CN102007216A - 岩藻黄质的制备方法以及用于制备岩藻黄质的微藻 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种有效制备岩藻黄质或含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，该方法能够大规模制备岩藻黄质；以及用于该方法中的微藻。特别地公开了一种制备岩藻黄质或含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，其特征在于：培养微藻，更特别地属于菠萝藻纲、金藻纲、硅藻纲或定鞭藻纲的微藻，和自培养藻类提取/分离岩藻黄质或含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质；以及用于制备上述各个岩藻黄质组分的微藻。
Description
技术领域
本发明涉及使用微藻制备岩藻黄质或含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，以及用于制备岩藻黄质的微藻。特别地，本发明涉及使用属于菠萝藻纲(Pinguiophyceae)、金藻纲(Chrysophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)或定鞭藻纲(Haptophyceae)的微藻制备岩藻黄质或含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，以及用于制备岩藻黄质的微藻。
背景技术
岩藻黄质已知具有抗癌效果，并已检验其作为医药药品和健康食品的应用性(专利文献1)。作为岩藻黄质的制备方法，已知包括从例如作为大型藻类的巨藻(昆布(Laminaria)属海藻)和若芽(裙带菜(Undaria pinnatifida))提取岩藻黄质的方法(专利文献2和3)。由于属于大型藻类的如巨藻和若芽的褐藻不利地具有极慢的生长速率，需要较长时间和较高成本以获得足够实践量的这种褐藻。此外，由于褐藻必须在海洋中培养，其稳定的供应是不利地困难的。而且，由于大型藻类具有高含量的多糖等和坚固的细胞壁，提取和制备岩藻黄质的方法是不利地艰难的。
因此，已研究培养冈村枝管藻(Cladosiphon okamuranus)的盾片的方法作为人工培养大型藻类的方法(专利文献4)。尽管通过所述方法的岩藻黄质的产率高达每100克干海藻1.1克，由于盾片难以处理以及其缓慢的培养速率，因此生产率较低，从而使得制备成本不利地较高。
此外，如二十碳五烯酸的高度不饱和脂肪酸由于其有用的生理学活性而用于医药药品和健康食品中，其大部分自鱼类等提取。高度不饱和脂肪酸通过需要复杂的提取、纯化等的方法制得(专利文献5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：JP-A-10-158156
专利文献2：日本专利No.2639630
专利文献3：日本专利No.2673684
专利文献4：JP-A-2004-35528
专利文献5：JP-B-4-16519
发明内容
本发明所要解决的问题
本发明的目的是，为了有效收集岩藻黄质或含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的目的而提供一种使用微藻制备岩藻黄质或含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法以及用于制备岩藻黄质的微藻。更特别地，本发明的目的是提供一种使用属于菠萝藻纲、金藻纲、硅藻纲或定鞭藻纲的微藻制备岩藻黄质或含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，以及用于制备岩藻黄质的微藻。
解决问题的方法
注意力集中于微藻产生岩藻黄质的发现和培养速率(生长速率)，本发明人研究了以较高岩藻黄质生产率获得微藻。因此，发明人发现一些属于菠萝藻纲、金藻纲、硅藻纲或定鞭藻纲的微藻以较高水平产生岩藻黄质。由此实现发明。
本发明总结为使用微藻制备岩藻黄质的方法，如下(1)至(7)所描述。
(1)一种岩藻黄质的制备方法，其包括在培养基中培养岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多的微藻以及从培养藻类提取并分离岩藻黄质。
(2)一种如(1)中所述的岩藻黄质的制备方法，其中所述培养基为含有包括糖的有机物质的培养基。
(3)一种如(1)或(2)中所述的岩藻黄质的制备方法，其中所述微藻为属于菠萝藻纲、金藻纲、硅藻纲或定鞭藻纲的微藻。
(4)一种如(3)中所述的岩藻黄质的制备方法，其中属于菠萝藻纲的微藻为Pinguiochrysis(拉丁文，无译文)属的微藻。
(5)一种如(3)中所述的岩藻黄质的制备方法，其中属于金藻纲的微藻为棕鞭藻(Ochromonas)属的微藻。
(6)一种如(3)中所述的岩藻黄质的制备方法，其中属于硅藻纲的微藻为褐指藻(Phaeoductylum)属的微藻。
(7)一种如(3)中所述的岩藻黄质的制备方法，其中属于定鞭藻纲的微藻为属于颗石藻(Pleurochrysis)或巴夫藻(Pavlova)属的微藻。
此外，本发明总结为使用微藻制备含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，如下(8)至(10)所描述。
(8)一种根据(1)至(7)任一项所述的岩藻黄质的制备方法制备含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，其包括自培养物收集岩藻黄质并同时收集高度不饱和脂肪酸。
(9)一种如(8)中所述的制备含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，其中所述高度不饱和脂肪酸为具有20或更多个碳原子的高度不饱和脂肪酸。
(10)一种如(9)中所述的制备含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，其中所述高度不饱和脂肪酸为二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的至少一种。
此外，本发明总结为如下(11)所描述的微藻。
(11)用于(1)至(7)任一项所述的方法中的岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多的微藻。
本发明的优点
本发明提供了一种使用用于制备岩藻黄质的微藻和岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多的微藻制备岩藻黄质或含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法。更特别地，本发明提供了一种使用用于制备岩藻黄质的属于菠萝藻纲、金藻纲、硅藻纲或定鞭藻纲的微藻和岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多的微藻制备岩藻黄质或含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法。本发明提供了一种制备岩藻黄质的有效方法，以及在该方法中使用的岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多，优选1.0毫克/升/天或更多，更优选2.0毫克/升/天或更多的微藻，从而实现岩藻黄质的大规模制备。
附图说明
图1为显示在培养实施例2中菠萝藻纲的微藻培养物随时间变化的图。
具体实施方式
微藻为在藻类中仅可使用显微镜观察到的极小浮游植物的通用名，亦即，除了主要在陆地上生长的藓类植物、蕨类植物和种子植物之外的具有产氧型光合成的生物体。
用于本发明的微藻包括属于菠萝藻纲、金藻纲、硅藻纲或定鞭藻纲的微藻。更特别地，属于菠萝藻纲的微藻为Pinguiochrysis属的微藻、Phaeomonas(拉丁文，无译文)属的微藻、或Polypodochrysis(拉丁文，无译文)属的微藻；属于金藻纲的微藻为棕鞭藻属的微藻、锥囊藻(Dinobryon)属的微藻、金藻(Poterioochromonas)属的微藻、附钟藻(Epipyxis)属的微藻等；属于硅藻纲的微藻为褐指藻属的微藻、小环藻(Cyclotella)属的微藻、骨条藻(Skeletonema)、菱形藻(Nitzschia)或角毛藻(Chaetoceros)属的微藻等；属于定鞭藻纲的微藻为颗石藻、Exanthemachrysis(拉丁文，无译文)或巴夫藻，或等鞭金藻(Isochrysis)属的微藻等。
本发明涉及一种岩藻黄质的制备方法，其包括在培养基中培养岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多的微藻以及从培养藻类分离并提取岩藻黄质。
0.5毫克/升/天或更多的生产率的重要性
已知微藻产生岩藻黄质。已知岩藻黄质为具有用于光合成的会聚作用的辅助染料。然而，对微藻中的岩藻黄质水平的详细检查的研究工作实例还是未知的。因此，完全未知有多少岩藻黄质包含于其中(Shinichi Takaichi编辑的“Carotenoid”，2006年4月，第10-48页)。
从海藻中收获岩藻黄质涉及与食物的竞争、困难的回收、稳定的制备、苛刻的提取(多糖的存在)等。例如，在若芽的情况中，岩藻黄质的生产率为约0.01毫克/升/天，尽管其生产率与相同单位的微藻生产率的比较较困难。在自海藻收获的岩藻黄质的任何情况中，应了解达到0.01毫克/升/天或更多的岩藻黄质的生产率十分困难。盾片的制备需要20至30天。然后，应培养盾片7天。盾片制备是限速的。当估计盾片的制备到岩藻黄质的制备需要约30天时，生产率为约0.1毫克/升/天。
根据本发明，使用在如上所述的微藻中岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多的微藻。相比于属于常规大型藻类的褐藻，如具有极慢生长速率的巨藻和若芽以及具有艰难处理和缓慢培养速率的冈村枝管藻的红毛盘菌(scutellata)，当使用岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多的微藻时，能以稳定的方式经济地获得实践量的岩藻黄质。此外，相比于大型藻类，这些微藻的提取和制备较容易。另外，微藻含有有用的高度不饱和脂肪酸。
在微藻中，岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多的微藻是经济上令人满意的。岩藻黄质生产率优选为1.0毫克/升/天或更多，更优选为2.0毫克/升/天或更多的微藻更令人满意。
另外，本发明涉及一种岩藻黄质的制备方法，该方法包括在含有包括糖的有机物质的培养基中培养岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多的微藻，以及从培养藻类分离并提取岩藻黄质。待使用的糖的类型包括无特别限定的任何糖，只要棕鞭藻属的微藻能够用该糖生长。例如，多糖(如淀粉、纤维素、β1，3-葡聚糖、几丁质和果聚糖)、二糖(如蔗糖、纤维二糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖)和单糖(如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖和乳糖)可用作糖。甘油和酚用作其他有机物质。特别地，当淀粉、麦芽糖、纤维二糖和葡萄糖用作碳源时，岩藻黄质可有效制得。果糖、甘露糖和酚也可用作与如上所述碳源具有相同生产率的那些。
微藻特别地包括例如菠萝藻纲的微藻(如Pinguiochrysis pyriformis(拉丁文，无译文)、Phaeomonas parva(拉丁文，无译文)，和Polypodochrysis teissieri(拉丁文，无译文))；金藻纲的微藻(如Ochromonas danica(拉丁文，无译文)、Ochromonas tuberculata(拉丁文，无译文)，和Ochromonas villosa(拉丁文，无译文)或Ochromonasminuta(拉丁文，无译文)、Dinobryon cylindrical(拉丁文，无译文)、Poterioochromonas malhamensis(拉丁文，无译文)，和Epipyxis glabra(拉丁文，无译文))；硅藻纲的微藻(如三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)、隐形小环藻(Cyclotella cryptica)、梅尼小环藻(Cyclotellameneghiniana)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)、左弯菱形藻(Nitzschia laevis)，和角刺藻(Chaetoceros gacillis))；定鞭藻纲的微藻(如Pleurochrysis haptonemofera(拉丁文，无译文)、Exanthemachrysisgayraliae(拉丁文，无译文)、Pavlova pinguis(拉丁文，无译文)和路氏巴夫藻(Pavlova lutheri)，和球等鞭金藻(Isochrysis galbana))。
可培养微藻的任何培养基可令人满意地使用而无特别限定，培养微藻的培养基包括例如加入氮气、营养盐(如磷酸、维生素和微量元素)的人工海水或海水。此外，培养可在光照射下完成。作为照射方法，可进行连续照射和光循环照射。岩藻黄质通过常规方法从以这种方式培养的藻类中提取。通过在离心之后干燥藻类并提取岩藻黄质，岩藻黄质可以较简单的方式得以提取。
此外，由于棕鞭藻属的微藻可用如糖的有机物质增殖，藻类可无需光照射而增殖。该方法可用于除了棕鞭藻属的微藻之外的能够使用如糖的有机物质生长的微藻。例如也可使用硅藻纲的菱形藻(Nitzschia)属。
此外，本发明涉及一种岩藻黄质的制备方法，其包括在含有包括糖的有机物质的培养基中培养棕鞭藻属的微藻以获得6克/升或更多的干藻类。当微藻在无有机物质(如葡萄糖)下培养时，通常，由于在培养物密度刚达到3克/升或更多时的微藻的培养物密度导致通过微藻的透光率降低，使得需要提高光强度。当提高光强度时，不利地，水温的控制具有难度。使用有机物质的培养允许微藻使用有机物质作为营养物而增殖，从而易于获得6克/升或更多的干藻类而无需任何光照射。
可使用能够从中提取岩藻黄质的任何溶剂作为从微藻提取岩藻黄质的溶剂而无特别限定。例如，可使用乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酮、氯仿和甲苯。例如，有机溶剂可单独使用或以两种或两种以上的结合使用，包括醇(如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和正丁醇)、酮(如甲乙酮和丙酮)、酯(乙酸甲酯和乙酸乙酯)、有机氯烃(如氯仿)、脂族烃(如己烷)，和芳香烃(如苯和甲苯)。可以1∶100至100∶1，优选1∶50至50∶1的有机溶剂与干微藻的比例使用这种有机溶剂。使用有机溶剂提取可通过通常方法进行。例如，在使用乙醇作为有机溶剂的情况中，提取可在0℃至60℃，优选5℃至40℃的温度下令人满意地进行0.5至100小时，优选12小时至72小时。对于提取，如需要，可进行使用超声波或使用搅拌器的搅拌。对于利用具有高效液相色谱的离子交换色谱、反相色谱等的岩藻黄质分离和纯化，直接使用或在去除残余物之后使用以这种方式获得的在有机溶剂中的提取物。
使用在有机溶剂中的提取物而不通过如HPLC的色谱加工时，可获得高度不饱和脂肪酸和岩藻黄质的混合物。本文的高度不饱和脂肪酸指优选具有20个或更多个碳原子的高度不饱和脂肪酸，特别包括二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸或二十二碳六烯酸或其混合物。
现在如下描述本发明的实施例。然而，本发明决不限定于实施例。
实施例
培养实施例1
培养金藻纲的微藻
金藻纲的Ochromonas danica CS-4菌株(可购自Microbial CultureCollection，the National Institute for Environmental Studies)在JM培养基中培养(表1)。该菌株在200毫升JM培养基中在300μmol m-2S-1(14小时亮循环和10小时暗循环)下培养7天，所述JM培养基被装入在25℃下的恒温水箱中的500毫升锥形瓶(Erlenmeyer flask)中。
表1
培养实施例2
培养菠萝藻纲的微藻
菠萝藻纲的Pinguiochrysis pyriformis MBIC 10782菌株(可购自Marine Biotechnology Research Institute)在IMK培养基中培养(表2)。该菌株在100毫升IMK培养基中培养，所述培养基被装入盖有Silicosen(由Shin-Etsu Polymer Co.，Ltd.制造)的500毫升锥形瓶中。用1毫升玻璃移液管穿过Silicosen，试管在自其底部的通气下进行搅拌。培养在25℃下的恒温水箱中，并在通气条件下在pH控制和300μmol m-2S-1(连续照射)下进行7天。培养物随时间的变化显示于图1。
表2
培养实施例3
培养硅藻纲的微藻
硅藻纲的三角褐指藻CCAP 1052/1A菌株(可购自CultureCollection ofAlgae and Protozoa)在f/2+Si培养基中培养(表3)。该菌株在200毫升JM培养基中在300μmol m-2S-1(14小时亮循环和10小时暗循环)下培养8天，所述JM培养基被装入在25℃下的恒温水箱中的500毫升锥形瓶中。
表3
培养实施例4
培养定鞭藻纲的微藻
定鞭藻纲的Pavlova pinguis AC 19菌株(可购自Microalgal CultureCollection University of Caen Basse-Normandie)在IMK培养基中培养(表2)。该菌株在200毫升JM培养基中在300mol m-2S-1(14小时亮循环和10小时暗循环)下培养10天，所述JM培养基被装入在25℃下的恒温水箱中的500毫升锥形瓶中。
培养实施例5
使用可溶性淀粉作为底物培养金藻纲微藻
金藻纲的Ochromonas danica CS-4菌株(可购自Microbial CultureCollection，the National Institute for Environmental Studies)在OA30S培养基中培养(表4)。该菌株在100毫升OA30S培养基中在300μmol m-2S-1(14小时亮循环和10小时暗循环)下培养7天，所述OA30S培养基被装入在25℃下的500毫升锥形瓶中。
表4
培养实施例6
使用葡萄糖作为底物培养金藻纲微藻
金藻纲的Ochromonas danica CS-4菌株(可购自Microbial CultureCollection，the National Institute for Environmental Studies)在OA30G培养基中培养(表4)。该菌株在100毫升OA30G培养基中用100rpm下的摇动培养机(Takasaki Scientific Instrument Co.，Ltd.)在黑暗状态培养3天，随后在25℃和300μmol m-2S-1(14小时亮循环和10小时暗循环)培养4天，所述OA30G培养基被装入在25℃下的500毫升锥形瓶中。
表5
提取实施例
岩藻黄质的提取和分析
将培养实施例1、2、3和4中的液体培养物的每一个的100毫升进行离心，从而去除上清液。将沉淀的藻类取出并用冷冻干燥器(由Fuji Medical Science Co.，Ltd.制造)冷冻干燥。作为结果，回收了干藻类0.264克(培养实施例1)、0.427克(培养实施例2)、0.213克(培养实施例3)、0.162克(培养实施例4)、0.702克(培养实施例5)和0.681克(培养6)。随后，将3毫升丙酮加入0.1克的每一种干藻类，用涡旋混合器充分搅拌以提取岩藻黄质。使用Myshoridisk H-13-5(由Tosoh Co.，Ltd.制造)从提取物溶液中去除残余物。所得滤液在减压下浓缩。浓缩物用作分析样品。岩藻黄质用带有TSK gel-ODS80Ts(由Tosoh，Co.，Ltd.制造，4.6毫米(直径)×150毫米)的HPLC(SCL 10A：470纳米，由Shimadzu Co.，Ltd.制造；流速1.0米/分钟)进行分析，从而通过使用算术式1所示的计算式确定制得的岩藻黄质的产率和生产率。在本文中，由Wako Pure Chemical Co.，Ltd.制造的岩藻黄质用作标准岩藻黄质试剂。
作为结果，由培养实施例1中的Ochromonas danica CS-4菌株生产的岩藻黄质为0.538毫克/0.1克干藻类，而生产率为2.03毫克/升/天。类似地，由培养实施例2中的Pinguiochrysis pyriformis MBIC 10782菌株生产的岩藻黄质为0.640毫克/0.1克干藻类，而生产率为3.90毫克/升/天。在培养实施例3中，由三角褐指藻CCAP 1052/A生产的岩藻黄质为0.583毫克/0.1克干藻类，而生产率为1.55毫克/升/天。在培养实施例4中，由Pavlova pinguis AC19生产的岩藻黄质为0.792毫克/0.1克干藻类，而生产率为1.28毫克/升/天。在培养实施例5中，由Ochromonas danica CS-4菌株生产的岩藻黄质为0.428毫克/0.1克干藻类，而生产率为4.29毫克/升/天。在培养实施例6中，由Ochromonasdanica CS-4菌株生产的岩藻黄质为0.409毫克/0.1克干藻类，而生产率为3.98毫克/升/天。此外，将5％氯化氢甲醇加入Pinguiochrysispyriformis MBIC10782菌株的提取物溶液中在90℃下反应2天以进行甲醇分解。在己烷中提取脂肪酸甲酯，所得提取物用氮气浓缩以用于气相色谱(GC17A；由Shimadzu Co.，Ltd.制造)分析。包含6.4毫克/0.1克干藻类的二十碳五烯酸。
算术式1
生产率＝[干藻类(克)/1L培养基]×[岩藻黄质(毫克)/1克干藻类]/[以天计的培养时间]
工业实用性
本发明提供了一种有效制备岩藻黄质的方法，以及在该方法中使用的岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多，优选1.0毫克/升/天或更多，更优选2.0毫克/升/天或更多的微藻，通过该方法，实现了岩藻黄质的大规模制备，同时可获得含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质而无需复杂的纯化方法等。
Claims (11)
1.一种岩藻黄质的制备方法，该方法包括在培养基中培养岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多的微藻以及从培养藻类提取并分离岩藻黄质。
2.根据权利要求1所述的岩藻黄质的制备方法，其中所述培养基为含有包括糖的有机物质的培养基。
3.根据权利要求1或2所述的岩藻黄质的制备方法，其中所述微藻为属于菠萝藻纲、金藻纲、硅藻纲或定鞭藻纲的微藻。
4.根据权利要求3所述的岩藻黄质的制备方法，其中属于菠萝藻纲的微藻为Pinguiochrysis属的微藻。
5.根据权利要求3所述的岩藻黄质的制备方法，其中属于金藻纲的微藻为棕鞭藻属的微藻。
6.根据权利要求3所述的岩藻黄质的制备方法，其中属于硅藻纲的微藻为褐指藻属的微藻。
7.根据权利要求3所述的岩藻黄质的制备方法，其中属于定鞭藻纲的微藻为属于颗石藻或巴夫藻属的微藻。
8.一种根据权利要求1至7任一项所述的岩藻黄质的制备方法制备含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，该方法包括自培养物收集岩藻黄质并同时收集高度不饱和脂肪酸。
9.根据权利要求8所述的制备含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，其中所述高度不饱和脂肪酸为具有20或更多个碳原子的高度不饱和脂肪酸。
10.根据权利要求9所述的制备含有高度不饱和脂肪酸的岩藻黄质的方法，其中所述高度不饱和脂肪酸为二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸的至少一种。
11.用于如权利要求1至7任一项所述的方法中的岩藻黄质生产率为0.5毫克/升/天或更多的微藻。
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