CN103396979B - 一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，所述方法包括如下步骤：1）将活化后的硅藻异养培养3～8天，使其处于对数生长期；2）将步骤1）中处于对数生长期的硅藻培养液作为种子液，按5%～50%体积接种量接入含有异养培养基（培养基Ⅰ）的异养培养容器中进行异养培养，异养培养4～12天，培养温度20～34℃；步骤2）所述异养培养基（培养基Ⅰ）中添加有番茄提取物。本发明的培养方法可提高硅藻生物量浓度，提高并稳定藻体中岩藻黄素含量，以提供一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法。

Description

一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法

技术领域

本发明涉及硅藻培养方法，属生物工程领域，特别的，涉及一种可有效提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法。

背景技术

岩藻黄素（Fucoxanthin，CAS登记号：3351-86-8），又名墨角藻黄素，是广泛存在于褐藻（Phaeophyta）和硅藻（Bacillariophyceae）等棕褐色藻类中的光合色素，是类胡萝卜素的一种，具有很强的抗氧化性。其分子式为C₄₂H₅₈O₆，化学结构式为：

国内外学者近年来研究发现，岩藻黄素具有清除自由基、抗癌、调节血压、抗肥胖和抗过敏等生物学活性，尤其在抗肿瘤和减肥两大方面具有出色的功效（来自文献Mar.Drugs.,2011,9:1806-1828）。已有的研究证明，岩藻黄素对皮肤癌、结肠癌、白血病、前列腺癌、肝癌等多种癌症具有抑制作用，同时它还可能具有抗肿瘤血管生成的功效。细胞实验和动物实验均证明，岩藻黄素对以上多种肿瘤具有较好的抑制活性，有望应用于人类肿瘤的治疗和预防，由此成为抗癌新药的来源。减肥是岩藻黄素又一大功效。岩藻黄素可抑制白色脂肪组织重量增加，达到有效预防或者降低肥胖程度的效果。小范围人群（28人）的临床实验证明，当口服单剂量为2～6mg/天时，均可减轻体重，并随着服用时间的延长而表现持续的减重效果，并且未表现出不良反应（专利文献，申请号200810224474.9）。岩藻黄素减肥的作用机理为强化脂肪的代谢，无需节食和剧烈运动、无反弹，与常见的食欲抑制剂型减肥药物相比具有巨大的优势。

目前，岩藻黄素多从海带、裙带菜、墨角藻、鹿角菜、羊栖菜等大型褐藻中提取，但由于褐藻细胞壁厚、多糖类物质含量高、破碎困难等因素给岩藻黄素的提取带来诸多困难、提高了生产成本。由于褐藻通常生长于自然海域，藻体洁净度差，附着杂质多，提取获得的成份中重金属含量高，尤其是岩藻黄素含量低（海带中<100μg/g鲜藻），大大增加了提取成本。

已有研究发现硅藻中都含有岩藻黄素，光自养条件下，硅藻干藻粉中岩藻黄素含量>10mg/g（来自文献Mar.Drugs.,2011,9:1806-1828；Appl Biochem Biotechnol,2012,166:1843–1855），但利用现有的规模化光养培养技术生产硅藻存在单位面积产率低、生产稳定性差等问题。本发明人在前期的研究中发现，在15～20cm培养深度的生产型跑道池（工作面积>160m²）中进行三角褐指藻、牟氏角毛藻等硅藻的光自养培养，在最优生产条件下，硅藻生物量产率仅为0.02～0.03g/L/天，最大产率仅为0.005mg/L/天左右，且硅藻的产率和岩藻黄素含量受天气（主要是温度、光强、昼夜）影响非常大。

已有研究发现硅藻中的部分属如菱形藻（Nitzschia）、舟形藻属(Navicula)、筒柱藻（Cylindrotheca）和小环藻（Cyclotella）等属种具有异养生长特性，可通过发酵培养的方式实现生物量快速增长（引自文献：J.Appl.Phycol.1996,8:59–64；J Biosci.Bioeng.,2010,109(3);235–239），即高密度培养。然而，发明人前期实验发现，采用常规异养培养技术对硅藻进行单纯异养培养所获得的硅藻中岩藻黄素含量较低，干粉中岩藻黄素含量一般在7～8mg/g，硅藻中岩藻环素产率不够理想，有必要进一步改进现有培养技术，进一步提高硅藻中岩藻黄素含量及产率，降低生产成本。

本发明旨在提供一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，其目的是获得一种优质的、可用于生产岩藻黄素的硅藻原料。

发明内容

本发明的目的在于弥补现有技术的不足，通过提高硅藻生物量浓度，提高并稳定藻体中岩藻黄素含量，以提供一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法。

本发明为达到其目的所采用的技术方案如下：一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，所述方法包括如下步骤：

一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，所述方法包括如下步骤：

1）将活化后的硅藻异养培养3～8天，使其处于对数生长期；

2）将步骤1）中处于对数生长期的硅藻培养液作为种子液，按5%～50%体积接种量接入含有异养培养基（培养基Ⅰ）的异养培养容器中进行异养培养，异养培养4～12天，培养温度20～34℃；

步骤2）所述异养培养基（培养基Ⅰ）中添加有番茄提取物。所述番茄提取物指从番茄或番茄汁中提取的含有番茄红素的组分。异养培养基（培养基Ⅰ）中所添加番茄提取物的量以使培养基Ⅰ中番茄红素浓度达到0.5±0.2μg/L为准。

番茄提取物采用现有的制备方法即可获得，具体制备过程可为：市售番茄洗净后，不加水榨汁，抽滤获得的番茄汁进行冷冻干燥。称取0.25g番茄汁干粉，加入5～10ml丙酮，在振荡器上振荡混匀后，离心，取上清液，氮气吹干后用DMSO定容至50ml，4℃冷藏备用。提取物中总类胡萝卜素的含量为0.826μg/ml，番茄红素含量占72.54％，即每0.8ml番茄提取物约含0.5μg番茄红素。

进一步的，步骤2中所用的异养培养基（培养基Ⅰ）包括如下组分：NaCl浓度为7.5～35g/L的盐水；相对于1L的盐水，培养基Ⅰ中还含有0.2～1.0g MgSO₄·7H₂O、25～100mgKH₂PO₄、20～40mg H₃BO₃、10～30mg FeSO₄·7H₂O、2～8mg MnCl₂·4H₂O、0.1～0.5mg ZnCl₂、0.04～0.15mg CoCl₂·6H₂O、0.01～0.05mg Na₂MoO₄·2H₂O、0.2～0.8g Na₂SiO₃·5H₂O、与含有3.33～20mmol氮元素的氮源（是指1L盐水中所含氮源的量使培养基Ⅰ中氮元素达到3.33～20mmol）、与含有0.17～0.83mol碳元素的有机碳源（是指1L盐水中所含有机碳源的量使培养基Ⅰ中碳元素达到0.17～0.83mol），同时向异养培养基（培养基Ⅰ）中添加番茄提取物使得培养基Ⅰ中番茄红素浓度为0.5±0.2μg/L。所述氮源选自无机氮源或有机氮源；其中无机氮源可为硝酸钾、硝酸钠、碳酸氢铵、氨水，有机氮源可为尿素、各种氨基酸及其组合、蛋白水解物、酵母提取物等等，也可为上述各种具体氮源物质中的两种或两种以上的组合。所述有机碳源，包括但不限于以下物质：葡萄糖、淀粉水解物、淀粉糖、木质纤维素水解物、蔗糖、果糖、甘油、各种氨基酸及其组合等等。

具体的，步骤2中所用的异养培养基（培养基Ⅰ）包括如下组分：NaCl浓度为22.5g/L的盐水；相对于1L的盐水，培养基Ⅰ中还含有0.66g MgSO₄·7H₂O、50.5mg KH₂PO₄、34mg H₃BO₃、20mg FeSO₄·7H₂O、4.3mg MnCl₂·4H₂O、0.3mg ZnCl₂、0.13mg CoCl₂·6H₂O、0.03mgNa₂MoO₄·2H₂O、0.48g Na₂SiO₃·5H₂O、0.3g尿素、10～20g葡萄糖；并添加番茄提取物，使培养基Ⅰ中的番茄红素终浓度为0.5±0.2μg/L。优选的，步骤2中所用的异养培养基（培养基Ⅰ）中，相对于1L盐水，含有15g葡萄糖，采用这一葡萄糖用量，干藻粉中岩藻黄素含量可达到9.20～9.43mg/g的水平，最大产率约为3.5mg/L/天。

作为一种优选方案，所述方法还具有将步骤2）培养获得的发酵液进行光诱导处理的步骤。光诱导处理的步骤优选为：将步骤2）异养培养获得的发酵液用光诱导培养基（培养基Ⅱ）稀释至生物量干重浓度为0.1～3.5g/L，放置于光生物反应器中，在光强为2000～30000lx的光照下进行光诱导处理，处理时间t为：0小时＜t≤120小时。考虑到产物积累和诱导培养成本等因素，优选的光诱导处理时间t为36～60小时。光诱导处理可促使硅藻细胞中岩藻黄素进一步积累，其干藻粉中岩藻黄素含量可提高至12.94mg/g以上的水平，甚至可达到20.01mg/g。与无光诱导的对照相比，其提高幅度均可达到37.22%以上的水平，最大增幅为112.20％。不同的稀释处理下，岩藻黄素的最大产率可超过5.14mg/L/天，甚至达到7.77mg/L/天，最大产率增幅均超过46.86％，最高增幅数据为122.0％。

进一步的，光诱导处理中所用的光为含有波长380～720nm之间波段的光，可为包含了380～720nm波段的太阳光和各种人工光源产生光。所述的人工光源指能够发光的人工装置，包括白炽灯、荧光灯、LED灯等。具体的，光生物反应器中进行光照可采用包含有380～720nm之间所有波长的太阳光、白炽灯、荧光灯或LED灯产生的光。所述的光生物反应器，指可利用太阳光或人工光源的生物培养容器，包括但不限于以下种类：开放式跑道池、开放式圆池、平板式光生物反应器、管道式光生物反应器、气升式光生物反应器等。

进一步的，光诱导处理步骤中所用的光诱导培养基（培养基Ⅱ）包含的组分及含量范围如下：NaCl浓度为7.5～35g/L的盐水；相对于1L的盐水，培养基中还含有0.2～1.0gMgSO₄·7H₂O、25～100mg KH₂PO₄、20～40mg H₃BO₃、10～30mg FeSO₄·7H₂O、2～8mgMnCl₂·4H₂O、0.1～0.5mg ZnCl₂、0.04～0.15mg CoCl₂·6H₂O、0.01～0.05mg Na₂MoO₄·2H₂O、与含3.33mmol～20mmol氮元素的氮源（是指1L盐水中所含氮源的量使培养基Ⅱ中氮元素达到3.33～20mmol）。所述氮源选自无机氮源或有机氮源或无机氮源和有机氮源的组合；其中无机氮源可为硝酸钾、硝酸钠、碳酸氢铵、氨水，有机氮源可为尿素、各种氨基酸及其组合、蛋白水解物、酵母提取物等等。

具体的，光诱导处理步骤中所用的光诱导培养基（培养基Ⅱ）包括如下组分：NaCl浓度为15g/L的盐水，相对于1L的盐水，培养基中还含有0.45g MgSO₄·7H₂O、40mg KH₂PO₄、25mg H₃BO₃、15mg FeSO₄·7H₂O、2.1mg MnCl₂·4H₂O、0.2mg ZnCl₂、0.07mg CoCl₂·6H₂O、0.02mg Na₂MoO₄·2H₂O、0.3g尿素。

进一步优选的，在光诱导处理步骤中，将步骤2）的发酵液用光诱导培养基（培养基Ⅱ）稀释至0.5～1.6g/L（生物量干重浓度）。采用这一优选的光诱导条件，收获的硅藻干藻粉中岩藻黄素含量可达15.23mg/g以上，与无光诱导的对照相比，其提高幅度可达到61.51%。最大岩藻黄素产率可达到6.31mg/L/天以上，产率增幅达到80％以上。

更优选的，在光诱导处理步骤中，将步骤2）的发酵液用光诱导培养基（培养基Ⅱ）稀释至～0.5g/L（生物量干重浓度），以平板式光生物反应器为光诱导培养容器，并利用太阳光作为诱导光源，控制最大光照为≤30000lx。采用这一优选的光诱导条件，收获的硅藻干藻粉中岩藻黄素含量可达19.77～20.01mg/g，与无光诱导的对照相比，其提高幅度可达到114.89%以上，最大岩藻黄素产率可达到7.77mg/L/天，产率增幅达到122.0％。

优选的，步骤2）进行异养培养采用的是摇瓶培养：将种子液按5％～50％体积接种量接入发酵培养基（培养基Ⅰ）中，摇瓶放置于恒温摇床中，摇床转速100～180rpm，培养温度20℃～34℃，培养4～12天。

更为优选的，步骤2）进行异养培养采用的是发酵罐分批培养：将种子液按5％～50％体积接种量接入发酵培养基（培养基Ⅰ）中，通过控制通气量保持发酵罐中的溶氧饱和度20％～100％，通气过程中搅拌速度与溶氧饱和度相偶联，起始转速控制在60～240rpm，罐中的pH控制在6.5～9.5，温度控制20～34℃。培养4～12天。

步骤2）所述的种子液按5％～50％体积接种量进行接种，此接种比为工业发酵中常用的接种比数据，较高的接种比可以降低发酵生产所耗时间，但增加了前期种子液培养的负担，全过程的生产周期和生产成本并不能显著减小。较为优选的体积接种量为10％～20％。

本发明所述硅藻（diatoms）指的是分类学中定义为硅藻门（Bacillariophyta）所含的能够利用有机碳源进行异养生长的硅藻各个藻种或藻株；可选自但不限于小环藻属（Cyclotella）、菱形藻属（Nitzschia）、舟形藻属（Navicula）、筒柱藻属(Cylindrotheca)等属种；本发明可优选用小环藻。

本发明的硅藻培养方法生产的硅藻，干藻粉中岩藻黄素含量可达到>8.15mg/g，产率可达到大于1.25mg/L/天的水平；在优选的发酵培养条件下，干藻粉中岩藻黄素含量均>9.2mg/g，产率>3.5mg/L/天；，在优选的光诱导培养条件下，岩藻黄素含量为15.23～22.01mg/g，相应的最大产率>6.32mg/L/天，最高可达7.77mg/L/天。同时，藻体中还含有二十碳五烯酸（EPA），质量占干藻粉质量的2.5～3.5%。

本发明所提供的技术方案具有如下有益效果：

（1）采用本发明提供的方法培养的硅藻非常适合用于生产岩藻黄素。首先，硅藻岩藻黄素的含量要远高于褐藻类，硅藻细胞更容易破碎、多糖含量低，因而为岩藻黄素的提取纯化提供了一种含量高、易加工、成本低的优质原料。在产品质量控制上，通过本发明的培养方法获得的硅藻，可有效保证原料藻体中目标产物含量恒定，避免了因原料含量参差不齐而频繁调整提取工艺的麻烦，能稳定控制生产过程，同时从源头上避免了重金属超标等质量隐患，大大提高了岩藻黄素的生产效率，并有效保障产品质量。

（2）在异养培养阶段，在培养基中添加番茄提取物作为硅藻细胞中岩藻黄素的合成促进剂，这在提高异养硅藻中岩藻黄素含量及产率的技术中尚属首次。番茄提取物提供了大量合成岩藻黄素的多种前体物质（主要是番茄红素和β-胡箩卜素）。发明人在前期的研究中发现，这些前体物质可在硅藻细胞中直接转化为岩藻黄素，使得岩藻黄素含量显著提高了22.34％。

（3）在生产方式上，本发明优选采用“异养发酵－光诱导”培养方法，不仅可在异养发酵阶段快速获得大量硅藻生物量（最大生物量干重体积产率>0.5g/L/天），同时在光诱导阶段可显著提高藻体中岩藻黄素的含量（增幅为37.22～112.0％），从而进一步提高岩藻黄素的产率（增幅为46.86～122.0％）。较之单独光自养培养方式，本发明的发酵生产具有生物量浓度高、采收成本低、不受气候和地域限制等优势，易于工业放大。

（4）本发明培养方法获得的硅藻中还含有大量多不饱和脂肪酸，尤其是EPA含量丰富。本发明的各个实施例中对干藻粉的检测发现，EPA含量普遍在2.5～3.5％之间，甚至超过3.5％。因此，本发明生产的藻体有可能作为同时生产岩藻黄素和EPA这两种高附加值产品的优质原料。

全文中所述的硅藻中岩藻黄素产率是指：单位时间（天）内单位培养体积（L）中岩藻黄素的产量（mg），直观描述为一个培养时期内，1L硅藻发酵液中，平均1天岩藻黄素产量，单位为mg/L/天。

附图说明

图1是小环藻中色素组成的HPLC图谱（监测波长为450nm，峰1为岩藻黄素）；

图2是图1中峰1对应的岩藻黄素的特征吸收光谱图；

图3是实施例1～5中小环藻在不同葡萄糖浓度下摇瓶异养培养8天，生物量干重浓度变化趋势图；图中的G-X是指葡萄糖浓度，X的具体数值代表葡萄糖的浓度值（单位g/L）；

图4是实施例1～5中小环藻在不同葡萄糖浓度下摇瓶异养培养8天，最后三天干藻粉中岩藻黄素（Fx）含量变化情况；图中G-5、G-10、G-15、G-20、G-25分别代表葡萄糖浓度5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L的实验组。

图5是实施例6中小环藻在5L发酵罐中分批培养9天生物量干重浓度和培养液中葡萄糖浓度的变化趋势图；

图6是实施例6中小环藻在发酵罐分批培养条件下细胞内岩藻黄素（Fx）含量的变化；

图7是实施例7～12中小环藻在不同初始生物量干重浓度下光诱导处理后的生物量干重浓度变化，图7中的字母A～F分别对应于实施例7～12；

图8是实施例7～12中，小环藻在不同初始生物量干重浓度下，光诱导后的岩藻黄素(Fx)含量变化，图8中的字母A～F分别对应于实施例7～12；

图9是实施例13和14中，小环藻在不同光照强度下进行光诱导处理时的生物量变化，图9中A-2000lx指光照强度为2000±500lx对应实施例13，B-8000lx指光照强度为8000±1000lx对应实施例14；

图10是实施例15中，小环藻在室外以玻璃缸为培养容器，以太阳光作为诱导光，进行光诱导处理时的生物量变化，和岩藻黄素（Fx）含量变化；

具体实施方式

本发明中，各个实施例选用的藻种均为小环藻（Cyclotella cryptica CCMP332，购自美国Provasoli-Guillard海洋藻类与微生物国家中心：Provasoli-Guillard National Center for MarineAlgae and Microbiota，NCMA）。

实施例1：

按如下步骤培养小环藻：

（1）以250ml锥形瓶为培养容器，工作体积为120ml。将活化后的小环藻在摇瓶中异养培养，7天后获得处于对数生长期的小环藻种子液；

（2）按10％（v/v）接种量接入新配制的培养基Ⅰ中进行摇瓶异养培养，起始生物量浓度折算干重为0.2±0.01g/L。将锥形瓶置于黑暗控温摇床中，摇床转速为130rpm，温度控制为27±1℃，培养时间为8天（192小时）。异养培养至第6、7、8天取样，离心洗涤，冷冻干燥，并测试藻粉中岩藻黄素的含量。其中，培养基Ⅰ的配方为：1L盐水中溶有0.66g MgSO₄·7H₂O、0.3g尿素、50.5mg KH₂PO₄、34mg H₃BO₃、20mg FeSO₄·7H₂O、4.3mg MnCl₂·4H₂O、0.3mg ZnCl₂、0.13mg CoCl₂·6H₂O、0.03mg Na₂MoO₄·2H₂O、5g葡萄糖、0.48g Na₂SiO₃·5H₂O、番茄提取物0.8ml（使培养基Ⅰ中番茄红素的含量约为0.5μg）；所述盐水其氯化钠浓度为22.5g/L。

实施例1中添加的番茄提取物的制备具体过程为：市售番茄洗净后，不加水榨汁，抽滤获得的番茄汁进行冷冻干燥。称取0.25g番茄汁干粉，加入5～10ml丙酮，在振荡器上振荡混匀后，离心，取上清液，氮气吹干后用DMSO定容至50ml，4℃冷藏备用。提取物中总类胡萝卜素的含量为0.826μg/ml，番茄红素含量占72.54％，即每0.8ml番茄提取物约含0.5μg番茄红素。

岩藻黄素测定方法：准确称取30mg冷冻干燥至恒重的小环藻藻粉，在充氮环境下用丙酮提取至藻粉无色，在12000rpm、4℃下离心10min。取色素上清液，氮气吹干，再用3ml丙酮溶解色素用以HPLC分析，上述过程在黑暗条件下进行。

用反相高效液相色谱法测定色素提取液中的岩藻黄素。色谱条件为：Waters1525二元梯度泵；2998二极管阵列检测器；Waters ODS2C₁₈柱（4.6mm×250mm，5μm）。流动相由A溶液（乙腈/甲醇/0.1M Tris-HCl（pH8.0）=84:2:14）和B溶液（甲醇/乙酸乙酯=68：32）组成。梯度洗脱程序：从100%A线性变化到100%B，持续15min；100%B，持续7min；从100%B线性变化到100%A，3min；100%A，持续5min。流速为1.2ml/min。进样量为20μL。色素的吸收光谱扫描范围250～700nm，在其出峰位置450nm处测定岩藻黄素的峰面积。

测定不同浓度的岩藻黄素标准品丙酮溶液，制定外标曲线，根据标准品的出峰时间和特征光谱确定标准品中的岩藻黄素峰，再根据峰面积计算样品岩藻黄素的含量。小环藻CCMP332在450nm处的色素峰谱见图1，岩藻黄素标准品的特征吸收光谱见图2。

实施例2～5

实施例2～5与实施例1均基本相同，其不同点在于步骤2中所用的培养基Ⅰ中葡萄糖浓度不同，实施例2～5的葡萄糖浓度依次分别为10g/L、15g/L、20g/L和25g/L。

实施例1～5培养效果分析：

参见图3，实施例1～5进行异养培养时，均发现生物量随培养时间的延长而增加，培养8天后，实施例1～5的生物量干重浓度分别为1.12g/L、1.71g/L、1.96g/L、1.77g/L和1.76g/L，而实施例3（即培养基Ⅰ中葡萄糖浓度为15g/L）生物量干重浓度最高，但在前期（培养时间<120h）的培养中，除实施例1外，实施例2～5的平均生长速率无显著差异。经测定岩藻黄素含量，发现实施例1～5培养8天后所的小环藻干粉中岩藻黄素的含量分别为9.87mg/g、8.80mg/g、8.44mg/g、8.15mg/g、8.20mg/g（参见图4），可见碳源浓度与岩藻黄素含量之间成负相关，即岩藻黄素含量随葡萄糖浓度的增加而递减。同时根据岩藻黄素含量、生物量数据和培养时间进行计算，第7天时的岩藻黄素产率为最大，分别为1.25mg/L/天、1.81mg/L/天、2.08mg/L/天、1.91mg/L/天和1.82mg/L/天。综合比较下，实施例3（即培养基Ⅰ中葡萄糖浓度为15g/L）培养液中岩藻黄素浓度最高为16.54mg/L，净产率最高为2.08mg/L/天。

实施例6：

按如下步骤培养小环藻：

（1）将活化后的小环藻摇瓶异养培养7天，获得处于对数生长期的种子液；

（2）以发酵罐为培养容器进行分批培养，选用5L玻璃发酵罐，工作体积为3.5L。将小环藻种子液按15％（v/v）接种量接入新配制的培养基Ⅰ中，起始生物量浓度折算干重为0.29g/L，控制溶氧饱和度>50％，搅拌速率为130rpm，pH控制在7.5，培养温度控制27±0.5℃，发酵期为9天（216小时）。每24小时取样测干重，培养3天后（>72h）每24小时取样并冷冻干燥后，提取色素，利用液相色谱法定量测定岩藻黄素含量。所述培养基Ⅰ的配方为：1L盐水中溶有0.66g MgSO₄·7H₂O、0.3g尿素、50.5mg KH₂PO₄、34mg H₃BO₃、20mg FeSO₄·7H₂O、、4.3mg MnCl₂·4H₂O、0.3mg ZnCl₂、0.13mg CoCl₂·6H₂O、0.03mg Na₂MoO₄·2H₂O、15g葡萄糖、0.48g Na₂SiO₃·5H₂O、番茄提取物0.8ml（使培养基Ⅰ中番茄红素的含量约为0.5μg）；所述盐水其氯化钠浓度为22.5g/L。

如图5所示，实验共进行了9天，自第6天起，发酵罐中硅藻进入平台期，第6天至第9天小环藻生物量干重浓度依次为3.05g/L、3.13g/L、3.28g/L和3.18g/L，干藻粉中岩藻黄素的含量为则依次为7.69mg/g、8.39mg/g、9.39mg/g和9.25mg/g（如图6所示），相应的岩藻黄素净产率则依次为3.49mg/L/天、3.38mg/L/天、3.49mg/L/天和2.95mg/L/天。可见当培养进入平台期间后（第6天），藻体中的岩藻黄素含量也随之达到峰值（第8天），继续异养发酵并不能提高其含量，并因培养时间的增加，而导致产率下降。

实施例7：（以异养培养-光诱导方法促进异养小环藻转化积累岩藻黄素）。

按如下步骤培养小环藻：

（1）步骤1，种子液培养过程与实施例6相同，不再赘述；

（2）步骤2，异养培养过程与实施例6基本相同，不同之处在于小环藻按实施例6步骤2的培养条件培养至第8天时（192h）时（此时的生物量干重浓度达到3.17g/L，培养液中葡萄糖残余量为3.43g/L，干藻粉中岩藻黄素含量为9.43mg/g，此时产率约为3.5mg/L/天；另外，起始接种藻液的密度为0.29g/L，其干藻粉中岩藻黄素含量为9.20mg/g），将此发酵藻液用新配制的培养基Ⅱ稀释至0.53g/L（生物量干重浓度），利用250ml锥形瓶为培养容器，工作体积120ml，锥形瓶放置于以荧光灯为光源的控温摇床中，顶部光照强度为4500±500lx，摇床转速为130rpm，温度控制为27±1℃。光诱导处理72h期间每12h取样，离心洗涤，将藻泥冷冻干燥，称重，计算生物量变化比率（某时间段生物量干重/起始生物量干重），提取色素，利用高效液相色谱法测试藻粉中岩藻黄素的含量。所述培养基Ⅱ的配方为：相对于1L的盐水，培养基中还含有0.45g MgSO₄·7H₂O、40mgKH₂PO₄、25mg H₃BO₃、15mg FeSO₄·7H₂O、2.1mg MnCl₂·4H₂O、0.2mg ZnCl₂、0.07mgCoCl₂·6H₂O、0.02mg Na₂MoO₄·2H₂O、0.3g尿素。所述盐水其氯化钠浓度为15g/L。

实施例8～12

与实施例7基本相同，不同点在于小环藻按实施例6步骤2培养至第8天时（192h）时，实施例8～12依次分别将发酵藻液稀释至生物量干重浓度为1.06g/L、1.59g/L、2.12g/L、2.65g/L和3.17g/L。

如图7所示，当异养藻液接受光照时，初期会有一个适应期，在此期间生物量会有所下降。由于培养基中有少量残余葡萄糖，硅藻细胞实际上处于一种兼养状态。在渡过适应期后，细胞生物量会呈现继续增长的趋势，直至达到平台期。

实施例7～12培养效果分析：如图8所示，藻体中岩藻黄素含量随光照时间的延长而增加，光诱导48小时时，实施例7～12中，生物量增加和岩藻黄素积累均进入平台期，最终生物量浓度分别为光诱导前的1.43、1.36、1.4、1.27、1.33和1.35倍，干藻粉中岩藻黄素含量分别为15.93mg/g、15.69mg/g、15.23mg/g、13.97mg/g、13.1mg/g和12.94mg/g，比光诱导之前分别增加了68.93％、66.38％、61.51％，48.14％、38.92％和37.22％，依据光诱导稀释前发酵液的体积为计算依据（下列数据单位中的“L”指发酵液的体积，而非光诱导时稀释后的体积，实施例13～15同此注释），发酵培养8天的净产率为3.39mg/L/天；同样依据稀释前的体积为计算依据，光诱导48h的时间段内，净产率分别为21.16mg/L/天、18.87mg/L/天、18.85mg/L/天、13.17mg/L/天、12.67mg/L/天、12.74mg/L/天，而全周期“8天发酵＋2天光诱导”的净产率分别为6.76mg/L/天、6.31mg/L/天、6.32mg/L/天、5.22mg/L/天、5.14mg/L/天和5.16mg/L/天。由此可见，较之单纯发酵，“发酵＋光诱导”的生产方式大大提高了岩藻黄素的产率。同时，图例数据说明藻体中岩藻黄素的含量与光诱导时初始生物量干重浓度呈现负相关，即在相同光照强度下，初始生物量干重浓度越高，单个细胞接收到的光量子数就越少，从而降低了岩藻黄素的合成；同时，光诱导时，培养基中因异养培养而带来的残余葡萄糖也可能对此有一定作用。

实施例13

小环藻按实施例6步骤2）的培养条件培养8天后，用培养基Ⅱ（与实施例7相同）将其稀释至生物量干重浓度为～1.0g/L，利用250ml锥形瓶为培养容器，工作体积120ml，锥形瓶放置于以荧光灯为光源的光生物反应器中，顶部光照强度为2000±500lx，摇床转速为130rpm，温度控制为27±1℃。光诱导处理48h之后将培养液离心洗涤，将藻泥冷冻干燥，称重，并测试藻粉中岩藻黄素的含量、计算岩藻黄素产率。结果发现按本实施例条件进行培养，48h后，生物量增加至起始培养时的1.13倍左右（见图9），同时发现，48h时收获的小环藻干粉中岩藻黄素的含量为13.75mg/g，光诱导期间，岩藻黄素的净产率为9.98mg/L/天，低于实施例7～12的数值，但要高于单纯发酵培养的产率，全周期“8天发酵＋2天光诱导”的净产率为4.73mg/L/天。

实施例14

与实施例13基本相同，不同点在于实施例14采用的顶部光照强度为8000±1000lx，培养48小时之后将培养液离心洗涤，将藻泥冷冻干燥，称重，并测试藻粉中岩藻黄素的含量、计算岩藻黄素产率。结果发现按本实施例条件进行培养，48h后，生物量增加至起始培养时的1.07倍左右（见图9），同时发现，48h时收获的小环藻干粉中岩藻黄素的含量为14.88mg/g，光诱导期间，岩藻黄素的净产率为10.59mg/L/天，低于实施例7～12的数值，但要高于单纯发酵培养的产率，全周期“8天发酵＋2天光诱导”的净产率为4.85mg/L/天。

实施例15

室外光诱导培养：小环藻按实施例6步骤2）的培养条件培养8天后，用培养基Ⅱ（与实施例7相同）将其稀释至生物量干重浓度为～0.5g/L，利用5mm厚度普通玻璃制作的玻璃缸（平板式光生物反应器）为培养容器，玻璃缸底部内径长度为30cm、宽度为10cm，高度为35cm，装液工作体积为7.5L（25cm高），放置于室外，利用太阳光进行光诱导培养。通过缸表面冷水喷淋，保持培养液最高温度在28℃以下，利用遮阳网，保持太阳光最大光照强度在30000lx以下，充入空气进行搅拌，充气比为0.03v/v/m（即每分钟每升培养液充入0.03L空气），并通过pH偶联的二氧化碳补充装置，通入二氧化碳，补充无机碳源的同时控制培养液pH在7.5左右。培养期内白天的日照时间约为12小时，其中光照在30000lx左右的时间约为6小时（10：00～16：00）；培养时间为3天（0～12h、24～36h、48～60h为白天，属光照时间；12～24h、36～48h、60～72h为黑夜，属无光时间）。每12小时取样，将培养液离心洗涤，冷冻干燥，称重，并测试藻粉中岩藻黄素的含量、计算岩藻黄素产率。通过测试和计算（如图10所示），光诱导36h时（光照总时间为24小时），生物量增加至起始培养时的1.27倍，干藻粉中岩藻黄素含量为19.77mg/g，光诱导期间，岩藻黄素的净产率为24.86mg/L/天，全周期“8天发酵＋2天光诱导”的净产率为7.77mg/L/天。

另外需要说明的是，当培养至48h时，系统承受的光照时间也是24小时，此时的岩藻黄素总产量与36h时相比差别不大，按自然天计算（即1.5天按2天计算），两者的产率是一样的，但48h培养所需的能耗等成本支出有所增加，另外继续加大培养时间至60h和72h，虽然生物量（最大增幅1.34倍）和岩藻黄素含量（最高为22.01mg/g）能进一步增加，但增加幅度不大，整体产率趋于下降。同时可以看到，光诱导期间的净产率是发酵阶段产率的数倍，为了提高整个周期的产率，可以适当减少异养发酵的时间，从而达到减小周期和降低成本的效果，依据本发明实施例所得数据，异养发酵的优选培养时间为6～8天，具体的时间点应当根据发酵罐和光生物反应器等设施的规格/规模计算后确定。

较低的光强导致单个藻细胞受到光量子数较少，从而影响硅藻生长和岩藻黄素积累，而较高的光强会导致光抑制和光损伤现象产生，同样影响硅藻生长和岩藻黄素积累。同时，藻液中过高的生物量浓度会形成自遮挡，影响光的利用，并产生较高的呼吸作用消耗。因此，光诱导处理时，有必要综合调整光照强度、生物量浓度，使之达到岩藻黄素生产的较好生产条件。以本发明的实施例为例，如实施例13～14，藻液生物量浓度为1.0g/L（培养系统光程较小、藻液承光深度约为1.5cm），此时光照强度以2000～8000lx为优选，4500lx为更优选；而如实施例15，藻液生物量浓度为0.5g/L（培养系统光程较大、藻液承光厚度≥10cm），此时的光照强度可增大至数万lx（如30000lx左右）。因此根据上述实施例数据及藻类培养经验数据，规模生产进行光诱导处理时，藻液中的生物量浓度在0.5～1.0g/L为较优选择。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例及实施过程中的优化建议而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)将活化后的硅藻异养培养3～8天，使其处于对数生长期；

2)将步骤1)中处于对数生长期的硅藻培养液作为种子液，按5％～50％体积接种量接入含有培养基Ⅰ的异养培养容器中进行异养培养，培养4～12天，培养温度20～34℃；

所述培养基Ⅰ其配方中包括如下含量范围的组分：NaCl浓度为7.5～35g/L的盐水；相对于1L的盐水，培养基Ⅰ中还含有0.2～1.0g MgSO₄·7H₂O、25～100mg KH₂PO₄、20～40mgH₃BO₃、10～30mg FeSO₄·7H₂O、2～8mg MnCl₂·4H₂O、0.1～0.5mg ZnCl₂、0.04～0.15mgCoCl₂·6H₂O、0.01～0.05mg Na₂MoO₄·2H₂O、0.2～0.8gNa₂SiO₃·5H₂O、含有3.33～20mmol氮元素的氮源、含有0.17～0.83mol碳元素的有机碳源，并添加番茄提取物使培养基Ⅰ中番茄红素的含量为0.5±0.2μg/L；

所述番茄提取物按照如下方法制得：番茄洗净后，不加水榨汁，抽滤获得的番茄汁进行冷冻干燥，得到番茄汁干粉；取番茄汁干粉，向每0.25g番茄汁干粉中加入5～10ml丙酮，在振荡器上振荡混匀后，离心，取上清液，氮气吹干后用DMSO定容至50ml，4℃冷藏备用；

所述硅藻为小环藻。

2.根据权利要求1所述的提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，其特征在于，所述的有机碳源选自葡萄糖、淀粉水解物、淀粉糖、木质纤维素水解物、蔗糖、果糖、甘油、氨基酸中的一种或多种的组合；所述的氮源选自硝酸钾、硝酸钠、碳酸氢铵、氨水、尿素、氨基酸、蛋白水解物、酵母提取物中的一种或多种的组合。

3.根据权利要求1所述的提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，其特征在于，所述方法还具有将步骤2)培养获得的发酵液进行光诱导处理的步骤，光诱导处理的步骤为：将步骤2)异养培养获得的发酵液用培养基Ⅱ稀释至生物量干重浓度0.1～3.5g/L，放置于光生物反应器中，在照度为2000～30000lx的光照下进行光诱导处理，处理时间t为：0小时＜t≤120小时；

所述培养基Ⅱ包括如下含量范围的组分：NaCl浓度为7.5～35g/L的盐水；相对于1L的盐水，培养基中还含有0.2～1.0g MgSO₄·7H₂O、25～100mg KH₂PO₄、20～40mg H₃BO₃、10～30mg FeSO₄·7H₂O、2～8mg MnCl₂·4H₂O、0.1～0.5mg ZnCl₂、0.04～0.15mg CoCl₂·6H₂O、0.01～0.05mg Na₂MoO₄·2H₂O、含有3.33mmol～20mmol氮元素的氮源。

4.根据权利要求3所述的提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，其特征在于，所述的氮源选自硝酸钾、硝酸钠、碳酸氢铵、氨水、尿素、氨基酸、蛋白水解物、酵母提取物中的一种或多种的组合。

5.根据权利要求3所述的提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，其特征在于，所述的光生物反应器指可利用太阳光或人工光源的生物培养容器，所述光生物反应器选自开放式跑道池、开放式圆池、平板式光生物反应器、管道式光生物反应器、气升式光生物反应器。

6.根据权利要求3所述的提高硅藻中岩藻黄素产率的培养方法，其特征在于，光诱导处理中所用的光为含有波长380～720nm之间波段的太阳光或人工光源产生的光。