KR102647562B1 - 잔토필 및 지방산의 생산성을 증가시키는 미세조류그라시엘라 이멀소니 gegs21 배양방법 - Google Patents
잔토필 및 지방산의 생산성을 증가시키는 미세조류그라시엘라 이멀소니 gegs21 배양방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고부가 잔토필 및 지방산의 생산성을 증가시키는 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류 배양방법에 관한 것으로, 빛을 제공하지 않는 암배양 조건 하에 당을 첨가하고, 최적의 온도 및 pH를 찾아 바이오매스가 가장 많이 생산되며, 자가응집의 효율이 크고 잔토필 및 지방산의 생산성을 증가시키는 배양 방법을 제시하여 바이오연료, 건강기능식품, 사료, 화장품 및 의약품 원료로서의 가능성을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 미세조류 바이오매스와 잔토필 및 지방산의 생산성을 증가시키는 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 배양방법과 세포내 녹말 축적 유도를 통한 자체응집(auto-flocculation) 기술을 활용한 효과적인 수확방법을 제공한다.
산업 고도화에 따른 화석연료의 남용으로 이산화탄소 등 다량의 온실가스가 대기 중에 배출되어 지구온난화가 심화되고 있으며, 자원 고갈로 인한 다양한 문제들이 야기되고 있다. 이러한 문제 해결을 위해 제 3세대 바이오매스로 여겨지는 미세조류 바이오산업이 크게 주목을 받고 있다. 미세조류는 현미경적 크기의 광합성을 하는 작은 생물로 원핵생물인 남조류와 진핵생물인 녹조류, 규조류, 와편모조류, 착편모조류 등 상당히 넓은 분류군을 포함하고 있다. 미세조류는 광합성 효율이 육상식물보다 10배 이상 현저하게 높아 성장이 빠르고 대기 중 이산화탄소를 효율적으로 제거할 수 있다. 또한 육상식물과 달리 넓은 경작지를 필요로 하지 않고, 기존의 1세대 바이오매스인 곡물 및 농작물처럼 식량부족 문제를 일으키지 않는 등 다양한 장점을 가지고 있어 식품, 의약품, 화장품, 에너지 등 매우 다양한 산업에서 원료로 활용되고 있다. 실제로 스피루리나(Spirulina), 클로렐라(Chlorella), 듀나리엘라(Dunaliella) 등은 높은 성장속도와 생리활성을 가지고 있어 건강기능식품, 농업, 수산 생물의 먹이, 동물사료 등 상당히 다양한 분야에 적용되고 있으며 많은 제품들이 생산되고 있다. 미세조류는 카로테노이드, 지방산, 폴리페놀, 단백질, 다당류 등 인간이 필요로 하는 다양한 유용물질의 지속가능한 생산을 가능하게 하며, 특히 최근 항산화효능, 눈건강, 체지방감소 효능이 있다고 알려진 잔토필(xanthophyll)과 카로틴(carotene)을 포함하는 카로테노이드 및 혈행개선 효능을 보이는 오메가-3 지방산 등의 생리활성 물질 생산에 활용될 수 있어 이를 산업화하기 위한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
하지만 미세조류의 산업화는 낮은 바이오매스 생산성과 배양 이후 수확 공정에서 발생하는 많은 비용이 여전히 극복해야 할 과제로 여겨지고 있으며, 이를 해결하기 위해 유전공학, 대량배양시스템 설계, 미생물 상호작용 및 유기탄소원을 활용한 배양, 응집기술 등 다양한 기술들이 개발되어 왔다. 이러한 기술들 중 먼저 미세조류의 생산성을 높이기 위한 대표적인 방법으로 유기탄소원을 활용하여 어두운 암조건에서 배양하는 종속영양배양(heterotrophic cultivation) 방법이 산업적으로 실제 활용 되고 있다. 종속영양배양은 미세조류를 빛 공급이 없는 암조건에서도 배양이 가능하여 기존에 세균, 균류 등을 생산하는 산업용 발효조(fermenter)에 적용이 가능하며, 기존의 광합성을 이용한 배양보다 수십 배 이상 높은 바이오매스 생산성을 나타내므로 산업적으로 매우 유용하게 활용될 수 있다. 실제로 산업적으로 생산되고 있는 클로렐라(Chlorella)와 스키조키트리움(Schizochytrium) 미세조류들은 종속영양배양을 통해 생산되어 건강기능식품 등을 위해 공급되고 있다. 하지만 암조건에서도 잘 자랄 수 있는 종속영양배양이 가능한 미세조류 종은 상당히 제한적이므로 이러한 종속영양배양이 가능한 미세조류를 발굴하고 바이오매스와 고부가물질의 생산성을 평가하는 것은 산업적으로 상당히 중요하다고 할 수 있다.
바이오매스 생산성 이외에 산업화에 걸림돌이 되는 두 번째 주요 문제는 배양된 미세조류의 수확 과정에서 발생하는 높은 비용이라 할 수 있다. 이러한 수확 과정은 미세조류의 바이오매스 생산 비용의 약 20-30%를 차지하며 수로형 연못(raceway pond) 등을 활용한 옥외 대량배양 시설에서는 더 높은 비용이 요구된다. 이 문제를 해결하기 위해 다양한 미세조류 수확 기법이 연구되어 왔으며, 그중에 미세조류의 응집(flocculation) 현상을 이용한 수확방법이 주요 대안으로 제시되고 있다. 미세조류 세포표면은 인산그룹, 음이온을 나타내는 요소들로 인해 음전하를 띄고 있으며, 이러한 음전하를 물리적, 화학적, 생물학적인 방법으로 변화시켜 배양액 중 분산된 미세조류 세포들의 응집 및 침전 또는 분산을 유도시킬 수 있다. 또한 생물의 자체응집(auto-flocculation, 또는 자체 침전) 방법을 이용한 기술도 제시되어 왔으며, 이러한 자체응집 기술은 화학물질이나 생물제제의 첨가 없이 미세조류 자체의 응집 특성을 활용하는 방법이므로 품질 좋은 미세조류 바이오매스를 생산할 수 있다. 하지만 이러한 자체응집은 미세조류 종마다의 고유 특성에 기인하거나 기존에 제시되어 온 pH 조절 및 배지 조성 변경 방법은 대량 배양 시스템에 적용이 어려운 큰 단점을 가지며, 따라서 산업적으로 활용 가능한 효율적인 자체응집 기술은 여전히 제한적이라 할 수 있다.
1. Science of The Total Environment, Volume 807, Part 3, 150995(2021.10.16 공개)
본 발명의 목적은 미세조류의 경제적인 바이오매스 생산을 위해 (1) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)를 배양배지에 접종하는 단계; 및 (2) 상기 배양배지에 접종된 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 빛이 공급되지 않는 암조건하 28℃ 내지 32℃에서 6일 내지 8일간 배양하는 단계를 포함하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법을 제공하는데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)를 배양배지에 접종하는 단계; (2) 상기 배양배지에 접종된 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 빛이 공급되지 않는 암조건하 28℃ 내지 32℃에서 6일 내지 8일간 배양하는 단계; 및 (3) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 수확(harvesting)을 위해 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 세포내 녹말(starch) 축적 유도를 통한 세포의 비중 증가에 따른 자체응집 수확방법을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)를 배양배지에 접종하는 단계; 및 (2) 상기 배양배지에 접종된 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 빛이 공급되지 않는 암조건하 28℃ 내지 32℃에서 6일 내지 8일간 배양하는 단계를 포함하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)를 배양배지에 접종하는 단계; (2) 상기 배양배지에 접종된 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 빛이 공급되지 않는 암조건하 28℃ 내지 32℃에서 6일 내지 8일간 배양하는 단계; 및 (3) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 수확(harvesting)을 위해 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 세포내 녹말(starch) 축적 유도를 통한 세포의 비중 증가에 따른 자체응집 수확방법을 제공한다.
본 발명은 바이오매스, 고부가 잔토필(xanthophyll) 및 지방산(fatty acid)의 생산성을 증가시키는 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 배양방법에 관한 것으로, 빛을 제공하지 않는 암조건 하에 유기탄소원(organic carbon source)과 효모추출물(yeast extract)을 첨가하고, 최적의 온도, 염도 및 pH 조건을 찾아 바이오매스가 가장 많이 생산되는 배양방법을 제공하고 있으며, 녹말의 축적 유도를 적용한 새로운 개념의 미세조류 바이오매스 회수 기술을 보여주고, 잔토필 및 지방산의 생산성을 증가시키는 배양 방법과 효율적인 미세조류 수확방법을 동시에 제공하여 식품, 건강기능식품, 동물사료, 바이오에너지, 농업용 비료, 의약품 및 화장품 등의 다양한 바이오산업에서 미세조류 원료생산에 활용될 수 있다.
도 1은 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류를 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 2A는 상업적으로 활용되고 있는 4종의 농업용 관주비료를 이용하여 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류를 배양했을 때 얻을 수 있는 바이오매스 생산성 결과이며, 도 2B는 가장 성장이 높게 나타난 선별된 농업용 관주비료(SF2)의 농도에 따른 미세조류의 바이오매스 생산성을 나타낸 결과이다.
도 3A는 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 암배양 최적화를 위해 다양한 단당류 및 이당류가 포함된 배지에서 24-웰 플레이트를 이용하여 7일간 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류를 배양했을 때 미세조류 바이오매스 생산성을 나타낸 결과이며, 도 3B는 가장 높은 성장을 나타낸 포도당(glucose)를 농도별로 처리하여 암배양 했을 때 바이오매스 생산성을 나타낸 결과이다.
도 4는 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류 배양시 최적 NaCl농도, 온도, pH 및 효모추출물(yeast extract, YE) 농도를 나타낸 결과이다.
도 5는 광배양과 암배양 조건에서 IMAGING PAM으로 분석한 광화학 반응의 최대 양자수율(Fv/Fm) 값(A)과 형광이미지(B) 및 전자전달효율(C,D)을 측정하여 광합성 효율을 확인한 결과이다.
도 6은 광배양과 종속영양배양 조건에서 녹말의 축적량을 광학현미경(A,B) 및 투과전자현미경(C,D)을 이용하여 확인한 결과이다. A 및 C는 광배양 조건에서 촬영한 것이고 B 및 D는 종속영양배양 조건에서 촬영한 것이다.
도 7은 광배양, 혼합영양배양 및 종속영양배양 조건에서 각각 배양한 미세조류 바이오매스의 분말 색깔과 녹말의 함유량을 분석한 결과이다.
도 8은 광배양, 혼합영양배양 및 종속영양배양 조건에서 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 자가응집 효율(flocculation efficiency)(A)과 미세조류의 침전에 의해 형성되는 투명한 클리어 존(clear zone)의 비율(B) 및 실제 침전된 모습의 사진(C) 결과이다.
도 2A는 상업적으로 활용되고 있는 4종의 농업용 관주비료를 이용하여 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류를 배양했을 때 얻을 수 있는 바이오매스 생산성 결과이며, 도 2B는 가장 성장이 높게 나타난 선별된 농업용 관주비료(SF2)의 농도에 따른 미세조류의 바이오매스 생산성을 나타낸 결과이다.
도 3A는 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 암배양 최적화를 위해 다양한 단당류 및 이당류가 포함된 배지에서 24-웰 플레이트를 이용하여 7일간 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류를 배양했을 때 미세조류 바이오매스 생산성을 나타낸 결과이며, 도 3B는 가장 높은 성장을 나타낸 포도당(glucose)를 농도별로 처리하여 암배양 했을 때 바이오매스 생산성을 나타낸 결과이다.
도 4는 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류 배양시 최적 NaCl농도, 온도, pH 및 효모추출물(yeast extract, YE) 농도를 나타낸 결과이다.
도 5는 광배양과 암배양 조건에서 IMAGING PAM으로 분석한 광화학 반응의 최대 양자수율(Fv/Fm) 값(A)과 형광이미지(B) 및 전자전달효율(C,D)을 측정하여 광합성 효율을 확인한 결과이다.
도 6은 광배양과 종속영양배양 조건에서 녹말의 축적량을 광학현미경(A,B) 및 투과전자현미경(C,D)을 이용하여 확인한 결과이다. A 및 C는 광배양 조건에서 촬영한 것이고 B 및 D는 종속영양배양 조건에서 촬영한 것이다.
도 7은 광배양, 혼합영양배양 및 종속영양배양 조건에서 각각 배양한 미세조류 바이오매스의 분말 색깔과 녹말의 함유량을 분석한 결과이다.
도 8은 광배양, 혼합영양배양 및 종속영양배양 조건에서 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 자가응집 효율(flocculation efficiency)(A)과 미세조류의 침전에 의해 형성되는 투명한 클리어 존(clear zone)의 비율(B) 및 실제 침전된 모습의 사진(C) 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 목적은 미세조류의 경제적인 바이오매스 생산을 위해 (1) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)를 배양배지에 접종하는 단계; 및 (2) 상기 배양배지에 접종된 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 빛이 공급되지 않는 암조건하 28℃ 내지 32℃에서 6일 내지 8일간 배양하는 단계를 포함하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법을 제공한다.
상기 (1) 단계의 배양배지는 농업용 비료를 포함할 수 있다.
상기 농업용 비료는 질소(N), 인(P) 및 칼륨(K)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 (1) 단계에서 유기탄소원 또는 효모추출물이 공급될 수 있다.
상기 유기탄소원은 프룩토스(fructose), 글루코스(glucose), 마노스(mannose) 및 수크로스(sucrose)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 글루코스(glucose)는 3g/L 내지 18g/L일 수 있다.
상기 효모추출물은 이스트추출물일 수 있다.
상기 배양배지는 pH 6 내지 pH 9일 수 있다.
상기 배양방법은 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 자가응집 효율이 증가할 수 있다.
상기 배양방법은 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 잔토필 생산을 증가시킬 수 있다.
상기 잔토필은 네오잔틴(neoxanthin), 루테인(lutein) 및 제아잔틴(zeazanthin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양방법은 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 지방산 생산을 증가시킬 수 있다.
상기 지방산은 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 알파-리놀레산(alpha-linoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (1) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)를 배양배지에 접종하는 단계; (2) 상기 배양배지에 접종된 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 빛이 공급되지 않는 암조건하 28℃ 내지 32℃에서 6일 내지 8일간 배양하는 단계; 및 (3) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 수확(harvesting)을 위해 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 세포내 녹말(starch) 축적 유도를 통한 세포의 비중 증가에 따른 자체응집 수확방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시 예 1> 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류 채집 및 형태 관찰
1. 채집
그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류는 금강 하구둑 부근의 기수(Brackish water)지역에서 해수를 채집하여 분리하였으며, 채집 당시의 염분은 21psu, 수온은 18.4℃였다. 채집장소는 강과 바다가 만나는 지역으로 염분이 해수보다 상대적으로 낮으며, 유기물질 및 영양염류가 풍부하여 생물다양성이 높은 지역이었다. 채집장소에 대한 좌표는 36°0′8.2″N, 126°45′10.8″E 에 해당했다.
2. 광학 현미경
그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 형태학적으로 살펴보기 위해 광학현미경을 이용하여 미세조류를 관찰하였다. 광학현미경의 관찰을 위해 CKX53 도립현미경(Olympus, JAP)을 사용하였다.
그 결과, 도 1에 따르면, 배양된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류는 거의 구형에서 타원형의 모양을 보였고, 세포는 다양한 크기를 나타내었지만 직경은 8.8 내지 14.4μm(평균 직경:12μm, n=20)였다.
<실시 예 2> 농업용 관주비료를 활용한 성장 테스트
미세조류를 산업적으로 활용하기 위해서는 대량배양이 필요하며 대량배양에활용되는 배지성분은 많은 비용이 소요되므로, 현재 시중에 판매되고 있는 다양한 농업용 관주비료(물에 녹는 비료)가 미세조류 배양에 활용될 수 있는지 확인하기 위해 관주비료 Agrosol(SF1, Agrosol-Irrigation fertilizer, Water soluble, AGROBIZ Corp.), Nutrivit(SF2, 초기생육용, MatarTarim, Netherland), S-feed (SF3, High-N, 팜한농, Korea) 및 Smarto(SF4, 생육초기용, BeluckeyAgricultural Chemical, China)를 각각 1g/L로 증류수에 녹여 미세조류를 106cells/mL로 초기 세포농도를 설정하여, 6-웰 플레이트에서 28℃, 130μE의 광도 및 150rpm의 진탕배양 조건에서 배양하여 성장실험을 진행하였다. 바이오매스 분석의 경우 미세조류 배양액 10mL를 원심분리하여 동결건조기를 이용하여 24시간 동결건조한 후, 동결건조체의 무게를 미세저울로 측정하였으며, 바이오매스 생산성(Biomass productivity)을 계산하였다.
일주일(7일)간 배양하여 배양액의 바이오매스를 분석한 결과, 도 2A에 따르면, 바이오매스 생산성이 Nutrivit(SF2)에서 가장 높게 나타났으며, S-feed(SF3), Smarto(SF4), Agrosol(SF1)순으로 나타났다. 또한 기존에 미세조류 배양배지로 많이 쓰이는 BG-11 배지와 비교했을 때 관주비료 사용시 더 높은 바이오매스 생산성을 나타내었음을 확인하였다.
관주비료 테스트 결과 Nutrivit(SF2)가 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 성장 및 바이오매스 생산에 가장 적합한 비료임을 확인하였으며, 최적농도를 확인하기 위해 0~5g/L의 다양한 농도로 비료를 증류수에 녹여 미세조류 성장을 분석하였다. 배양조건은 위와 동일하였으며, 50 mL 조직 배양 플라스크(Tissue culturing flask)를 이용하여 25mL을 총 용량으로 150rpm의 교반속도로 배양하였다.
그 결과, 도 2B에 따르면, 미세조류와 Nutrivit비료 1g/L 이상의 다양한 농도에서 거의 동일한 바이오매스 생산성을 나타냈음을 확인하였다. 그러나, 2g/L 이상으로 비료를 처리했을 경우 침전물이 발생하는 현상이 발견되었음을 확인하여, 1g/L의 Nutrivit가 적합하다고 판단되어 1g/L의 비료 농도를 최적 조건으로 확인하였다.
<실시 예 3> 미세조류 종속영양배양을 위한 최적 당(탕수화물) 스크리닝
미세조류의 종속영양배양(Heterotrophic cultivation)이 가능한지, 또한 어떠한 탄소원이 종속영양배양에 적합한지 확인하기 위해 다양한 유기탄소(프룩토스(fructose), 푸코스(fucose), 갈락토스(galactose), 글루코스(glucose), 락토스(lactose), 말토스(maltose), 마노스(mannose), 람노스(rhamnose), 아세트산나트륨(sodium acetate, SA), 수크로스(sucrose), 자일로스(xylose)) 및 음성대조군으로 무기탄소 탄산수소나트륨(sodium bicarbonate, SB)을 1g/L의 동일한 농도로 맞추어 미세조류를 배양하여 바이오매스 생산성을 스크리닝하였다. 스크리닝을 위해 24-웰 플레이트를 이용하였으며 미세조류를 105cells/mL로 처리하여 28℃ 어두운 암조건에서 7일간 배양하여 바이오매스 생산성을 확인하였다. 바이오매스는 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 600nm에서 흡광도값을 측정하여 미리 만들어 놓은 미세조류 건중량-흡광도의 검량선에 적용하여 그 양을 계산하여 구하였으며, 도출된 바이오매스(g/L)양을 바탕으로 단위시간 당 바이오매스 생산성(g/L/d)을 계산하였다.
그 결과, 도 3A에 따르면, 프룩토스(fructose), 글루코스(glucose), 마노스(mannose) 및 수크로스(sucrose)가 포함된 배지에서 그라시엘라 이멀소니 GEGS21가 암조건에서 종속영양배양이 되는 것을 확인하였으며, 그 중 가장 성장이 높게 나타났고 산업적으로 많이 활용되며, 가격이 저렴한 글루코스(glucose)를 사용하여 암배양 최적화를 진행하였다. 이후 선별된 유기탄소인 글루코스(glucose)를 농도별(0~18g/L)로 처리하여 미세조류를 암조건에서 배양한 결과, 도 3B에 따르면, 바이오매스 생산성이 글루코스(glucose) 12g/L에서 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이를 통해 Nutrivit 1g/L와 글루코스(glucose) 12g/L를 녹인 배지를 활용하여 암배양 조건에서의 염도, pH 및 온도에 대한 최적화를 진행하였다.
<실시 예 4> 종속영양배양 조건에서 바이오매스 생산량 증대를 위한 최적의 배양조건 확인
1. 염도
암조건의 종속영양배양시 미세조류의 최적 염도 조건을 구하는 실험을 진행하였다. 먼저 Nutrivit를 1g/L와 12 g/L의 글루코스를 녹인 배지에 0~0.5M의 NaCl을 처리하여 미세조류를 106cells/mL로 접종하고 25mL의 T-Flask에서 용량으로 미세조류를 배양하였으며, 배양조건은 온도의 경우 28℃, 150rpm의 셰이킹을 주며 어두운 암조건에서 7일간 배양을 진행하였다. 그 결과, 도 4A에 따르면, 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 암배양시 최적 NaCl농도는 0M인 것을 확인하였다.
2. 온도
암조건의 종속영양배양시 미세조류의 최적 온도조건을 구하기 위해, 먼저 Nutrivit 1g/L 및 글루코스 12 g/L를 녹인 배지에 미세조류를 106cells/mL로 접종하고 25 mL의 T-Flask에서 20~40℃로 미세조류를 배양하였으며, 어두운 암조건에서 7일간 배양을 진행하였다. 그 결과, 도 4B에 따르면 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 암배양시 최적 온도는 30℃인 것을 확인하였다.
3. pH
암조건의 종속영양배양시 미세조류의 최적 pH 조건을 구하는 실험을 진행하였다. 먼저 Nutrivit 1g/L 및 글루코스 12 g/L를 녹인 배지를 만들었으며, 배양과정에서 pH의 변화를 막기 위해 트리스(Tris)를 1g/L로 처리하여 1M의 NaOH와 HCl용액 및 pH 전극을 이용하여 pH를 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 각각 맞추었다. 이후 미세조류를 106cells/mL로 접종하여 40mL의 T-Flask에 25mL의 용량으로 미세조류를 배양하였으며, 배양조건은 온도의 경우 30℃, 150rpm의 셰이킹을 주며 어두운 암조건에서 6일간 배양을 진행하였다.
그 결과, 도 4C에 따르면, pH 8에서 가장 높은 성장을 나타내었다. 따라서 미세조류의 암배양 최적조건은 염도 0M, 온도 30℃, pH는 8로 확인되었다.
4. 효모 추출물 농도
이후 설정된 위와 같이 최적 종속영양배양 조건에서 효모 추출물 농도에 따른 미세조류의 성장 변화를 Personal Bioreactor(Biosan, Korea)를 이용하여 실험하였으며, 그 결과 도 4D에 따르면, 1g/L에서 가장 높은 바이오매스 생산성을 나타냈으며, 효모추출물을 넣지 않은 것보다 2배 이상의 높은 바이오매스 생산성을 보였다.
<실시 예 5> 광배양과 종속영양배양(암배양) 조건에서 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 광합성 효율 비교
광배양과 종속영양배양 조건에서 10일간 배양한 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 광합성 효율 차이를 IMAGING-PAM Chlorophyll Fluorescence System (WALZ, Germany) 장비를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 도 5에 따르면, Fv/Fm(광화학 반응의 최대 양자수율) 값이 광배양조건에서 배양한 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류가 더 높은 수치를 나타내는 것을 확인하였으며, Fv/Fm의 형광 이미지도 광배양(Photoautotrpophic, PA)과 암배양(Heterotrophic, HT)에서 확연한 차이를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 또한 광합성에 의한 광에너지의 세포내 전자전달률(electron transfer rate, ETR)값 또한 광배양(C)일 때 암배양(D)보다 훨씬 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 암배양으로 최적화 된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 경우 광합성 효율이 현저하게 떨어지고 광합성 기작이 아닌 유기탄소원의 흡수 기작을 통한 성장이 일어나는 것을 확인하였다.
또한, 광배양과 암배양 조건에서 배양한 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 광학현미경사진과 투과전자현미경 사진을 확인해 본 결과, 도면6에 따르면, 광배양 조건일 때에는 광합성을 수행하는 세포소기관인 엽록체(Chloroplast)가 세포 내부구조에 많은 부분을 차지한다는 것을 확인할 수 있었지만, 암배양 조건에서는 세포 내부에 유기탄소원을 흡수하여 저장하는 형태인 녹말(Starch) 성분이 크게 증가하고, 엽록체는 거의 없어진 것을 확인할 수 있었다. 또한 실제 녹말의 양을 분석 키트인 Starch (GO/P) Assay Kit (Merck, USA)를 이용하여 분석한 결과, 도면7에 따르면 암배양 조건에서 가장 높은 녹말을 함유하고 있었으며 유기탄소원 흡수와 광배양이 동시에 일어나는 혼합영양배양조건에서는 두 번째로 많은 녹말을 축적하였고, 광배양 조건에서는 가장 적은양의 녹말을 함유하고 있다는 사실을 확인할 수 있었다. 또한, 녹말의 축적이 많아짐에 따라 바이오매스의 색이 녹색에서 황색으로 변화되는 것을 관찰할 수 있었다.
이를 통해, 암배양 조건에서 광합성 효율이 현저하게 감소한 이유는 이러한 엽록체의 구조적인 축소와 더불어 녹말의 축적량이 크게 증가하기 때문이라는 사실을 알 수 있었다.
<실시 예 7> 배양 조건에 따른 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 자가응집 효율 비교
미세조류 배양액에서 바이오매스를 회수하는데 원심분리, 전기적 기법 등을 활용할 수 있으나, 이러한 생물 공정은 많은 비용이 소모되기 때문에 이를 해결하기 위해 다양한 응집 기술(flocculation technology)이 개발되고 있다, 이러한 응집 기술의 종류로는 화학물질을 이용한 응집 기술(Chemical-flocculation)과 박테리아 등을 활용한 생물 응집 기술(bio-flocculation)등이 있으나, 세균 또는 화학물질의 혼재 등으로 인한 인체 독성 및 특성변화 등 다양한 우려가 있으므로 가장 효율적인 응집방법은 미세조류가 스스로 응집 또는 침전하는 현상인 자가응집(auto-flocculation)을 활용한 미세조류 회수 기술이라 할 수 있다.
녹말의 경우 물보다 비중이 높아 물에서 침전되는 현상을 나타내므로, 미세조류 세포내 녹말 축적 증가 현상이 미세조류 배양액 내에서 자가응집(auto-flocculation)을 촉진시켜 미세조류 바이오매스 회수에 활용될 수 있는지 확인하였다. 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류 배양액을 잘 섞어 250rpm에서 1분간 잘 믹싱 해준 뒤 멸균된 100mL 용량의 눈금실린더에 넣어 20~30분간 침전되는 정도를 확인하였다. 응집률 분석은 눈금실린더의 윗부분에서 3cm의 깊이에서 10분 간격으로 샘플을 획득하여, 마이크로플레이트 리더기(BioTeK, USA)를 이용하여 흡광도를 750nm에서 분석하였다.
그 결과, 도 8A에 따르면, 광배양 조건(Photoautotroph)과 혼합영양배양 조건(Mixotroph)및 암배양 조건(Heterotroph)에서 배양한 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 자가응집 효율이 세포내 녹말의 축적량이 가장 많은 순서인 암배양> 혼합영양배양> 광배양 순으로 높게 나타나는 것을 확인하였다.
그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류는 침전 정도를 확인하기 위해 배양액 윗부분에 투명한 부분인 클리어 존(Clear zone)의 길이(length)를 육안으로 분석하여 총 길이 대비 퍼센테이지를 구하였다.
그 결과, 도 8B에 따르면, 클리어 존이 암배양(Heterotrophic)> 혼합영양배양(Mixotrophic)> 광배양(Photoautotrophic) 순으로 높은 값을 나타내어, 침전률이암배양에서 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 시간에 따른 광배양(P), 혼합영양배양(M), 암배양(H) 조건에서 배양된 미세조류를 잘 섞어 100mL 용량의 눈금실린더에 같은 세포수(7 x 106cells/mL)로 맞춰 넣고 시간에 따른 자가응집(auto-flocculation) 정도를 10분 간격으로 사진을 찍어 확인하였다,
그 결과, 도 8C에 따르면, 20분 이내에 암배양 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 침전이 완료되는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 암배양 최적화 조건이 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류의 바이오매스 회수에도 효율적임을 확인할 수 있었으며, 이러한 현상은 녹말의 축적이 증가함에 따른 것임을 알 수 있었다.
<실시 예 8> 암배양 최적조건에 따른 잔토필 및 지방산의 생산
1. 잔토필
광배양, 암배양 조건에서 배양한 미세조류의 광합성 색소함량을 비교 분석하였다. 광합성 색소는 HPLC-DAD(Agilent 1260, Germany)를 이용하여 분석하였으며, 용매A 및 용매B 두개를 이용하여 Gradient 조건으로 분석하였다. 먼저 용매 A의 경우 0.1 M의 트리스(Tris), 아세토나이트릴(Acetonitrile) 및 메탄올(Methanol)을 14:82:2로 섞은 용액을 제조하였으며, 용매 B의 경우 메탄올(Methanol), 에탈 아세테이트(Ethyl acetate)를 68:32로 섞어 제조하였다. 이후 용매를 1시간 동안 음파처리하여 녹아있는 기포를 제거해 주었으며, 칼럼은 Waters Spherisorb® 5.0 umODS2(4.6mm x 250mm) 컬럼을 사용하여 40℃에서 카로테노이드의 경우 445nm 및 클로로필의 경우 670nm 파장에서 각각 분석을 진행하였다. 유량은 1.2mL/min으로 설정하였고 10uL로 주사하여 25분간 분석을 진행하였다. 경사 조건은 다음과 같았다. 0분: 용매 A 100%, 15분: 용매 B 100%, 18분: 용매 B 100%, 19분: 용매 A 100%, 25분: 용매 A 100%. 광합성 색소의 정량을 위해 DHI사에서 액상형태로 나온 카로티노이드 표준 용액(DHI, USA)을 활용하여 검량선을 만들어 분석된 피크의 영역값을 비교하여 색소를 정량하였다.
그 결과, 하기 표 1과 같이 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류는 네오잔틴(neoxanthin), 루테인(lutein) 및 제아잔틴(zeaxanthin)과 같은 잔토필을 생산하는 미세조류임을 확인하였으며, 광배양 조건에서 주요 카로테노이드 색소의 생산성은 네오잔틴(neoxanthin), 루테인(lutein) 및 β-카로틴(β-carotene)이 각각 0.157, 0.112, 0.065mg/L/d였고, 암배양 조건에서는 β-카로틴(β-carotene)은 검출되지 않았으나, 네오잔틴(neoxanthin) 및 루테인(lutein) 생산성이 각각 0.134 및 0.404 mg/L/d로, 루테인(lutein) 생산성이 더 높게 나타났다.
| 색소 | 양(mg/g) | 바이오매스 생산량 (mg/L/d) |
색소 생산량 (mg/L/d) |
|
| 광배양 | 네오잔틴 | 2.645 | 0.059 | 0.157 |
| 비올라잔틴 | 0.676 | 0.040 | ||
| 루테인 | 1.879 | 0.112 | ||
| 제아잔틴 | 0.520 | 0.031 | ||
| 클로로필-베타 | 12.236 | 0.727 | ||
| 클로로필-알파 | 49.999 | 2.970 | ||
| 알파-카로틴 | 0.504 | 0.030 | ||
| 베타-카로틴 | 1.100 | 0.065 | ||
| 암배양 | 네오잔틴 | 0.122 | 1.096 | 0.134 |
| 루테인 | 0.369 | 0.404 | ||
| 제아잔틴 | 0.099 | 0.109 | ||
| 클로로필-베타 | 0.499 | 0.547 | ||
| 클로로필-알파 | 1.310 | 1.436 | ||
2. 지방산
미세조류의 지방산(Fatty acid) 조성은 5975C mass selective detector가 장착된 7890A gas chromatograph(Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 조지질을 추출하여 헥세인으로 에스테르화 반응 이후 DB-FFAP 컬럼(30m, 250μmID, 0.25μmfilm thickness; Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 분석을 진행하였다. GV 오븐 온도는 50℃에서 시작하여 1분간 유지시켰으며, 온도는 200℃까지 분당 10℃씩 30분간 상승시킨 후 240℃까지 분당 10℃씩 상승시켜 20분간 유지시켰다. 시료는 20:1의 분할비로 1μl를 주입하였으며, 헬륨을 운반 가스로 1ml/min의 유속으로 흘려주었다. 질량분석은 다음의 조건으로 분석하였다. 시료 온도: 250℃, source 온도: 230℃, electron impact mode는 70eV의 가속 전압이 acquisition range 50-550 mㆍz-1에서 시료의 이온화를 위해 사용되었다. 지방산의 동정은 Wiley/NBS libraries의 질량 분석과 비교하여 match값이 90% 이상이 되는 결과만 유효한 것으로 판정하였다.
지방산 조성 분석 결과, 하기 표 2와 같이 그라시엘라 이멀소니 GEGS21의 경우 팔미틱산(Palmitic acid), 올레산(Oleic acid), 리놀렌산(Linoleic acid) 및 알파-리놀렌산(Alpha-linolenic acid)이 지방산 구성의 대부분을 차지하고 있음을 확인할 수 있었고, 광배양과 암배양 조건에서 축적되는 지방산 조성이 달라지는 것을 확인하였다. 먼저 팔미틱산(Palmitic acid)과 오메가-9 지방산인 올레산(Oleic acid)의 경우 암배양에서 높은 함량을 나타내었고, 오메가-6 지방산에 해당하는 리놀렌산(linoleic acid)와 Omega-3 지방산에 속하는 알파-리놀렌산(Alpha-linolenic acid)의 경우 광배양 조건에서 함량이 높게 나타났다. 따라서 암배양 조건에서 미세조류를 배양할 경우 바이오매스 생산성과 더불어 올레산(Oleic acid), 팔미틱산(Palmitic acid) 및 카로테노이드인 루테인(lutein)의 생산성을 크게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
| 지방산(w/w,%) | 배양 종류 | |
| 광배양 | 암배양 | |
| 팔미틱산 | 27.57 ± 0.01 | 33.42 ± 0.05 |
| 스테아르산 | 0.57 ± 0.01 | 3.24 ± 0.02 |
| 올레산 | 22.15 ± 0.05 | 35.36 ± 0.02 |
| 리놀레산 | 26.32 ± 0.02 | 18.11 ± 0.03 |
| 감마-리놀렌산(GLA) | 0.99 ± 0.01 | 0.38 ± 0.01 |
| 알파-리놀렌산(ALA) | 22.12 ± 0.02 | 7.81 ± 0.04 |
| 에이코센산 | 0.30 ± 0.02 | 1.69 ± 0.01 |
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (14)
- (1) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)를 배양배지에 접종하는 단계; 및
(2) 상기 배양배지에 접종된 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 빛이 공급되지 않는 암조건하 28℃ 내지 32℃에서 6일 내지 8일간 배양하는 단계를 포함하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 (1) 단계의 배양배지는 농업용 비료를 포함하는 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 2에 있어서,
상기 농업용 비료는 질소(N), 인(P) 및 칼륨(K)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 (1) 단계에서 유기탄소원 또는 효모추출물이 공급되는 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 4에 있어서,
상기 유기탄소원은 프룩토스(fructose), 글루코스(glucose), 마노스(mannose) 및 수크로스(sucrose)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 5에 있어서,
상기 글루코스(glucose)는 3g/L 내지 18g/L인 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 4에 있어서,
상기 효모추출물은 이스트추출물인 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 배양배지는 pH 6 내지 pH 9인 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 배양방법은 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 자가응집 효율이 증가하는 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양방법은 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 잔토필 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 10에 있어서,
상기 잔토필은 네오잔틴(neoxanthin), 루테인(lutein) 및 제아잔틴(zeazanthin)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배양방법은 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 지방산 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법. - 청구항 12에 있어서,
상기 지방산은 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 알파-리놀레산(alpha-linoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 배양방법 - (1) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)를 배양배지에 접종하는 단계;
(2) 상기 배양배지에 접종된 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 빛이 공급되지 않는 암조건하 28℃ 내지 32℃에서 6일 내지 8일간 배양하는 단계; 및
(3) KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21)의 수확(harvesting)을 위해 KCTC15115BP로 기탁된 그라시엘라 이멀소니 GEGS21 미세조류(Graesiella emersonii GEGS21) 세포내 녹말(starch) 축적 유도를 통한 세포의 비중 증가에 따른 자체응집 수확방법.
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| KR1020230089536A KR102647562B1 (ko) | 2023-07-11 | 2023-07-11 | 잔토필 및 지방산의 생산성을 증가시키는 미세조류그라시엘라 이멀소니 gegs21 배양방법 |
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-
2023
- 2023-07-11 KR KR1020230089536A patent/KR102647562B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 1. Science of The Total Environment, Volume 807, Part 3, 150995(2021.10.16 공개) |
| Ki, Hyunji, et al. "Simultaneous Optimization of Biomass Yield and Starch-Mediated Autoflocculation of the Chemoheterotrophic Microalga Graesiella Emersonii Gegs21".Available at SSRN 4457451(2023.05.2* * |
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