C-2’，C-3’，C-5’

5’ 5.52(1H，dd，8.6，3.3) 100.6d H-4’

6’ 4.06(1H，dd，8.6，2.6) 81.9d H-7’，H-8’，H-13’ C-4’

7’ 5.95(1H，dd，2.6，15.2) 134.8d H-6’，H-8’ C-7’，C-8’，C-13’

8’ 7.65(1H，dd，15.2，11.3) 126.0d H-6’，H-7’，H-9’， C-6’，C-9’

H-10’ C-6’

9’ 6.56(1H，dd，11.3，11.3) 143.0d H-8’，H-10’

10’ 5.79(1H，d，11.3) 118.3d H-8’，H-9’ C-7’，C-11’

11’ 165.7s C-8’

12’ 2.27(3H，s) 18.1q H-2’

13’ 3.67(1H，dq，8.6，6.0) 76.5d H-6’，H-14’ C-4’

14’ 1.34(3H，d，6.0) 16.3q H-13’

8-Ac 1.92(3H，s) 20.8q C-6’，C-13’

170.8s

(9)推定化学结构式：

经以上物理方法和波谱数据测定Calcarisporin B1的结构为8α-acetoxy roridin H。

本发明所述的提取方法为：

1、采用齿梗孢霉液体发酵培养方法；

培养基配方：葡萄糖1-3％，KH₂PO₄ 0.1％-0.5％，K₂HPO₄0.08％-0.3％，MgSO₄ 0.08％-0.3％，天然物：麦麸1％-5％(煮汁)或土豆10-25％(煮汁)。

培养条件：培养基pH4-7；三角瓶摇床培养瓶装量20-60％；转速100-120转/分钟；温度：18-25℃；培养6-10天收获，以7天收获为佳。发酵罐培养接种量5-10％，其余参数同上。

2、化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)的提取方法

发酵产物用双层尼龙布过滤得到菌丝体和发酵液两部分。

(1)菌丝体中齿梗孢素B1的提取方法

菌丝体部分用清水洗2-3遍后，挤掉大部分水分，常温下凉干或80℃以下烘干。菌丝体用甲醇热提取4次，提取物减压浓缩后，置于搪瓷盘中，水浴挥掉溶剂，得到所需浸膏。浸膏用蒸馏水分散后，依次用石油醚和二氯甲烷萃取，各萃取液浓缩后得到石油醚和二氯甲烷两个萃取段。石油醚萃取段经100-200目硅胶柱(流动相为石油醚至石油醚-乙酸乙酯(1∶1)梯度洗脱)分离和重结晶纯化，得到calcarisporin B1。二氯甲烷萃取段经100-200目硅胶柱(流动相为氯仿至氯仿-甲醇(8∶2)梯度洗脱)分离和重结晶纯化，可得到calcarisporin B1，该化合物在齿梗孢霉菌丝体中的含量为0.3％-0.8％。

(2)发酵液中齿梗孢素B1的提取方法

发酵液部分常压热浓缩或减压浓缩至较小体积后，加入95％乙醇或无水乙醇进行醇沉，使得溶液中含有70％-80％的乙醇，震摇或剧烈搅拌后放置分层，收集上清液，沉淀部分加入95％乙醇或无水乙醇如前操作，反复3-5次，收集上清液后减压浓缩，浓缩物置于搪瓷盘中，搪瓷盘置于水浴锅上，水浴挥掉溶剂，得到所需浸膏。浸膏用蒸馏水分散后，用乙酸乙酯萃取。萃取液浓缩后，经100-200目硅胶柱(流动相为石油醚至石油醚∶乙酸乙酯＝7∶3梯度洗脱)分离和重结晶纯化，可得到calcarisporin B1。

本发明所述的齿梗孢素B1抑制肿瘤细胞活性方法为：

本发明提供的化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)的抑制肿瘤细胞活性采用MTr法，取处于对数生长期的BEL-7402、HCT-8、SPC-A-1、EC-109、GLC-82癌细胞系，用RPMI1640培养基稀释为30,000/ml，按3,000/100μl/孔将上述癌细胞分别种入96孔板。在37℃、含5％CO₂条件下培养24小时后加样品化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)，设0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μg/ml5个浓度，同时设空白对照组和对照组，每组设3个平行孔。在37℃、含5％CO₂条件下培养96小时后，弃去孔中培养液，加用无血清RPMI1640稀释10倍的MTT(0.5mg/ml)150μl/孔，在37℃、含5％CO₂条件下培养4h，弃去MTT液，加DMSO 150μl/孔溶解甲肷，酶标仪检测OD₅₇₀。按抑制率＝(给药组平均OD值-空白对照组平均OD值)/(对照组平均OD值-空白对照组平均OD值)×100％计算化合物齿梗孢素B1对几种癌细胞的生长抑制率，并通过浓度—抑制率曲线求IC₅₀。

结果显示，当样品作用96小时时，化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)对BEL-7402、HCT-8、SPC-A-1、EC-109、GLC-82癌细胞生长抑制作用的半数抑制浓度IC₅₀分别为0.4、1.7、4.7、5.6、8.7μg/ml，均明显低于20μg/ml，可见化合物齿梗孢素B1对肿瘤细胞具有明显的抑制作用。以浓度对抑制率作对数曲线，求得IC₅₀，结果表明：BEL-7402肝癌细胞系对齿梗孢素B1最敏感，其IC₅₀为0.4μg/ml，HCT-8结肠癌细胞系对齿梗孢素B1也很敏感，其IC₅₀为1.7μg/ml；SPC-A-1肺腺癌细胞系和EC-109食管癌细胞系对齿梗孢素B1较敏感，IC₅₀分别为4.7μg/ml和5.6μg/ml；GLC-82肺腺癌细胞系对齿梗孢素B1最不敏感，其IC₅₀为8.7μg/ml。

Claims

1、一种化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)，具有以下理化性质：

(1)形状：白色无定形粉末

(2)熔点：320℃

(3)分子量：570

(4)分子式：C₃₁H₃₈O₁₀

(5)化学结构式：

2、一种提取化合物齿梗孢素B1(calcarisporin B1)的方法，其主要步骤为(所述的比例均为重量百分比)：

(1)将由野生灵芝(Ganoderma lucidum)子实体中分离得到的齿梗孢属齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)采用液体发酵培养；其培养基配方为葡萄糖1-3％，KH₂PO₄ 0.1-0.5％，K₂HPO₄ 0.08-0.3％，MgSO₄ 0.08-0.3％，天然物为麦麸1-5％(煮汁)或土豆10-25％(煮汁)；培养条件：培养基pH4-7；三角瓶摇床培养瓶装量20-60％；转速100-120转/分钟；18-25℃培养6-10天；发酵罐培养接种量5-10％，其余参数同上；发酵产物过滤，得到菌丝体和发酵液两部分；

(2)步骤(1)得到的菌丝体部分

(b)菌丝体用甲醇热提取数次，提取物减压浓缩，水浴挥掉溶剂，得到浸膏；

其中二氯甲烷萃取段经100-200目硅胶柱(流动相为氯仿至氯仿-甲醇(8∶2)梯度洗脱)分离和重结晶纯化，得到化合物齿梗孢素B1，该化合物在齿梗孢霉菌丝体中的含量为0.3％-0.8％；

(3)步骤(1)得到的发酵液部分

(a)经常压热浓缩或减压浓缩到较小体积后，加入95％乙醇或无水乙醇进行醇沉，使得溶液中含有70-80％的乙醇，震摇或剧烈搅拌后放置分层，收集上清液，沉淀部分加入95％乙醇或无水乙醇如前操作，反复数次，收集上清液后减压浓缩，浓缩物置于水浴锅上挥掉溶剂，得到所需浸膏；

(b)浸膏用蒸馏水分散后，用乙酸乙酯萃取；萃取液浓缩后，经100-200目硅胶柱(流动相为石油醚至石油醚∶乙酸乙酯＝7∶3梯度洗脱)分离和重结晶纯化，得到化合物齿梗孢素B1。

3、如权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述培养时间为7天。

4、如权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述菌丝体用甲醇热提取次数为4次。

5、如权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述发酵液浓缩部分用95％乙醇或无水乙醇提取次数为3-5次。

6、化合物齿梗孢素B1在制备抑制肿瘤的药物中的应用。