JPWO2009130895A1 - フコキサンチンの製造方法およびそれに用いる微細藻類 - Google Patents
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Abstract
課題：フコキサンチンの大量生産を可能とする、効率的なフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、およびそれに用いる微細藻類を提供すること。解決手段：微細藻類、より具体的には、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類を培養し、その培養藻体から、フコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンを抽出、分離することを特徴とする製造方法、および前記フコキサンチンを製造するための微細藻類。
Description
本発明は、微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するための微細藻類に関する。具体的には、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するための微細藻類に関する。
フコキサンチンは、抗腫瘍効果などが知られており、医薬，健康食品としての利用が検討されている（特許文献１）。このフコキサンチンの製造方法として、大型藻類であるコンブ、ワカメなどから抽出する方法が知られている（特許文献２および３）。しかながら、コンブ、ワカメなどの大型藻類に属する褐藻類は、成長速度が非常に遅いため、実用的な量を得るためには、時間とコストがかかることが問題になっている。また、実際には海洋で栽培する必要があるため安定な供給にも問題がある。さらに、大型藻類は多糖などの含有量が多くまた、細胞壁が頑丈なためフコキサンチンの抽出・生産方法に問題があった。
そこで、人工的に培養する方法としてモズクの盤状体を培養する方法が検討された（特許文献４）。この方法は、フコキサンチンの収量が乾燥藻体１００ｇあたり１．１ｇと非常に高くなったが、盤状体の取り扱いが難しいことおよび培養速度が遅いため、生産性が低いため、製造コストが高くなるという欠点あった。
また、エイコサペンタエン酸などの高度不飽和脂肪酸は、その有用な生理活性から、医薬、健康食品などのに利用されているものであるが、多くは、魚類等から抽出されているものであって、複雑な抽出、精製等を要する方法で製造されている（特許文献５）。
本発明は、効率的な、フコキサンチンあるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの採取を目的とし、微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するための微細藻類を提供することを課題とする。より具体的には、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するための微細藻類を提供することを課題とする。
本発明者らは微細藻類がフコキサンチンを生産すること及びその培養速度（成長速度）に着目し、フコキサンチン生産量の多い微細藻類を求め鋭意探索の結果、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類にフコキサンチンを多く生産するものを見出し、本発明を完成させるに至った。
本発明は、下記（１）ないし（７）に記載の、微細藻類によるフコキサンチンの製造方法を要旨とする。
（１）フコキサンチンの生産性が０．５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類を培地で培養し、その培養藻体からフコキサンチンを抽出、分離することを特徴とする、フコキサンチンの製造方法。
（２）培地が糖を含む有機物を含有する培地である（１）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（３）微細藻類がピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類である、（１）または（２）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（４）ピンギオ藻綱に属する微細藻類がピンギオクリシス属（Pinguiochrysis）に属する微細藻類である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（５）黄金色藻綱に属する微細藻類がオクロモナス属（Ochromonas）に属する微細藻類である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（６）珪藻綱に属する微細藻類がファエオダクチラム属（Phaeoductylum）に属する微細藻類である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（７）ハプト藻綱に属する微細藻類がプレウロクリシス属（Pleurochrysis）またはパブロバ属（Pavlova）に属する微細藻である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（１）フコキサンチンの生産性が０．５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類を培地で培養し、その培養藻体からフコキサンチンを抽出、分離することを特徴とする、フコキサンチンの製造方法。
（２）培地が糖を含む有機物を含有する培地である（１）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（３）微細藻類がピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類である、（１）または（２）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（４）ピンギオ藻綱に属する微細藻類がピンギオクリシス属（Pinguiochrysis）に属する微細藻類である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（５）黄金色藻綱に属する微細藻類がオクロモナス属（Ochromonas）に属する微細藻類である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（６）珪藻綱に属する微細藻類がファエオダクチラム属（Phaeoductylum）に属する微細藻類である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
（７）ハプト藻綱に属する微細藻類がプレウロクリシス属（Pleurochrysis）またはパブロバ属（Pavlova）に属する微細藻である、（３）に記載のフコキサンチンの製造方法。
また本発明は、下記（８）ないし（１０）に記載の、微細藻類による高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法を要旨とする。
（８）（１）ないし（７）のいずれか一項に記載のフコキサンチンの製造方法において、培養物からフコキサンチンを採取すると同時に高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とする、高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
（９）高度不飽和脂肪酸が炭素数２０以上の高度不飽和脂肪酸である、（８）に記載の高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
（１０）高度不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸のうちの少なくとも１種である、（９）に記載の高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
（８）（１）ないし（７）のいずれか一項に記載のフコキサンチンの製造方法において、培養物からフコキサンチンを採取すると同時に高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とする、高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
（９）高度不飽和脂肪酸が炭素数２０以上の高度不飽和脂肪酸である、（８）に記載の高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
（１０）高度不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸のうちの少なくとも１種である、（９）に記載の高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
さらに本発明は、下記（１１）に記載の、微細藻類を要旨とする。
（１１）上記（１）ないし（７）のいずれか一項に記載の製造方法に用いるためのフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類。
（１１）上記（１）ないし（７）のいずれか一項に記載の製造方法に用いるためのフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類。
本発明により、微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するためのフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類が提供される。より具体的には、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類を用いたフコキサンチン、あるいは高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法、および前記フコキサンチンを製造するためのフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類が提供される。本発明により、効率的なフコキサンチンの製造方法、およびそれに用いるフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上、好ましくは１.０ｍｇ/Ｌ/日以上、さらに好ましくは２.０ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類が提供され、フコキサンチンの大量生産が可能となる。
微細藻類とは、主に地上に生息するコケ植物、シダ植物、種子植物を除く酸素発生型光合成を行う生物、即ち藻類のうち、顕微鏡でしか観察できない非常に小さな植物プランクトンの総称である。
本発明で用いる微細藻類としては、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類が挙げられる。より具体的には、ピンギオ藻綱に属する微細藻類がピンギオクリシス属（Pinguiochrysis）に属する微細藻類、ファエオモナス属（Phaeomonas）に属する微細藻類またはポリポドクリシス属（Polypodochrysis）に属する微細藻類、黄金色藻綱に属する微細藻類がオクロモナス属（Ochromonas）に属する微細藻類、サヤツナギ属(Dinobryon)に属する微細藻類、ポテリオオクロモナス属(Poterioochromonas)に属する微細藻類またはエピピクシス属(Epipyxis)に属する微細藻類など、珪藻綱に属する微細藻類がファエオダクチラム属（Phaeoductylum）に属する微細藻類、シクロテラ属(Cyclotella)に属する微細藻類、スケルトネマ属(Skeletonema)、ニッチア属(Nitzschia)、またはキートセラス属(Chaetoceros)に属する微細藻など、ハプト藻綱に属する微細藻類がプレウロクリシス属（Pleurochrysis）、イクザンテマクリシス属 (Exanthemachrysis)、またはパブロバ属（Pavlova）、またはイソクリシス属(Isochrysis属)に属する微細藻類などが挙げられる。
本発明で用いる微細藻類としては、ピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類が挙げられる。より具体的には、ピンギオ藻綱に属する微細藻類がピンギオクリシス属（Pinguiochrysis）に属する微細藻類、ファエオモナス属（Phaeomonas）に属する微細藻類またはポリポドクリシス属（Polypodochrysis）に属する微細藻類、黄金色藻綱に属する微細藻類がオクロモナス属（Ochromonas）に属する微細藻類、サヤツナギ属(Dinobryon)に属する微細藻類、ポテリオオクロモナス属(Poterioochromonas)に属する微細藻類またはエピピクシス属(Epipyxis)に属する微細藻類など、珪藻綱に属する微細藻類がファエオダクチラム属（Phaeoductylum）に属する微細藻類、シクロテラ属(Cyclotella)に属する微細藻類、スケルトネマ属(Skeletonema)、ニッチア属(Nitzschia)、またはキートセラス属(Chaetoceros)に属する微細藻など、ハプト藻綱に属する微細藻類がプレウロクリシス属（Pleurochrysis）、イクザンテマクリシス属 (Exanthemachrysis)、またはパブロバ属（Pavlova）、またはイソクリシス属(Isochrysis属)に属する微細藻類などが挙げられる。
本発明は、フコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類を培地で培養し、その培養藻体からフコキサンチンを分離・抽出することを特徴とする、フコキサンチンの製造方法に関する。
［生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上であることの意義］
微細藻類には、フコキサンチンを生産することは、すでに知られていたが、このフコキサンチンは、光合成のための集光作用を持つ補助色素として知られていた。しかしながら、微細藻類中のフコキサンチン量を詳細に検討した研究例がなかったため、どの程度のフコキサンチンを含むのかまったく知られていなかった（高市真一編「カロテノイド」２００６年４月、ｐ.１０−４８）
海藻からフコキサンチンをとる場合、食品との競合、回収の難しさ、安定生産、抽出の難しさ(多糖の存在)などがある。微細藻と同じ単位で生産性を比較するのは難しいが、ワカメの場合を例にとると、０．０１ｍｇ/Ｌ/日程度になる。いずれにせよ海藻からとる場合、０．０１ｍｇ/Ｌ/日以上は困難と考えられる。まず、盤状体を作成するのに、２０日〜３０日かかる。その後、7日間培養する。この盤状体を作るのが律速になる。盤状体作成から生産するまで３０日程度かかるとすると、その生産性は、０．１ｍｇ/Ｌ/日程度になる。
本発明においては、上記の微細藻類のうちフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上であるものを用いる。フコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上のものを用いると、従来の成長速度が非常に遅いコンブ、ワカメなどの大型藻類に属する褐藻類や、取り扱いが難しく、培養速度が遅いモズクの盤状体などに比し、安定で、実用的な量を経済的に得ることができる。またこれら微細藻類は、大型藻類に比し抽出・生産方法が容易であり、さらに、有用な高度不飽和脂肪酸も含有するものである。
微細藻類のうち、フコキサンチンの生産性として０.５ｍｇ/Ｌ/日以上のものであれば、経済的に充分であるが、好ましくは１.０ｍｇ/Ｌ/日以上、さらに好ましくは２.０ｍｇ/Ｌ/日以上ものが良い。
［生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上であることの意義］
微細藻類には、フコキサンチンを生産することは、すでに知られていたが、このフコキサンチンは、光合成のための集光作用を持つ補助色素として知られていた。しかしながら、微細藻類中のフコキサンチン量を詳細に検討した研究例がなかったため、どの程度のフコキサンチンを含むのかまったく知られていなかった（高市真一編「カロテノイド」２００６年４月、ｐ.１０−４８）
海藻からフコキサンチンをとる場合、食品との競合、回収の難しさ、安定生産、抽出の難しさ(多糖の存在)などがある。微細藻と同じ単位で生産性を比較するのは難しいが、ワカメの場合を例にとると、０．０１ｍｇ/Ｌ/日程度になる。いずれにせよ海藻からとる場合、０．０１ｍｇ/Ｌ/日以上は困難と考えられる。まず、盤状体を作成するのに、２０日〜３０日かかる。その後、7日間培養する。この盤状体を作るのが律速になる。盤状体作成から生産するまで３０日程度かかるとすると、その生産性は、０．１ｍｇ/Ｌ/日程度になる。
本発明においては、上記の微細藻類のうちフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上であるものを用いる。フコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上のものを用いると、従来の成長速度が非常に遅いコンブ、ワカメなどの大型藻類に属する褐藻類や、取り扱いが難しく、培養速度が遅いモズクの盤状体などに比し、安定で、実用的な量を経済的に得ることができる。またこれら微細藻類は、大型藻類に比し抽出・生産方法が容易であり、さらに、有用な高度不飽和脂肪酸も含有するものである。
微細藻類のうち、フコキサンチンの生産性として０.５ｍｇ/Ｌ/日以上のものであれば、経済的に充分であるが、好ましくは１.０ｍｇ/Ｌ/日以上、さらに好ましくは２.０ｍｇ/Ｌ/日以上ものが良い。
また、本発明はフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類を、糖を含む有機物を含有する培地で培養し、その培養藻体からフコキサンチンを分離、抽出することを特徴とする、フコキサンチンの製造方法に関する。この時用いる糖の種類としては、オクロモナス属の微細藻類が生育できるものであれば特に限定されない。例えば、でんぷん，セルロース，β1，3-グルカン，キチン，フルクタンなどの多糖類、ショ糖，セロビオース，マルトース，トレハロース，乳糖などの２糖類、グルコース，フルクトース，マンノース，ガラクトース，ラクトースなどの単糖類を用いることができる。その他の有機物としては、グリセリン，フェノールなどが用いられる。特にでんぷん，マルトース，セロビオース，グルコースを炭素源として用いると効率よくフコキサンチンを生産でき、これらと同等の生産性を持つものとしてフルクトース，マンノース，フェノールなどを用いることもできる。
微細藻類のさらに具体的なものとしては、ピンギオ藻綱に属する微細藻がピンギオクリシス ピリフォルミス(Pinguiochrysis pyriformis)、ファエオモナス パルバ(Phaeomonas parva)およびポリポドクリシス テエイシエリ(Polypodochrysis teissieri)、黄金色藻綱に属する微細藻類がオクロモナス ダニカ(Ochromonas danica)、オクロモナス ツベルクラタ(Ochromonas tuberculata)およびオクロモナス ビロサ(Ochromonas villosa)、または、オクロモナス ミヌタ(Ochromonas minuta)、ディノビオン シリンドリカ(Dinobryon cylindrical)、ポテリオオクロモナス マルハメンシス(Poterioochromonas malhamensis) 、エピピクシス グラブラ(Epipyxis glabra)など、珪藻綱に属する微細藻類がファエオダクチラム トリコルナタム(Phaeodactylum tricornutum)、シクロテラ クリプティカ(Cyclotella cryptica)、シクロテラ メネギニアナ (Cyclotella meneghiniana)、スケルトネマ コスタツム(Skeletonema costatum)、ニッチア ラエビス(Nitzschia laevis)、キートセラス グラシス(Chaetoceros gacilis)など、ハプト藻綱に属する微細藻類がプレウロクリシス ハプトネモフェラ(Pleurochrysis haptonemofera)、イクザンテマクリシス ガイラリエ(Exanthemachrysis gayraliae)、パプロバ ピングイス（Pavlova pinguis） および パブロバ ルセリ（Pavlova lutheri）、イソクリシス ガルバナ(Isochrysis galbana)などが挙げられる。
微細藻を培養する培地は、微細藻を培養することができれば特に制限されず、例えば人工海水または海水に窒素、リン酸等の栄養塩、ビタミン類、微量元素を添加したものを用いることができる。また培養は、光照射条件下で行い、照射方法は連続照射、光周期照射で行うことができる。このようにして培養した藻類からフコキサンチンを常法に従い抽出する。この時、遠心分離した藻体を乾燥後、フコキサンチンを抽出することでより簡便に抽出を行える。
また、オクロモナス属の微細藻類は、糖などの有機物で増殖することができるため光を照射しなくても藻体を増殖させることができる。オクロモナス属以外微細藻類で糖などの有機物で生育する微細藻類への展開も可能である。例えば、珪藻綱のニッチア属なども用いることができる。
また本発明は、オクロモナス属の微細藻類を、糖を含む有機物を含有する培地で培養することにより、６ｇ/Ｌ以上の乾燥藻体の乾燥藻を得るフコキサンチンの製造方法に関する。通常、グルコースなどの有機物なしで微細藻類を培養すると微細藻類の培養密度が３ｇ／Ｌ以上になると藻体密度により光の透過性が悪くなるため、光強度を高める必要がある。また、光強度をあげると水温の制御が困難になるなどの問題がある。有機物で培養すると有機物を栄養として増殖するので光照射をすることなしに６ｇ/Ｌ以上の乾燥藻体を容易に得ることができる。
また、オクロモナス属の微細藻類は、糖などの有機物で増殖することができるため光を照射しなくても藻体を増殖させることができる。オクロモナス属以外微細藻類で糖などの有機物で生育する微細藻類への展開も可能である。例えば、珪藻綱のニッチア属なども用いることができる。
また本発明は、オクロモナス属の微細藻類を、糖を含む有機物を含有する培地で培養することにより、６ｇ/Ｌ以上の乾燥藻体の乾燥藻を得るフコキサンチンの製造方法に関する。通常、グルコースなどの有機物なしで微細藻類を培養すると微細藻類の培養密度が３ｇ／Ｌ以上になると藻体密度により光の透過性が悪くなるため、光強度を高める必要がある。また、光強度をあげると水温の制御が困難になるなどの問題がある。有機物で培養すると有機物を栄養として増殖するので光照射をすることなしに６ｇ/Ｌ以上の乾燥藻体を容易に得ることができる。
微細藻からフコキサンチンを抽出するための溶剤は、フコキサンチンを抽出できるものであれば特に限定されないが、酢酸メチル、酢酸エチル、アセトン、クロロホルム、トルエン、等用いることができる。例えばメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール等のアルコール類、メチルエチルケトン、アセトン等のケトン類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、クロロホルム等の有機塩素系炭化水素、ヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン等の芳香属炭化水素類等の有機溶媒を単独あるいは２種以上を組み合わせて用いることができる。この有機溶媒は、微細藻類の乾燥体に対し１:１００〜１００：１、好ましくは１:５０〜５０：１の割合で用いることができる。上記有機溶媒を用いる抽出は常法により行うことができ、例えば、有機溶媒としてエタノールを用いる場合であれば、０℃〜６０℃、好ましくは５℃〜４０℃の温度で、０．５時間〜１００時間、好ましくは１２時間〜７２時間抽出を行えば良い。また、抽出に当たっては、必要により、超音波、撹拌機等により撹拌を行っても良い。このようにして得られた有機溶媒抽出物をそのまま、あるいは残渣を除去後、液体高速クロマトグラフを用いてイオン交換クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーなどにより、フコキサンチンを分離、精製することができる。
また、前記有機溶媒抽出物をＨＰＬＣ等のクロマトグラフィーに付さずに用いることにより、高度不飽和脂肪酸とフコキサンチンの混合物を得ることができる。ここで言う高度不飽和脂肪酸とは、好ましくは炭素数が２０以上の高度不飽和脂肪酸であり、特にエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、またはドコサヘキサエン酸、あるいはこれらの混合物を含有するものである。
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
［培養例１］
黄金色藻の培養
黄金色藻綱に属するOchromonas danica CS-4株（国立環境研究所微生物系統保存施設から入手）を、ＪＭ培地(表1)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに２００ｍｌのＪＭ培地を入れて恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（明期１４時間、暗期１０時間）にて７日間培養した。
黄金色藻の培養
黄金色藻綱に属するOchromonas danica CS-4株（国立環境研究所微生物系統保存施設から入手）を、ＪＭ培地(表1)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに２００ｍｌのＪＭ培地を入れて恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（明期１４時間、暗期１０時間）にて７日間培養した。
［培養例２］
ピンギオ藻の培養
ピンギオ藻綱に属するPinguiochrysis pyriformis MBIC10782株（海洋バイオテクノロジー研究所から入手）は、ＩＭＫ培地(表２)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに１００ｍｌのＩＭＫ培地を入れシリコセン（信越ポリマー社製）をし、１ｍｌのガラスピペットをシリコセンに突き刺して試験管底部から通気撹拌した。この培養は恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（連続照射）、通気条件下pHをコントロールしながら７日間行った。培養の経時変化を図１に示す。
ピンギオ藻の培養
ピンギオ藻綱に属するPinguiochrysis pyriformis MBIC10782株（海洋バイオテクノロジー研究所から入手）は、ＩＭＫ培地(表２)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに１００ｍｌのＩＭＫ培地を入れシリコセン（信越ポリマー社製）をし、１ｍｌのガラスピペットをシリコセンに突き刺して試験管底部から通気撹拌した。この培養は恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（連続照射）、通気条件下pHをコントロールしながら７日間行った。培養の経時変化を図１に示す。
［培養例３］
珪藻の培養
珪藻綱に属するPhaeodactylum tricornutum CCAP 1052/1A株 (Culturecollection of algae and protozoa から購入)は、f/2 + Si培地(表３)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに２００ｍｌのＪＭ培地を入れて恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（明期１４時間、暗期１０時間）にて８日間培養した。
珪藻の培養
珪藻綱に属するPhaeodactylum tricornutum CCAP 1052/1A株 (Culturecollection of algae and protozoa から購入)は、f/2 + Si培地(表３)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに２００ｍｌのＪＭ培地を入れて恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（明期１４時間、暗期１０時間）にて８日間培養した。
［培養例４］
ハプト藻の培養
ハプト藻綱に属するPavlova pinguis AC19株 ( Microalgal Culture Collection University of Caen Basse-Normandieから購入)は、ＩＭＫ培地(表２)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに２００ｍｌのJM培地を入れて恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（明期１４時間、暗期１０時間）にて１０日間培養した。
ハプト藻の培養
ハプト藻綱に属するPavlova pinguis AC19株 ( Microalgal Culture Collection University of Caen Basse-Normandieから購入)は、ＩＭＫ培地(表２)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに２００ｍｌのJM培地を入れて恒温水槽中、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（明期１４時間、暗期１０時間）にて１０日間培養した。
[培養例５]
可溶性でんぷんを基質とした黄金色藻の培養
黄金色藻綱に属するOchromonas danica CS-4株（国立環境研究所微生物系統保存施設から入手）を、ＯＡ３０Ｓ培地(表４)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに１００ｍｌの０Ａ３０Ｓ培地を入れて、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（明期１４時間、暗期１０時間）にて７日間培養した。
可溶性でんぷんを基質とした黄金色藻の培養
黄金色藻綱に属するOchromonas danica CS-4株（国立環境研究所微生物系統保存施設から入手）を、ＯＡ３０Ｓ培地(表４)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに１００ｍｌの０Ａ３０Ｓ培地を入れて、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（明期１４時間、暗期１０時間）にて７日間培養した。
[培養例６]
グルコースを基質とした黄金色藻の培養
黄金色藻綱に属するOchromonas danica CS-4株（国立環境研究所微生物系統保存施設から入手）を、ＯＡ３０Ｇ培地(表４)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに１００ｍｌの０Ａ３０Ｇ培地を入れて振盪培養機（高崎科学）で２５℃，１００ｒｐｍで３日間、暗状態で培養後、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（明期１４時間、暗期１０時間）にて４日間培養した。
グルコースを基質とした黄金色藻の培養
黄金色藻綱に属するOchromonas danica CS-4株（国立環境研究所微生物系統保存施設から入手）を、ＯＡ３０Ｇ培地(表４)にて培養した。培養は、５００ｍｌ三角フラスコに１００ｍｌの０Ａ３０Ｇ培地を入れて振盪培養機（高崎科学）で２５℃，１００ｒｐｍで３日間、暗状態で培養後、２５℃、３００μｍｏｌ ｍ−２ Ｓ−１（明期１４時間、暗期１０時間）にて４日間培養した。
［抽出例］
フコキサンチンの抽出および定量
培養例１、２、３、及び４の培養液１００ｍｌをそれぞれ遠心分離し上清を除去した後、沈降した藻体を取り出して凍結乾燥機（富士医科産業社製）にて凍結乾燥した。この結果、乾燥藻体を０．２６４ｇ（培養例１）および０．４２７ｇ（培養例２）、０．２１３ｇ（培養例３）、０．１６２ｇ（培養例４）、０．７０２ｇ（培養例５）、０.６８１ｇ(培養６)を得た。次に、それぞれの乾燥藻体０．１ｇに３ｍｌのアセトンを加えボルティックスミキサーでよく撹拌し、フコキサンチンを抽出した。この抽出液をマイショリディスクH-13-5(東ソー社製)を用いて残渣を除いた後減圧濃縮し、定量用サンプルとした。フコキサンチンの定量は、TSKgel-ODS80Ts（東ソー社製、直径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）による高速液体クロマトグラフィー（SCL 10A：470nm；島津製作所社製，流速1.0m/分）により行い、フコキサンチン生産量、および数１に示される計算式を用いて生産性を求めた。なお、フコキサンチンの標準試薬は、和光純薬工業社製のフコキサンチンを用いた。
フコキサンチンの抽出および定量
培養例１、２、３、及び４の培養液１００ｍｌをそれぞれ遠心分離し上清を除去した後、沈降した藻体を取り出して凍結乾燥機（富士医科産業社製）にて凍結乾燥した。この結果、乾燥藻体を０．２６４ｇ（培養例１）および０．４２７ｇ（培養例２）、０．２１３ｇ（培養例３）、０．１６２ｇ（培養例４）、０．７０２ｇ（培養例５）、０.６８１ｇ(培養６)を得た。次に、それぞれの乾燥藻体０．１ｇに３ｍｌのアセトンを加えボルティックスミキサーでよく撹拌し、フコキサンチンを抽出した。この抽出液をマイショリディスクH-13-5(東ソー社製)を用いて残渣を除いた後減圧濃縮し、定量用サンプルとした。フコキサンチンの定量は、TSKgel-ODS80Ts（東ソー社製、直径４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）による高速液体クロマトグラフィー（SCL 10A：470nm；島津製作所社製，流速1.0m/分）により行い、フコキサンチン生産量、および数１に示される計算式を用いて生産性を求めた。なお、フコキサンチンの標準試薬は、和光純薬工業社製のフコキサンチンを用いた。
この結果、培養例１のOchromonas danica CS-4株のフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．５３８ｍｇであり、生産性は２．０３ｍｇ/L/日であった。同様に、培養例２のPinguiochrysis pyriformis MBIC10782株のフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．６４０ｍｇであり、生産性は３．９０ｍｇ/L/日であった。培養例３のPhaeodactylum tricornutum CCAP 1052/1Aのフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．５８３ｍｇであり、生産性は１．５５ｍｇ/L/日であった。培養例４のPavlova pinguis AC19のフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．７９２ｍｇであり、生産性は１．２８ｍｇ/L/日であった。培養例５のOchromonas danica CS-4株のフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．４２８ｍｇであり、生産性は４．２９ｍｇ/L/日であった。培養例６のOchromonas danica CS-4株のフコキサンチン生産量は乾燥藻体０．１ｇあたり０．４０９ｍｇであり、生産性は３．９８ｍｇ/L/日であった。また、Pinguiochrysis pyriformis MBIC10782株の抽出液に５％塩化水素メタノールを加え、９０℃で２時間反応させ、メタノリシスを行った。脂肪酸メチルエステルをヘキサンで抽出し、窒素ガスで濃縮した後にガスクロマトグラフィー(GC17A；島津製作所社製)で分析したところ、乾燥藻体０．１ｇあたりエイコサペンタエン酸が６．４ｍｇ含まれていた。
本発明により、効率的なフコキサンチンの製造方法、およびそれに用いるフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上、好ましくは１.０ｍｇ/Ｌ/日以上、さらに好ましくは２.０ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類が提供され、フコキサンチンの大量生産を可能とし、また、複雑な精製手段等を要せずに、高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンを得ることができる。
Claims (11)
- フコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上の微細藻類を培地で培養し、その培養藻体からフコキサンチンを分離、抽出することを特徴とする、フコキサンチンの製造方法。
- 培地が糖を含む有機物を含有する培地である請求項１に記載のフコキサンチンの製造方法。
- 微細藻類がピンギオ藻綱、黄金色藻綱、珪藻綱、またはハプト藻綱に属する微細藻類である、請求項１または２に記載のフコキサンチンの製造方法。
- ピンギオ藻綱に属する微細藻類がピンギオクリシス属（Pinguiochrysis）に属する微細藻類である、請求項３に記載のフコキサンチンの製造方法。
- 黄金色藻綱に属する微細藻類がオクロモナス属（Ochromonas）に属する微細藻類である、請求項３に記載のフコキサンチンの製造方法。
- 珪藻綱に属する微細藻類がファエオダクチラム属（Phaeoductylum）に属する微細藻類である、請求項３に記載のフコキサンチンの製造方法。
- ハプト藻綱に属する微細藻類がプレウロクリシス属（Pleurochrysis）またはパブロバ属（Pavlova）に属する微細藻である、請求項３に記載のフコキサンチンの製造方法。
- 請求項１ないし７のいずれか一項に記載のフコキサンチンの製造方法において、培養物からフコキサンチンを採取すると同時に高度不飽和脂肪酸を採取することを特徴とする、高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
- 高度不飽和脂肪酸が炭素数２０以上の高度不飽和脂肪酸である、請求項８に記載の高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
- 高度不飽和脂肪酸がエイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸のうちの少なくとも１種である、請求項９に記載の高度不飽和脂肪酸含有フコキサンチンの製造方法。
- 請求項１ないし７のいずれか一項に記載の製造方法に用いるためのフコキサンチンの生産性が０.５ｍｇ/Ｌ/日以上である微細藻類。
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