CN107384800B - 克莱曼都普帝藻(chlamydopodium sp.)和其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可在不同材质上生长形成生物膜，且产生高量三酸甘油脂的经分离克莱曼都普帝藻(Chlamydopodium sp.)。本发明还涉及所述经分离克莱曼都普帝藻(Chlamydopodium sp.)于生产生质燃料和食用油上的用途。

Description

克莱曼都普帝藻(CHLAMYDOPODIUM SP.)和其用途

技术领域

本发明涉及新颖克莱曼都普帝藻(Chlamydopodium sp.)分离株，所述分离株可在不同材质上生长形成生物膜，且可利用生物膜培养模式进行培养，以减少对水资源及土地的需求，并简化采收流程，降低采收成本。所述分离株可产生高量的三酸甘油酯，可做为生产生质柴油及食用油的原料。

背景技术

自18世纪工业革命以来，人类对石化能源的需求与日俱增，然而石化能源的天然蕴藏量有限，因此逐渐需要寻求新的替代能源。第一代生质能源是以甘蔗、甜菜、玉米、大豆等粮食作物做为原料，利用水解、发酵及转酯化(transesterification)等技术来制造生质能源，但会造成农耕地需求上升、粮食作物价格上昂等问题；第二代生质能源是以稻杆、玉米杆、木屑及蔗渣等非粮食作物为原料，利用纤维素水解等技术来制造生质能源，但此类生质能源具有原料来源有限、处理成本过高等问题；第三代生质能原是起源于公元1970年能源危机爆发时，美国所推动的藻类生质柴油开发计划，以藻类为主要原料，利用油脂萃取、氢化(hydrogenation)及转酯化等技术来制造生质能源。

微藻(microalgae)属于一种单细胞藻类，其细胞大小介于几微米(μm)到几百微米，一般无法以肉眼直接观察，需利用显微镜辅助观察。微藻的分布范围非常广泛，在淡水、海洋或潮湿的土壤中皆可发现其踪迹，据估计，地球上大约有20万到80万种微藻，其中已发现并有记录的仅有3万5千种，其生物多样性非常复杂，无论是以基础研究或是开发的角度而言，为一个几乎未积极开发的领域。

微藻具备生长速度快、二氧化碳利用率高、可高密度培养、受病菌污染机率较小及所需土地面积较小等优点，并可在短时间内蓄积大量的生物质，可作为生产生质柴油、生物乙醇及生物氢等生质燃料的原料。此外，微藻可使用非农耕地、苦咸水、工厂排放的废水及烟道气等进行培养，大大减少了土地与淡水的需求，从而减少与粮食及经济作物的资源竞争。加上其细胞结构简单且缺乏细胞分化，相较于棕榈、油菜、大豆及甘蔗等产油作物，其操作性较植物细胞更为简易，且具有与植物相似的醣化后转译修饰机制以利细胞基因表现(颜H.W.等人，基于微藻的生物精炼-从生质燃料到自然产物，生物资源技术，2013，135:166-174(Yen,H.W.et al.,Microalgae-based biorefinery–From biofuels to naturalproducts.,Bioresour.Technol.,2013,135:166-174))。

目前，微藻生物质中所含的醣类(如藻多醣)、蛋白质(如类胡萝卜素(carotenoid)及藻胆蛋白(phycobilin))及脂质(如三酸甘油脂、二十碳五烯酸(EicosapentaenoicAcid；EPA)及二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid；DHA)等，已被广泛应用于医疗保健、美容、食品加工、水产养殖及生物能源等产业中(斯波劳雷P.,等人,微藻类的商业应用,.生物科学及生物工程杂志,2006,101:87-96(Spolaore,P.et al.,Commercial applicationsof microalgae.,J.Biosci.Bioeng.,2006,101:87-96))。

生长快速、产油量高的藻种是制备微藻生质燃料的基础。微藻生长需要光、二氧化碳、水、氮、磷及钾等要素，其养殖方式包含自营、异营及混营培养等，自营培养是指微藻利用光源及无机碳(如二氧化碳)行光合作用得到生长所需的能量；异营培养是指微藻在无照光的条件下，利用培养基中的有机碳作为碳源(如醋酸钠、葡萄糖)来生长；混营培养则是指微藻可同时进行自营及异营生长。一般而言，微藻的藻体量大约每6到72小时会增加1倍，微藻生长的速度越快，其可采收的频率越高，然而，通常含油量较高的藻种生长速度较含油量较低的藻种来的慢。不同的培养方式及培养基成份对微藻生长速度、油脂的累积、产率及组成也会产生不同程度的影响(多普S.及达万V.，氮浓度对于Monoraphidium sp.脂质产率及脂肪酸组合物的影响，生物资源技术，2014，152:572-575(Dhup,S.&Dhawan,V.,Effect ofnitrogen concentration on lipid productivity and fatty acid composition ofMonoraphidium sp.,Bioresour.Technol.,2014,152:572-575))。此外，当培养条件不利于微藻生长时(如氮剥夺)，反而常会促使微藻将所吸收的碳转变成油脂累积起来(格里菲思M.J.及哈里森S.T.,作为选择用于生质柴油产生的藻类物种的重要特征的脂质产率,应用藻类学杂志,2009,21:493-507(Griffiths M.J.&Harrison S.T.,Lipid productivity asa key characteristic for choosing algal species for biodiesel production.,Journal of Applied Phycology,2009,21:493-507))。

微藻所产的藻油主要由三酸甘油脂、各式脂肪酸及固醇类所组成，然而，并非所有微藻所产的藻油皆适合用于制备生质燃料，其中所含脂肪酸的不饱和程度(degree ofunsaturation)及三酸甘油脂的比例，也会影响所述藻油是否适合用于制备生质燃料。因此，有研究指出藻油的脂肪酸图谱可作为筛选藻种的指标(拉莫斯,M.J.,等人,原料的脂肪酸组成对生质柴油特性的影响.生物资源技术,2009,100:261-268(Ramos,M.J.et al.,Influence of fatty acid composition of raw materials on biodieselproperties.,Bioresour.Technol.,2009,100:261-268)。

目前以微藻作为生质能源的原料，其生产成本与技术上仍有待克服与突破的地方，以自营培养模式为例，微藻自营培养主要是将微藻悬浮培养于培养液中，然而，目前仍无法将培养液中藻体浓度提升到1％以上。此外，由于培养液中藻体浓度低且微藻细胞相当地微小，使得在养殖结束后，要将微藻从培养液中浓缩分离出来并进行干燥脱水，变得相当费时耗能，造成藻体的采收成本可占全部生产成本的20～30％。因此，目前仍需要生长快速、生物质产率高、藻油含量高、藻体易于回收等特点的优良藻种。

发明内容

本发明是于中国台湾台北三芝采集到含微藻的水样样品后，以C培养基进行微藻的培养与分离，选取出可产生藻油，且经鉴定为克莱曼都普帝藻(Chlamydopodium sp.)的AA013藻株，经藻油含量、脂肪酸图谱及油脂组成等分析，发现所述AA013藻株可作为制造生质能源及食用油的潜力藻种。此外，AA013藻珠可贴附生长于不同材质的载体表面上，形成生物膜，可以生物膜培养模式生产藻油，在藻体采收时仅需将载体表面的藻体刮取下来，即可得到高浓度的藻泥，可简化微藻养殖过程中的采收流程，并降低生产成本。

因此，本发明的一个目的是在于提供一种克莱曼都普帝藻分离株，所述克莱曼都普帝藻分离株的培养产物可用作生产生质柴油及食用油的原料。

本发明的另一目的是在于提供一种培养所述克莱曼都普帝藻分离株以获得克莱曼都普帝藻培养产物的方法。

本发明的另一目的是在于提供一种由上述方法所获得的克莱曼都普帝藻培养产物。

本发明的另一目的是在于提供一种由上述克莱曼都普帝藻培养产物中获得三酸甘油酯的方法。

本发明在以下部分中详细描述。本发明的其他特征、目的及优点可易见于本发明的实施方式及申请专利范围中。

附图说明

图1为AA013藻株的显微镜检图。图1A为明视野观察，细胞直径约为5～15μm，显微倍率1,000X；图1B为以Nile Red染色，以荧光显微镜观察，藻体内部有黄色的油滴分布，显微倍率1,000X。

图2为AA013藻株18S rDNA序列的演化树分析图。

图3为AA013藻株ITS区域序列的演化树分析图。

图4为AA013藻株在不同培养温度(20℃、25℃、30℃及40℃)下的生长结果。

图5为AA013藻株在不同pH值(pH4、pH7.5及pH9)的C培养基中的生长结果。

图6为AA013藻株在含有不同盐度(0‰(w/v)、15‰(w/v)及30‰(w/v))的C培养基中的生长结果。

图7为AA013藻株生长于不同材质的贴附载体的贴附与含油情形。组别A为各种不同材质的贴附载体；组别B为AA013藻株贴附于各载体的生长情形；组别C为贴附于各载体的藻体的显微镜明视野观察图，显微倍率为400X；组别D为贴附于各载体的藻体经Nile red染色后的荧光显微镜观察图，显微倍率为400X。

图8为不同生长方式下的AA013藻株经Nile Red染色的荧光显微镜检图，显微倍率400X。图8A为贴附生长的AA013藻株；图8B为悬浮生长的AA013藻株。

具体实施方式

本发明可通过下述实施方式中所公开的各个发明方面、实施例及表列的相关叙述所了解。除非在本文中另作定义，否则与本发明关联使用的术语(包含技术及科学术语)应具有本发明所属技术领域的技术人员所了解的含义。且当可了解，除非本文中提供的定义另作说明，在任何潜在歧义的情况下，术语的定义应与所述普遍使用的术语(如词典中所定义)一致。可进一步了解，本案所使用的术语仅用作描述特定实施方面的目的，而非用于限定。

必须注意的是，除非有清楚的相反指示，于说明书或权利要求书使用的单数格式“一种”及“所述”还包含复数表示。因此，除非上下文另有需要，单数术语应包含复数，而复数术语还包含单数。

本发明的范围以“自一“约”特定数值及/或到另一“约”特定数值”表示。当范围由上述方式表示时，其包含自一特定数值及/或到另一特定数值的范围。同样地，当数值可通过术语“约”以表示近似值，将可了解其为一特定值的另一个方面。可进一步了解，当提及有关其它端点及其它端点本身而言，每一范围的两端点都为有意义的。根据本发明，“约”可表示±20％，优选地为±10％，更优选地为±5％。

于本发明中，术语“经分离”或“分离”意谓使物质自其原始环境(如果天然存在那么为天然环境)中移出。术语“经分离”或“分离”并不一定指物质经纯化者。

本发明的目的一在于提供一种克莱曼都普帝藻分离株，其包含与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有至少95％相似度的18S rDNA区域序列，且与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有至少95％相似度的ITS区域序列。换句话说，所述克莱曼都普帝藻分离株中的18SrDNA序列与SEQ ID NO:1所示核苷酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或100％的相似度，且ITS区域序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列具有95％、96％、97％、98％、99％或100％的相似度。

两个核酸序列间的差异可出现于参考核苷酸序列的5'或3'末端位置处，或个别散布于参考序列中的核苷酸当中，或散布于参考序列内的一或多个邻近基团中的那些末端位置的间的任何地方。任何特定核酸分子是否与参考核苷酸序列95％、96％、97％、98％、99％或100％相似是指使用所属领域中所熟知的标准算法在两个分子的间所进行的比较，且可常规使用公开可用的计算机程序(如BLASTN算法)来判定。

于本发明的一个优选实施方面中，所述克莱曼都普帝藻分离株为保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016152的藻株，或为与保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016152的藻株具有实质上完全相同特征的变异株。

上述“变异株”意谓涵盖全体细胞遗传组成已通过如化学突变诱发、自发突变、遗传工程、转化或转染而改变，以致影响其物理或生物化学特性的任何克莱曼都普帝藻株。然而，所述变异株应具有保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016152的藻株的所有识别特征。

本发明的另一目的在于提供一种制备克莱曼都普帝藻培养产物的方法。于本发明的实施方面中，所述方法其包含将本发明的克莱曼都普帝藻分离株接种于液态培养基中，在照光及通气下进行培养以获得所述培养产物。于本发明的优选实施方面中，所述方法包含将本发明的克莱曼都普帝藻分离株与载体共同培养于液态培养基中，在照光及通气下进行培养以获得所述培养产物，其中所述克莱曼都普帝藻分离株与所述载体是分别加入所述液态培养基中，或先将所述克莱曼都普帝藻分离株接种于所述载体上后，再将经接种的载体加入所述液态培养基中。

本文中所谓「培养产物」意旨将微藻培养于培养基中后，所获得富含微藻细胞的产物，而所述培养产物中的微藻细胞不必须与所述培养基分离，且所述培养产物可呈液态、固态或黏稠状。

本发明中所述用于培养克莱曼都普帝藻分离株的“液态培养基”可为任何容许克莱曼都普帝藻分离株生长、繁殖并制造三酸甘油酯及/或脂肪酸的水性培养基，例如C培养基[每100mL中包含15mg Ca(NO₃)₂·4H₂O、10mg-20mg KNO₃、5mgβ-甘油磷酸二钠·5H₂O、4mgMgSO₄·7H₂O、0.01μg维生素B12、0.01μg生物素(Biotin)、1μg噻胺HCl、0.3mL PIV微量元素溶液(每100mL中包含100mg Na₂EDTA·2H₂O、19.6mg FeCl₃·6H₂O、3.6mg MnCl₂·4H₂O、1.04mg ZnCl₂、0.4μg CoCl₂·6H₂O、0.25μg Na₂MoO₄·2H₂O及水)、50mg三羟甲基氨基甲烷(Tris)及水]、BG-11培养基[每100mL包含1,500mg NaNO₃、40mg K₂HPO₄、75mg MgSO₄·7H₂O、27.18mg CaCl₂、6mg柠檬酸、6mg柠檬酸铁铵、1mg Na₂·Mg·EDTA·2H₂O、20mg Na₂CO₃、2.86mg HBO₃、1.181mg MnCl₂·4H₂O、0.222mg ZnSO₄·7H₂O、0.39mg Na₂MoO₄·2H₂O、0.0718mg CuSO₄·5H₂O、0.049mg Co(NO₃)₂·6H₂O及水]，以及MA培养基[每100mL中包含10mgCa(NO₃)₂·4H₂O、10mg KNO₃、5mg NaNO₃、4mg Na₂SO₄、5mg MgCl₂·6H₂O、10mg β-甘油磷酸二钠·5H₂O、0.5mg Na₂EDTA·2H₂O、0.05mg FeCl₃·6H₂O、0.5mg MnCl₂·4H₂O、0.05mg ZnCl₂、0.5mg CoCl₂·6H₂O、0.08mg Na₂MoO₄·2H₂O、2mg H₃BO₃及50mg N-二甘氨酸(Bicine)]。

本发明中用于培养克莱曼都普帝藻分离株的条件意指如培养基的pH值、培养温度、照光、通气条件及培养时间等条件，其可容许所述克莱曼都普帝藻分离株生长、繁殖并制造三酸甘油酯及/或脂肪酸。本技术领域的人士可根据既有知识针对培养基的成分及培养条件作调整。

于本发明的实施方面中，用于培养克莱曼都普帝藻的液态培养基的pH值可为约pH2.5到约pH10(例如约pH2.5、约pH3、约pH3.5、约pH4、约pH4.5、约pH5、约pH5.5、约pH6、约pH6.5、约pH7、约pH7.5、约pH8、约pH8.5、约pH9、约pH9.5或约pH10)，优选地为约pH4到约pH9。

于本发明的实施方面中，克莱曼都普帝藻培养温度可为约15℃到约45℃(例如约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃或约50℃)，优选地为约20℃到约40℃；且照光量可为约100lux到约4,000lux，优选地为约2,000lux的亮度持续照光。

本文中所谓“通气”意旨于液体培养基中持续地通入含有二氧化碳的空气，而通气量可为约0.05vvm到约1vvm，优选地为约0.1vvm到约0.5vvm，更优选地为约0.1vvm。所述空气中的二氧化碳的浓度可为约0.04％(v/v)到约10％(v/v)，优选地为约0.1％(v/v)到约5％(v/v)。

本文中所谓「载体」意指可供克莱曼都普帝藻贴附及/或固定于其表面上并生长的任何基质，其包括(但不限于)网状物质(例如，纤维滤纸、棉布、麻布、滤布、木浆布、不织布、牛仔布及碎花布)、泡棉(例如，聚乙烯醇(PVA)泡棉)或其任意的组合；所述载体可呈任何形状，包括(但不限于)片状、球形、环状、螺旋体、正方体、长方体及多边体。

本文中所谓「生物膜」意指由本发明的克莱曼都普帝藻细胞所聚集而形成的膜状群落。

本发明制备克莱曼都普帝藻培养产物的方法中，可视需要包含分离所述培养产物的步骤，而所述分离步骤可为如离心、过滤、聚集凝结及/或将生物膜从载体上刮下收集等常规的方法步骤。

本发明还提供由上述方法所获得的培养产物。本发明的培养产物中富含三酸甘油酯及/或脂肪酸，特别是三酸甘油酯，可用作获得三酸甘油酯的原料，进而可用于制造生质燃料及食用油。有研究指出，微藻在贴附生长下所产生的油脂量仅占藻体干重10％(w/w)以下，远低于悬浮生长所产生的油脂量(格罗斯M.及闻Z.，整年评估试验规模的旋转式藻类生物膜(RAB)培养系统，生物资源技术，2014，171:50-58(Gross,M.&Wen,Z.,Yearlongevaluation of performance and durability of a pilot-scale Revolving AlgalBiofilm(RAB)cultivation system,Bioresource Technol.,2014,171:50–58)；及瑟拜斯汀P.等人，微藻在基于光生物反应器的新生物膜下的生物质及脂质生成，年轻生物技术学家国际学会，2014，塞格德(Sebestyén,P.et al.,Biomass and lipid production bymicroalgae in a new biofilm based photobioreactor,Young BiotechnologistNational Conference,2014,Szeged))。然而，本发明的克莱曼都普帝藻分离株于贴附培养下的藻体含油量为26.13％，远高于一般藻株于贴附培养下的藻体含油量。

本文中的“三酸甘油酯”意旨具有1个甘油分子及3个脂肪酸分子的酯类化合物，其中所述3个脂肪酸分子可具有完全相同、部份相同或完全相异的碳数及不饱和键。

本文中的“脂肪酸”意旨具有8到30个碳原子及0到6个不饱和键的羧酸化合物，其优选地为具有12到20个碳原子及0到5个不饱和键的羧酸化合物，更优选地为具有16到18个碳原子及0到3个不饱和键的羧酸化合物。

三酸甘油酯及脂肪酸的获得可使用本技术领域所熟知的任何萃取及分离方法，例如福尔奇(Folch)等人(生物化学杂志(The Journal of biological Chemistry),1956,23:497-509)、巴拉苏布拉马连(Balasubramanian)等人(生物资源技术,2011,102:3396-3403)及萨迦拉塔(Sajilata)等人(食品工程杂志(Journal of Food Engineering),2008,84:321–326)的方法。简而言之，所述方法可包含将克莱曼都普帝藻细胞以如研磨法或超音波法等方式击碎，通过适当的溶剂萃取克莱曼都普帝藻细胞中的三酸甘油酯及/或脂肪酸，再通过如HPLC及/或离子交换树脂的技术获得三酸甘油酯及/或脂肪酸。

本文所述的所有公开案、专利及专利文献均以全文引用的方式并入本文中。

提供以下实例以辅助所属领域的技术人员实施本发明。即使如此，不应将所述实例视为本发明的限制，因为本发明所属技术领域的技术人员在不背离本发明的精神或范围的情况下对本文所讨论的实施例进行的修改及变化，而仍属于本发明的范围。

实施例

材料与方法

1.C培养基

依序加入Ca(NO₃)₂·4H₂O 15mg、KNO₃ 10mg、β-甘油磷酸二钠·5H₂O 5mg、MgSO₄·7H₂O 4mg、维生素B12 0.01μg、生物素(Biotin)0.01μg、噻胺(Thismine)HCl 1μg、PIV微量元素溶液0.3mL与Tris(hydroxymethyl)aminomethane 50mg，随后将其体积补水到100mL，调整pH到7.5后进行高压灭菌。如果为1.5％(w/v)洋菜固体培养基那么需加入15g的洋菜胶一同灭菌。

PIV微量元素溶液的配制为依序加入Na₂EDTA·2H₂O 100mg、FeCl₃·6H₂O 19.6mg、MnCl₂·4H₂O 3.6mg、ZnCl₂ 1.04mg、CoCl₂·6H₂O 0.4μg与Na₂MoO₄·2H₂O 0.25μg，随后将其体积补水到100mL后进行高压灭菌。

2藻样采集、分离与培养

取中国台湾台北三芝养殖池的水样样品约10ml置于50ml离心管中，加入约30mL C培养基，于25℃下照光培养。培养期间以显微镜观察是否有藻体生长，之后取出适量含藻体的培养液，将其转到平板培养基，于25℃下照光培养。待藻体生长后取单一藻种将其于平板培养基中涂开，以上步骤需重复到筛到单一藻体为止。平板培养则取单一藻落涂到C培养基平板上，于25℃下照光培养。大量培养则自平板培养基上刮取新鲜培养的单一藻体，添加到C液态培养基中，使其培养液吸光值(OD_682nm)约达0.1～0.15，并于25℃照光通气培养。

3.油脂染色分析

将培养好的藻体取20μL与1μL尼罗红(于二甲基亚砜中0.1mg/mL)混合以进行油滴染色，染色后于室温静置5分钟，再利用荧光显微镜进行观察。(陈,W.等人,用于定量测量微藻类中的中性脂质的高产量尼罗红方法,微生物学方法杂志,2009,77:41–47(Chen,W.etal.,A high throughput Nile Red method for quantitative measurement of neutrallipids in microalgae.,Journal of Microbiological Methods,2009,77:41–47)及黄,G.H.,等人,基于尼罗红荧光在藻类中产生脂质的快速筛选方法,生物质与生物能源,2009,33:1386-1392(Huang,G.H.,et al.,Rapid screening method for lipid production inalga based on Nile Redfluorescence.,Biomass and bioenergy,2009,33:1386-1392))。

4.藻种的分子鉴定

4.1藻体基因体(genomic)DNA的抽取

自平板刮取下新鲜培养的藻体，将其收集在2mL微量离心管中，依照ZYMORESEARCH的ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep^TM试剂盒说明书操作取得基因体DNA，并以NanoDrop(ND-1000分光亮度计)检测DNA的浓度。

4.2 PCR增幅

将藻体基因体DNA作为PCR模板，以18S rRNA与ITS区域(包含18S核糖体RNA的后端、内转录间隔区1、5.8S核糖体RNA、内转录间隔区2与28S核糖体RNA的前端等序列)的相关引物组(http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)来增幅其基因片段。PCR反应溶液如下：适量的基因体DNA溶液作为PCR模板、10mM dNTP 3μL、10X PCR缓冲液4μL、5′端引物与3′端引物各0.5μL及Taq酵素5U。PCR反应条件为96℃，5分钟；(96℃，30秒、50℃，20秒、72℃，3分钟)共40次循环；72℃，10分钟；最后保持在4℃。取5μL产物进行电泳跑胶分析。

4.3定序分析

将PCR产物纯化后以适当引物(http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)进行定序，将序列结果以Vector NTI Suite 9软件(VNTI)与NCBI/Blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列重组与序列相似性比对分析。另，分别将定序所得的结果经NCBI/Blastn后所得相近的藻株还有藻属，以及数个藻种中心较接近的藻珠及藻属列为比较范围，进行演化树分析，以MEGA 6.0做比对，接着利用最大概似法(Maximum Likelyhood)以GTR+G+I的方式绘制演化树，Bootstrap则为100次。

5.藻种培养特性分析

5.1培养温度

测试AA013藻株在不同培养温度下的生长耐受性。取适量藻体接种于C培养基平板上，分别于20℃、25℃、30℃与40℃等不同温度下进行照光培养，之后于培养第7天及第14天观察藻体在不同温度的生长情形。

5.2培养pH值

测试AA013藻株在不同培养pH值下的生长耐受性。制备pH4、pH7.5及pH9的C培养基平板，分别取适量藻体接种于不同pH值的C培养基平板上，以25℃进行照光培养，于培养第7天及第14天观察藻体生长情形。

5.3培养盐度

测试AA013藻株在不同培养盐度下的生长耐受性。首先制备含有0‰(w/v)、15‰(w/v)及30‰(w/v)盐度的C培养基平板，作法为添加海水素(佳欣，中国台湾)到C培养基中，并充分溶解后，以盐度计(ATAGO CO.,LTD，MASTER-S/Millα，日本)量测盐度，培养基再以高温高压灭菌后制成平板。分别取适量藻体接种于各盐度培养基平板上，以25℃进行照光培养，于培养第7天及第14天观察藻体生长情形。

5.4藻体贴附培养

观察AA013藻株于9种不同材质的载体上的生长贴附情形。所测试的载体包含：(1)纤维滤纸；(2)棉布a；(3)滤布；(4)木浆布；(5)棉布b；(6)不织布；(7)牛仔布；(8)碎花布及(9)聚乙烯醇(PVA)。将不同载体分别与AA013藻株置于C培养基中，以75rpm的转速共同振荡培养21天后，将载体取出观察藻体的贴附情形，并将贴附于载体上的藻体以Nile red染色，室温静置2分钟后，以荧光显微镜观察。

6.藻体分析

6.1藻体含油量分析

收集藻体后将其冷冻干燥成藻粉，秤取定量的藻粉，萃取其油脂。油脂萃取方法参考修饰Folch等人的方法(福尔奇,J.等人,从动物组织分离及纯化总脂质的简单方法,生物化学杂志,1957,23:497-509(Folch,J.et al.,Asimple method for the isolation andpurification of total lipids from animal tissue.,The Journal of biologicalChemistry,1957,23:497-509))来进行，其过程为取30mg冷冻干燥的藻粉(A值)到2mL微量离心管，加入约2.0mL氯仿/甲醇(v:v＝2:1)与适量大颗玻璃珠，以撞击式细胞破碎仪(

MM400)振荡约5分钟，重复两次。以10,000rpm离心5分钟后，取上清液到抛弃式15mL离心管中，随即于2mL微量离心管内加入约2.0mL氯仿/甲醇(v:v＝2:1)，再以超音波振荡与离心，取上清液到抛弃式15mL离心管中，直到萃取液无色为止。于装有萃取液的15mL离心管中加入等体积的145mM NaCl溶液后，以试管旋转混合器混和均匀后，经4,500rpm离心10分钟，以玻璃吸管取下层液体到已秤重的玻璃瓶(B值)中。将此玻璃瓶内液体隔夜风干再秤重(C值)，计算藻干含油量的百分比(D值)。藻干含油量计算公式:

6.2脂肪酸图谱分析

刮取适量干燥藻体置于玻璃试管中，加入1mL溶液I(NaOH 45g、甲醇150mL及ddH₂O150mL)，震散藻体。于100℃加热5分钟，再将所有藻体震散，继续加热25分钟。加入2mL溶液II(6N HCl 325mL及甲醇200mL)，于80℃加热10分钟，完成后迅速冷却。加入1.25mL溶液III(己烷200mL、三级丁基甲基醚200mL)，缓慢混合10分钟，以玻璃吸管尖吸取下层液体并丢弃。将上层液体加入3mL溶液IV(NaOH 10.8g及ddH₂O 900mL)，混合5分钟后，吸取上层液体以GC/MS(HP 5973GC/MS System)分析其脂肪酸含量。GC/MS分析方法参考2007年巴伦西亚(Valencia),I.等人的方法(巴伦西亚,I.等人,用油从微藻类裂殖壶菌属产生富含二十二碳六烯酸的干燥发酵香肠：对营养特性、感觉质量及氧化稳定性的影响,食物化学,2007,104:1087-1096(Valencia,I.et al.,Development of dry fermented sausages rich indocosahexaenoic acid with oil from the microalgae Schizochytrium sp.:Influence on nutritional properties,sensorial quality and oxidationstability.,Food Chemistry,2007,104:1087-1096))，GC/Mass分析条件为：毛细管管柱:SP-2560，75m×0.18mm I.D.，0.14μm；注入口温度:250℃；离子源温度:250℃；管柱烘箱温度:起始温度140℃，保持5分钟后以4℃/min的升温速率升温到240℃，保持2分钟；载送气体：氦；管柱流量:40cm/sec，在175℃下；待分析样品注射体积:1μL；分流比:1/100；脂肪酸标准品:37-Component FAME Mix(Cat.18919-1AMP,西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))。设定好条件后，先分析标准品确认图谱正确后再进行样品分析。分析完成的结果整理在表格中以方便比对。

6.3油脂组成分析

将抽取的藻油样品以HPLC分析其油脂组成，HPLC分析条件：分离管柱为德国默克(Merck)公司制造的硅胶(Silica gel)(4.6mm id×250mm,颗粒大小5μm)；冲提溶剂A为己烷；冲提溶剂B为己烷/乙酸乙酯/异丙醇(80：10：10(v/v))，在0分钟溶剂A/B为98：2(v/v)，在8分钟线性增加到溶剂A/B为50：50(v/v)，在8.5分钟线性增加到溶剂A/B为2：98(v/v)，15分钟维持相同梯度，20分钟线性减少到溶剂A/B为98：2(v/v)；流速：1.2mL/min；蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector；ELSD)条件：气体流量2.6L/min；蒸发器温度为40℃(詹国靖等人，以甘油与植物油利用脂解酶的转酯化反应生产1,3-双酰甘油。中国台湾农业化学与食品科学，2010，45:19-25)。

7.藻体贴附培养的产油效率分析

将藻体以悬浮培养的方式大量培养后，将藻液浓度调整到其吸光值(OD_682nm)为0.5，再取30～40ml的藻液，以抽气过滤的方式将藻体固定于干燥并完成称重的0.45μm的硝酸纤维/乙基纤维膜表面，记录滤纸干重(W_P)，取一组空白组进行冷冻干燥，扣除滤纸干重后，记录培养前的藻体干重(W_AI)。取经无菌处理过的吸水载体(如海棉、厚滤纸…等)，置于无菌平板底部，加入适量培养液使其维持湿润，再将含固定化藻体的滤纸平放到吸水载体上方，将平板置于夹链袋中防止水份蒸发流失，并以30℃进行24小时照光培养。培养14天后，将含固定化藻体的滤纸自平板中取出以冷冻干燥方式将藻体干燥后，称重，并扣除滤纸干重，记录培养后的藻体干重(W_AF)。完成藻体称重后，将藻体自载体表面刮下进行含油量分析，记录贴附藻体含油量(OC_A)。计算藻体生物质产率及油脂含量的计算公式为：

P_AB＝(W_AF-W_AI)/A/T

P_AO＝OC_A×P_AB

P_AB：贴附培养的藻体生物质产率(g/m²/day)

P_AO：贴附培养的藻体油脂产率(g/m²/day)

W_AF：藻体贴附培养后的干重(g)

W_AI：藻体贴附培养前的干重(g)

A：藻体贴附培养的面积(m²)

T：藻体贴附培养的天数(day)

OC_A：贴附培养的藻体含油量(％)(w/w)

实例一、藻株鉴定

于中国台湾台北三芝的养殖池水样样品中，分离纯化得到AA013藻株。以显微镜(1,000X)观察其形态，发现AA013藻株以非群聚的单一藻体存在，细胞呈圆形，依其藻体培养天数的不同，细胞直径约为5～15μm(图1A)。经尼罗红染色后，以荧光显微镜观察到藻体内部有大量明显且呈黄色的油滴分布，显示其藻体内可以蓄积油滴(图1B)。

将AA013藻株的18S rDNA及ITS区域进行DNA定序，分别得到长度1732bp的18SrDNA序列(SEQ ID NO:1)及长度674bp的ITS序列(SEQ ID NO:2)。将所述等序列分别与NCBI的nr数据库比对后，发现以下5株藻株(1)Rhopalosolen saccatus SAG 26.95(保藏编号KM020179.1)；(2)Chlamydopodium starrii SAG 16.87(保藏编号AB983625.1)；(3)Characium saccatum(保藏编号M843195.1)；(4)Characium vacuolatum(保藏编号M63001.1)；及(5)Chlorococcum sp.CCAP 11/52(保藏编号FR865591.1)的序列与AA013藻株的18S rDNA序列(SEQ ID NO:1)具有高达99％的相似度。另，发现以下4株藻株(1)Chlamydopodium starrii SAG 16.87(保藏编号AB983644.1)；(2)Chlorococcum tatrense(保藏编号HQ404882.1)；(3)Chlorococcum tatrense(保藏编号HQ404881.1)；及(4)Macrochloris rubrioleum(保藏编号AB983643.1)的序列与AA013藻株的ITS序列(SEQ IDNO:2)具有86％的相似度。

此外，抽取自德国藻种中心(Culture Collection of Algae at

University；SAG)所购入的Rhopalosolen saccatus SAG 26.95的基因体DNA，将其ITS区域进行DNA定序，并将所得长度为679bp的ITS序列(SEQ ID NO:3)与AA013藻株的ITS序列(SEQID NO:2)进行序列比对分析，发现其相似度为86％。

进一步以AA013藻株的18S rDNA及ITS序列进行演化树比对分析，结果显示AA013藻株的18S rDNA序列(SEQ ID NO:1)与Rhopalosolen saccatus SAG 26.95(保藏编号KM020179.1)及Chlamydopodium starrii SAG 16.87(保藏编号AB983625.1)(川崎Y.、中田T.及富田M.，油面绿球藻(团藻目、绿藻纲)及其亲缘的分类修订，藻类学杂志，2015，51(5):1000-1016(Kawasaki,Y.,Nakada,T.&Tomita,M.,Taxonomic revision of oil-producinggreen algae,Chlorococcum oleofaciens(Volvocales,Chlorophyceae),and itsrelatives.,J.Phycol.,2015,51(5):1000-1016))最为接近，而与其他绿球藻(Chlorococcum)属的藻株分属不同演化树分支(图2)。此外，AA013藻株的ITS序列与Chlamydopodium starrii SAG 16.87(保藏编号AB983644.1)及Rhopalosolen saccatusSAG 26.95最为接近，而与其他绿球藻(Chlorococcum)属的藻株分属不同演化树分支(图3)。由上述序列比对分析结果显示，AA013藻株可能属于克莱曼都普帝藻(Chlamydopodium)属，但与Chlamydopodium starrii分属不同种的藻株。

由于AA013藻株的形态与Chlamydopodium starrii(川崎Y.、中田T.及富田M.，油面绿球藻(团藻目、绿藻纲)及其亲缘的分类修订，藻类学杂志，2015，51(5):1000-1016)及Rhopalosolen saccatus SAG 26.95极为不同，因此，综合其形态与分子鉴定的结果，初步鉴定AA013藻株应属于Chlamydopodium sp.，且极可能为一新种，命名为Chlamydopodiumsp.AA013。

Chlamydopodium sp.AA013已于2016年3月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为：中国武汉市武昌珞珈山，保藏编号为CCTCC M 2016152。

实例二、AA013藻株的培养条件

(1)培养温度测试

结果显示在20℃、25℃、30℃及40℃的培养温度下，AA013藻株于C培养基平板上可持续且明显的生长(图4)。据此，AA013藻株可生长在约20℃到约40℃的温度范围中。

(2)培养基pH值测试

结果显示AA013藻株在pH4、pH7.5及pH9的C培养基平板上可持续且明显的生长(图5)。据此，AA013藻株可生长在约pH4到约pH9的环境中。

(3)培养基盐度测试

结果显示AA013藻株在盐度0‰(w/v)的C培养基平板中，有持续且明显的生长，然而在盐度15‰(w/v)及30‰(w/v)的培养基中并未观察到有藻体生长的情形(图6)。因此，AA013藻株可生长在盐度为0‰(w/v)的环境中。

实例三、AA013藻株的贴附培养

将AA013藻株分别与以下9种不同材质的载体:(1)纤维滤纸；(2)棉布a；(3)滤布；(4)木浆布；(5)棉布b；(6)不织布；(7)牛仔布；(8)碎花布；及(9)聚乙烯醇(PVA)共同培养，以测试其贴附性。结果显示，上述9种载体皆可被AA013藻株所贴附，且大部份藻体皆生长于载体上(图7)。此外，将贴附于各载体上的藻体以Nile red染色后，以荧光显微镜观察，发现藻体内有大量的油滴分布(图7)。

实例四、AA013藻株的油脂含量及组成分析

将AA013藻株与纤维滤纸载体以75rpm的转速照光振荡培养，在25℃下培养21天后，将AA013藻株于载体表面形成的生物膜及培养液中的悬浮藻体以尼罗红染色，结果显示生物膜的藻体油脂含量(图8A)高于悬浮藻体中的油脂含量(图8B)。

分别将AA013藻株悬浮培养于1L的C培养基中及与纤维滤纸贴附培养，并于30℃照光培养14天后，收集藻体将其冷冻干燥成藻粉，秤取定量的藻粉萃取其油脂，分析其藻体含油量、油脂及脂肪酸组成。结果显示悬浮生长的AA013藻体含油量为21.5％(w/w)，而相较于一般藻株其藻体含油量在贴附生长时会较悬浮生长时下降到10％的状况(格罗斯M.及闻Z.，整年评估试验规模的旋转式藻类生物膜(RAB)培养系统，生物资源技术，2014，171:50-58)，贴附生长的AA013藻体含油量(26.13％(w/w))反而高于悬浮生长时的藻体含油量。

悬浮及贴附培养下的AA013藻株藻体油脂成分及含量，则如下表一及表二所示。

表一

注:TG:三酸甘油酯(triacylglycerol)

FA:脂肪酸(fatty acid)

1,3-DAG:1,3-双酰基甘油酯(1,3-diacylglycerol)

1,2-DAG:1,2-双酰基甘油酯(1,2-diacylglycerol)

MAG:单酰基甘油酯(monoacylglycerol)

-:低于检测极限

表二

注：ND：未检出

DU：不饱和程度(Degree of Unsaturation)＝(单不饱和,w％+2(多不饱和,w％)(拉莫斯,M.J.,等人,原料的脂肪酸组成对生质柴油特性的影响.生物资源技术,2009,100:261-268)

表一的结果显示，悬浮培养的AA013藻体中所含的油脂主要为三酸甘油酯(占90.62％(w/w))，另包含少量游离脂肪酸(占4.42％(w/w))及1,3-双酰基甘油酯(占4.96％(w/w))；而贴附培养的AA013藻体中所含的油脂主成分也为三酸甘油酯(占98.75％(w/w))，另包含少量1,3-双酰基甘油酯(占0.95％(w/w))、1,2-双酰基甘油酯(占0.10％(w/w))及单酰基甘油酯(占0.09％(w/w))。

表二的结果显示，悬浮培养的AA013藻体脂肪酸组成主要为C16及C18脂肪酸，占总脂肪酸含量的84.5％(w/w)，而贴附培养与悬浮培养的AA013藻体脂肪酸组成并无显着差异，主要也包含C16及C18脂肪酸，仅组成比例上有些微差异。此外，经计算后，悬浮培养与贴附培养的AA013藻体所含油脂其不饱和程度(DU)分别为116.2及106.9，符合欧盟所定的生质柴油标准值。上述结果显示，悬浮培养与贴附培养的AA013藻株所产的油脂适合作为生质柴油的原料，此外，根据油脂中脂肪酸组成与三酸甘油酯含量，所述等油脂还适合作为食用油的原料。

实例五、AA013藻株贴附培养的产油效率

将AA013藻株与纤维滤纸贴附培养，于30℃下24小时照光培养，14天后收集藻体，计算其载体表面的藻体生物质产率及油脂产率，结果分别为1.51g/m²/天及0.39g/m²/天。

结论

本发明首先发现经初步鉴定为Chlamydopodium sp.的克莱曼都普帝藻分离株AA013。所述藻株可生长在温度约20℃到约40℃、盐度0‰(w/v)及约pH4到约pH9的环境中。此外，AA013藻株具备有良好的贴附特性，可贴附生长于不同材质的载体上。进一步发现，贴附生长的藻体所形成的生物膜中油脂含量高于悬浮生长的藻体(干燥藻体的含油量为26.13％(w/w)高于悬浮培养的21.5％(w/w))，且贴附生长的藻体三酸甘油脂含量占油脂总含量的98.75％(w/w)，脂肪酸组成以C16及C18脂肪酸为主，脂肪酸不饱和程度为106.9。以上结果显示，AA013藻株(Chlamydopodium sp.)可以贴附培养模式来形成生物膜以生产油脂，作为生产生质柴油及食用油的原料。

Claims (13)

1.一种克莱曼都普帝藻分离株，其为保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016152的藻株。

2.一种制备克莱曼都普帝藻培养产物的方法，其包含将根据权利要求1所述的克莱曼都普帝藻分离株接种于液态培养基中，在照光和通气下进行培养以获得所述培养产物。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述克莱曼都普帝藻是与载体共同培养于所述液态培养基中。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述克莱曼都普帝藻分离株与所述载体是分别加入所述液态培养基中，或先将该克莱曼都普帝藻分离株接种于所述载体上后，再将经接种的载体加入所述液态培养基中。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述载体是网状物质、泡棉或其任意组合。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述网状物质是滤纸、棉布、滤布、木浆布、不织布、牛仔布或碎花布。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述泡棉是聚乙烯醇(PVA)泡棉。

8.根据权利要求2至4中任一权利要求所述的方法，其中所述液态培养基的pH值为约pH2.5到约pH9。

9.根据权利要求2至4中任一权利要求所述的方法，其中所述克莱曼都普帝藻分离株是以约15℃到约45℃的温度进行培养。

10.根据权利要求2至4中任一权利要求所述的方法，其进一步包含分离所述培养产物的步骤。

11.一种克莱曼都普帝藻培养产物，其可由根据权利要求2至10中任一权利要求所述的方法来获得。

12.根据权利要求11所述的克莱曼都普帝藻培养产物，其包含三酸甘油酯及脂肪酸。

13.一种制备三酸甘油酯及/或脂肪酸的方法，其包含自根据权利要求11或12所述的克莱曼都普帝藻培养产物中分离出三酸甘油酯和及/或脂肪酸。

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