CN108977362A - 绿球藻 (chlorella lewinii)藻株和其用途 - Google Patents

Abstract

本申请涉及绿球藻(Chlorella lewinii)藻株和其用途。本发明系关于一种新颖的经分离绿球藻(Chlorella lewinii)藻株和其在食用油脂与生质燃料合成和二氧化碳固定的应用。

Description

绿球藻(CHLORELLA LEWINII)藻株和其用途

技术领域

本发明系关于新颖绿球藻(Chlorella lewinii)的分离藻株，所述的分离藻株可产生高量适合用作食用油和生质柴油的三酸甘油酯和脂肪酸，且具有高效的固碳作用，故所述的分离株可做为生产健康油脂和生质柴油的原料，亦可应用于二氧化碳的减量。

背景技术

微藻这类细小的生物通常生活在淡水和海洋生态系统，生长形式包括单独生长、链状或是团状生长(Thurman HV,Burton EA.Introductory oceanography:Prentice HallNew Jersey；1997)。微藻生物多样性复杂，估计微藻大约有20-80万种，其中已发现并记录的仅有5万种(Borowitzka MA.Commercial production of microalgae:ponds,tanks,tubes and fermenters.Journal of biotechnology 1999；70:313)，微藻几乎是为一个几乎未积极开发的资源。

脂质为微藻的次级代谢产物，具保持细胞膜通透性和因应环境变化作为细胞信号传导途径的功能。微藻生产的油脂量与组成会随周遭环境产生变化(Borowitzka MA.(1999)和Thompson PA,Harrison PJ,Whyte JN.Influence of irradiance on the fattyacid composition of phytoplanktonl.Journal of Phycology 1990；26:278)。因此随着培养环境的条件包括光强度、生长阶段、光周期、温度、盐度、CO₂浓度、氮和磷浓度等，油脂的含量、组成和各种脂肪酸比例亦会随的改变(Dunstan G,Volkman J,Barrett S,GarlandC.Changes in the lipid composition and maximisation of the polyunsaturatedfatty acid content of three microalgae grown in mass culture.Journal ofApplied Phycology 1993；5:71和Wu H,Volponi JV,Oliver AE,Parikh AN,Simmons BA,Singh S.In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy.Proceedingsof the National Academy of Sciences2011；108:3809)。微藻富含三酸甘油脂、双酸甘油脂、磷脂和醣脂、碳氢化合物和其他脂类，含油总量可占干重的1至90％，取决于藻种和培养条件(Spolaore P,Joannis-Cassan C,Duran E,Isambert A.Commercial applicationsof microalgae.Journal of Bioscience and Bioengineering 2006；101:87和ChistiY.Biodiesel from microalgae.Biotechnology Advances 2007；25:294)。

微藻作为一个可持续发展的绿色能源之一，相较于其他油脂植物像是棕梠、油菜、大豆和甘蔗作为生物燃料生产者时，其操作性更高，在短时间内生产生物柴油、生物乙醇、生物氢和生物质的产量更大。又微藻可使用非耕地、苦咸水和民生废水等进行生产，减少使用农耕土地与淡水资源，进而减少与粮食和经济作物的竞争。因此各国已投入微藻和其衍生物包括生物燃料、化学品和高价商品的商业化。

微藻可用来生成一系列的可再生燃料，包括生质柴油(Tran D-T,Chen C-L,ChangJ-S.Effect of solvents and oil content on direct transesterification of wetoil-bearing microalgal biomass of Chlorella vulgaris ESP-31for biodieselsynthesis using immobilized lipase as the biocatalyst.Bioresource Technology2013；135:213；Hu Q,Sommerfeld M,Jarvis E,Ghirardi M,Posewitz M,Seibert M,etal.Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production:perspectives and advances.The Plant Journal 2008；54:621和Cheng H-H,Whang L-M,Chan K-C,Chung M-C,Wu S-H,Liu C-P,et al.Biological butanol production frommicroalgae-based biodiesel residues by Clostridium acetobutylicum.BioresourceTechnology 2015；184:379)、生物乙醇(Ho S-H,Li P-J,Liu C-C,Chang J-S.Bioprocessdevelopment on microalgae-based CO₂fixation and bioethanol production usingScenedesmus obliquus CNW-N.Bioresource Technology 2013；145:142；Ho S-H,HuangS-W,Chen C-Y,Hasunuma T,Kondo A,Chang J-S.Bioethanol production usingcarbohydrate-rich microalgae biomass as feedstock.Bioresource Technology2013；135:191和Harun R,Danquah MK.Influence of acid pre-treatment onmicroalgal biomass for bioethanol production.Process Biochemistry 2011；46:304)、生物氢(Sambusiti C,Bellucci M,Zabaniotou A,Beneduce L,Monlau F.Algae aspromising feedstocks for fermentative biohydrogen production according to abiorefinery approach:A comprehensive review.Renewable and Sustainable EnergyReviews 2015；44:20；Oncel S,Kose A,Faraloni C,Imamoglu E,Elibol M,Torzillo G,et al.Biohydrogen production from model microalgae Chlamydomonas reinhardtii:A simulation of environmental conditions for outdoorexperiments.International Journal of Hydrogen Energy 2015；40:7502和BatistaAP,Ambrosano L, S,Sousa C,Marques PA,Ribeiro B,et al.Combining urbanwastewater treatment with biohydrogen production–An integrated microalgae-based approach.Bioresource Technology 2015；184:230)、甲烷(Caporgno M,Taleb A,Olkiewicz M,Font J,Pruvost J,Legrand J,et al.Microalgae cultivation in urbanwastewater:Nutrient removal and biomass production for biodiesel andmethane.Algal Research 2015；10:232；Ajeej A,Thanikal JV,Narayanan C,KumarRS.An overview of bio augmentation of methane by anaerobic co-digestion ofmunicipal sludge along with microalgae and waste paper.Renewable andSustainable Energy Reviews 2015；50:270和Kim J,Kang C-M.Increased anaerobicproduction of methane by co-digestion of sludge with microalgal biomass andfood waste leachate.Bioresource Technology 2015；189:409)和合成气(Raheem A,WAKG WA,Yap YT,Danquah MK,Harun R.Optimization of the microalgae Chlorellavulgaris for syngas production using central composite design.RSC Advances2015；5:71805；Raheem A,Sivasangar S,Azlina WW,Yap YT,Danquah MK,HarunR.Thermogravimetric study of Chlorella vulgaris for syngas production.AlgalResearch 2015；12:52和Hu Z,Ma X,Li L.The synergistic effect of co-pyrolysis ofoil shale and microalgae to produce syngas.Journal of the Energy Institute2015)。然而，在微藻生物燃料的商业化的技术和经济量产较为困难，需突破之处包括能耐受室外培养、光合效率更好和生长更快的藻种，以及在大规模生产时采收、萃取等油品制造的成本。

预计到2050年时，世界人口将达到90亿，这将导致全球粮食的供应面临挑战(Foley JA,Ramankutty N,Brauman KA,Cassidy ES,Gerber JS,Johnston M,etal.Solutions for a cultivated planet.Nature 2011；478:337和Tilman D,Balzer C,Hill J,Befort BL.Global food demand and the sustainable intensification ofagriculture.Proceedings of the National Academy of Sciences 2011；108:20260)。近年来微藻已成为可持续生产粮食和饲料、燃料和化学品的明星选项。相较于传统粮食作物，微藻产量是高等植物的6-7倍，是可靠的蛋白质、碳水化合物和脂质来源(BeckerE.Micro-algae as a source of protein.Biotechnology advances 2007；25:207)。许多藻种生产脂质是以蓄积三酸甘油酯(triacylglycerol，TAG)形式为主，具有类似于植物油的脂肪酸组成(Draaisma RB,Wijffels RH,Slegers PE,Brentner LB,Roy A,BarbosaMJ.Food commodities from microalgae.Current Opinion in Biotechnology 2013；24:169和Gunstone F.Vegetable oils in food technology:composition,properties anduses:John Wiley&Sons；2011)，此外还能生产一些高价脂肪酸例如二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)(Guschina IA,Harwood JL.Algal lipids and effect of the environment on theirbiochemistry.Lipids in aquatic ecosystems:Springer；2009,p.1和Mühlroth A,Li K, G,Winge P,Olsen Y,Hohmann-Marriott MF,et al.Pathways of lipidmetabolism in marine algae,co-expression network,bottlenecks and candidategenes for enhanced production of EPA and DHA in species of Chromista.Marinedrugs2013；11:4662)。又人体必需脂肪酸包括n6系列的亚麻油酸(C18:2)与n3系列的次亚麻油酸(C18:3)，通常藉由饮食摄取，部分微藻能生产这些碳链油脂(Lang I,Hodac L,Friedl T,Feussner I.Fatty acid profiles and their distribution patterns inmicroalgae:a comprehensive analysis of more than 2000strains from the SAGculture collection.BMC plant biology2011；11:124)。美国Solazyme于2013年通过美国FDA对于其藻油产品GRAS的认证(FDA U.RE:High Lipid Chlorella protothecoidesS106Flour GRAS 2013)，说明藻油能够运用在日常烹调与烘焙。

人类文明发展活动例如燃烧化石燃料、毁林和能源生产，进而造成了强烈的温室气体排放。二氧化碳其在大气中的浓度，这是自工业革命以前到2013年，已从280升至390ppm(Rahaman MSA,Cheng L-H,Xu X-H,Zhang L,Chen H-L.A review of carbondioxide capture and utilization by membrane integrated microalgal cultivationprocesses.Renewable and Sustainable Energy Reviews 2011；15:4002和Singh UB,Ahluwalia A.Microalgae:a promising tool for carbon sequestration.Mitigationand Adaptation Strategies for Global Change 2013；18:73)。二氧化碳能在大气中存在50-200年，造成全球变暖有52％是归咎于二氧化碳(Wilbanks TJ,Fernandez S,BackusG,Garcia P,Jonietz KK.Climate Change and Infrastructure,Urban Systems,andVulnerabilities:Technical Report for the US Department of Energy in Supportof the National Climate Assessment:Island Press；2014)。微藻固定二氧化碳的效率是陆生植物的10-50倍(Cheng J,Huang Y,Feng J,Sun J,Zhou J,Cen K.ImprovingCO2fixation efficiency by optimizing Chlorella PY-ZU1culture conditions insequential bioreactors.Bioresource technology 2013；144:321和Lam MK,Lee KT,Mohamed AR.Current status and challenges on microalgae-based carboncapture.International Journal of Greenhouse Gas Control 2012；10:456)。陆生植物预计只能削减约3-6％全球二氧化碳排放量(Ho S-H,Chen C-Y,Lee D-J,Chang J-S.Perspectives on microalgal CO₂-eission mitigation systems—areview.Biotechnology advances 2011；29:189和Kao C-Y,Chen T-Y,Chang Y-B,Chiu T-W,Lin H-Y,Chen C-D,et al.Utilization of carbon dioxide in industrial fluegases for the cultivation of microalga Chlorella sp.Bioresource Technology2014；166:485)。微藻每生产1公斤微藻生物质约可固定1.83公斤的二氧化碳(Jiang Y,Zhang W,Wang J,Chen Y,Shen S,Liu T.Utilization of simulated flue gas forcultivation of Scenedesmus dimorphus.Bioresource Technology 2013；128:359)。因此微藻已被公认为生产生物燃料最有前途的替代方案。由于微藻光合效率在生物转化二氧化碳时表现出高生产效率、高量的脂质蓄积，又能降低大气二氧化碳浓度，可生产有价值的原料，亦可生产可再生能源和有价值的非燃料副产品(Xie Y-P,Ho S-H,Chen C-Y,Chen C-NN,Liu C-C,Ng I-S,et al.Simultaneous enhancement of CO₂fixation and luteinproduction with thermo-tolerant Desmodesmus sp.F51using a repeated fed-batchcultivation strategy.Biochemical Engineering Journal 2014；86:33)。微藻光合过程中除了可使用大气中的二氧化碳，对于电厂烟道气中的二氧化碳亦可进行捕捉利用，从而减少排碳量(Doucha J,Straka F, K.Utilization of flue gas forcultivation of microalgae Chlorella sp.)in an outdoor open thin-layerphotobioreactor.Journal of Applied Phycology 2005；17:403和Maeda K,Owada M,Kimura N,Omata K,Karube I.CO₂fixation from the flue gas on coal-fired thermalpower plant by microalgae.Energy Conversion and Management1995；36:717)。

以富含胺基酸、有机酸的食品工业废水而言，结合微藻养殖的废水处理系统似乎是一个不错的选择(Mata TM,Martins AA,Caetano NS.Microalgae for biodieselproduction and other applications:a review.Renewable and sustainable energyreviews 2010；14:217)。利用藻类废水处理具有很多优点，包括废水中丰富的营养物质，例如氮和磷等，以和适量的重金属离子，提供藻类生长所需，达到去除化学、有机污染物和部分重金属的效益。另外可回收藻体的生物质作为肥料，可以抵消部分运转费用(Munoz R,Guieysse B.Algal–bacterial processes for the treatment of hazardouscontaminants:a review.Water research2006；40:2799)。可应用在废水养殖的微藻例如Chlorococcum sp.RAP13以异营的方式处理乳制品厂污水，其所生成的油脂含量可达到42％(Ummalyma SB,Sukumaran RK.Cultivation of microalgae in dairy effluent foroil production and removal of organic pollution load.Bioresource technology2014；165:295)。Scenedesmus sp.处理富含果糖、葡萄糖和乙酸的废水，其所生成的油脂含量更可达到52.6％(Ummalyma SB,Sukumaran RK.Cultivation of microalgae in dairyeffluent for oil production and removal of organic pollution load.Bioresourcetechnology 2014；165:295)。Chlorella pyrenoidosa FACHB-9处理大豆加工废水，其所生成的油脂含量达到37％(Hongyang S,Yalei Z,Chunmin Z,Xuefei Z,JinpengL.Cultivation of Chlorella pyrenoidosa in soybean processingwastewater.Bioresource Technology 2011；102:9884)。

根据AlgaeBase数据库(http://www.algaebase.org/)记载，Chlorella lewinii的模式生物(type species)为CCAP 221/90，对此藻种目前尚未有太多研究，仅于分类学研究(Bock C,Krienitz L,Proeschold T.Taxonomic reassessment of the genusChlorella(Trebouxiophyceae)using molecular signatures(barcodes),includingdescription of seven new species.Fottea 2011；11:293.)和产氢研究(Pongpadung P,Liu J,Yokthongwattana K,Techapinyawat S,Juntawong N.Screening for hydrogen-producing strains of green microalgae in phosphorus or sulphur deprivedmedium under nitrogen limitation.ScienceAsia2015；41:97)中，作为比对之用。关于油脂生产、固碳效率和异营生长特性等，目前尚未有学术文献或专利发表。

无论是经济发展或民生所需，对于干净的空气与水源的需求日益重要。为减缓温室效益与对环境的破坏，对于CO₂和工业所产生的废水，两者的排放标准越来越严格，俨然成为各国政府与企业巨大的挑战。因此，新的概念或工程系统日趋重要，例如混合废水与废弃的微藻处理系统可以是一个有效的污染物去除的方法，废水中含有可生物降解的有机物，在处理废水的同时又可生产能源，此混合系统的发展已成为一种趋势。期待未来能够发展出适合的技术来因应环保与能源问题。

发明内容

本发明系于台湾桃园有机稻田区采集到含微藻的土壤与水样样品后，以C培养基进行微藻的培养与分离，选取出具高油脂含量的C40藻株，经鉴定所述的藻株属于绿球藻(Chlorella lewinii)的微藻。经藻油脂含量、组成和生长条件等分析，发现C40藻株不仅可生产高量的油脂，且C40藻株可在极广的温度、盐度与pH范围下，行自营性、异营性或混营性生长，故C40藻株具有作为生质燃料和食用油的原料的潜力，亦可运用于二氧化碳减量和废水处理的应用。

因此，本发明的一目的系提供一种经分离的绿球藻株，所述的绿球藻分离株包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的18S rDNA序列和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的ITS区域序列。

本发明的另一目的系提供一种培养所述的经分离的绿球藻株以获得绿球藻培养产物的方法。

本发明的另一目的系提供一种由上述方法所获得的绿球藻培养产物，其中所述的绿球藻培养产物可作为生产生质燃料和食用油的料源。

本发明的另一目的系提供一种由上述绿球藻培养产物中获得三酸甘油酯和/或脂肪酸的方法。

本发明的另一目的系提供一种由上述绿球藻培养产物来制备生质燃料的方法。

本发明在以下部分中详细描述。本发明的其他特征、目的与优点可易见于本发明的实施方式与权利要求书中。

附图说明

图1为C40藻株的显微镜检图。图1A为明视野观察，藻细胞为圆球状，直径约为4～7μm，显微倍率1,000X；图1B为以Nile Red染色，以荧光显微镜观察，藻体内部有橘黄色的油滴分布，显微倍率1,000X。

图2为C40与相似藻种序列比对的亲源图。图2A为以各藻种18S-ITS序列进行数据分析的结果；图2B为以各藻种ITS序列进行数据分析的结果。

图3为C40与相近藻株的ITS序列AlginX比对结果。

图4为C40藻株于不同培养温度的生长情形。

图5为C40藻株在不同培养盐度下的生长情形。

图6为C40藻株在不同pH值下的生长情形。

图7为C40藻株在不同有机培养基中异营和混营生长测试结果。

图8为C40藻株每日固炭量曲线。

具体实施方式

本发明可通过下述实施方式中所公开的各个发明方面、实施例与表列的相关叙述所了解。除非在本文中另作定义，否则与本发明关联使用的术语(包含技术与科学术语)应具有本发明所属技术领域的技术人员所了解的含义。且当可了解，除非本文中提供的定义另作说明，在任何潜在歧义的情况下，术语的定义应与所述普遍使用的术语(如词典中所定义)一致。可进一步了解，本案所使用的术语仅用作描述特定实施方面的目的，而非用于限定。

必须注意的是，除非有清楚的相反指示，于说明书或权利要求书使用的单数格式“一”、“一种”与“所述”还包含复数表示。因此，除非上下文另有需要，单数术语应包含复数，而复数术语还包含单数。

本发明的范围以“自一“约”特定数值及/或到另一“约”特定数值”表示。当范围由上述方式表示时，其包含自一特定数值及/或到另一特定数值的范围。同样地，当数值可通过术语“约”以表示近似值，将可了解其为一特定值的另一个方面。可进一步了解，当提及有关其它端点与其它端点本身而言，每一范围的两端点都为有意义的。根据本发明，“约”可表示±20％，优选地为±10％，更优选地为±5％。

于本发明中，术语“经分离”或“分离”意谓使物质自其原始环境(如果天然存在那么为天然环境)中移出。术语“经分离”或“分离”并不一定指物质是经纯化者。

本发明的一目的是提供一种绿球藻(Chlorella lewinii)分离藻株，其中所述的绿球藻分离藻株包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的18S rDNA序列与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的ITS区域序列。于本发明优选实施方面中，所述的绿球藻分离藻株为保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016742的藻株，或为与保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016742的藻株具有实质上完全相同特征的变异株。

上述术语“变异株”意谓涵盖全体细胞遗传组成已通过如化学突变诱发、自发突变、遗传工程、转化或转染而改变，以致影响其物理或生物化学特性的任何绿球藻株。然而，所述变异株应具有保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016742的微芒藻属分离株的所有分类学识别特征。

本发明的一目的系在于提供一种制备绿球藻培养产物的方法。于本发明的实施态样中，所述的方法包含将本发明的绿球藻分离藻株接种于培养基中，和进行培养以获得所述的培养产物。

于本发明中，术语“培养产物”意谓将微藻置于培养基中培养后，所获得富含所述的微藻细胞的产物。于本发明中，所述的培养产物中的微藻细胞可不必与培养基分离，且所述的培养产物可呈液态、固态或黏稠状。

于本发明中，用于培养绿球藻分离藻株的“培养基”可为任何容许绿球藻分离藻株生长、繁殖并制造三酸甘油酯及/或脂肪酸的水性培养基，例如C培养基[每100mL中包含15mg Ca(NO₃)₂·4H₂O、10mg-20mg KNO₃、5mgβ-甘油磷酸二钠·5H₂O、4mg MgSO₄·7H₂O、0.01μg维生素B12、0.01μg生物素(Biotin)、1μg噻胺(Thiamine)HCl、0.3mL PIV微量元素溶液(每100mL中包含100mg Na₂EDTA·2H₂O、19.6mg FeCl₃·6H₂O、3.6mg MnCl₂·4H₂O、1.04mgZnCl₂、0.4μg CoCl₂·6H₂O、0.25μg Na₂MoO₄·2H₂O与水)、50mg三羟甲基氨基甲烷(Tris)与水]、胰蛋白酶大豆培养液(Tryptic Soy Broth；TSA)、马铃薯葡萄糖培养液(PotatoDextrose Broth；PDA)、与营养培养液(Nutrient Broth；NA)。若要制备琼脂固体培养基，可于液态培养基中加入1.5％(w/v)的琼脂，经灭菌冷却后即可获得琼脂固体培养基。本技术领域的人士可根据既有知识针对培养基的成分作调整。于本发明的一较优选实施态样中，所述的培养基为液态培养基。

本发明中用于培养绿球藻分离藻株的条件意指如培养基的pH值、盐度、培养温度、照光、通气条件和培养时间等条件，其可容许所述的绿球藻分离藻株生长、繁殖并制造三酸甘油酯和/或脂肪酸。本技术领域的人士可根据既有知识针对培养条件作调整。

于本发明的实施态样中，绿球藻分离藻株可在不照光下(即24小时黑暗)下进行异营性生长、12小时光照12小时黑暗的光周期下进行混营性生长或持续光照下进行自营性生长。照光量可为约100lux至约4,000lux，优选为约2,000lux的亮度

于本发明的实施态样中，绿球藻分离藻株的培养温度可为约10℃至约60℃(例如约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃或约60℃)，优选为为约20℃至约40℃，更优选为约30℃。

于本发明的实施态样中，用于培养绿球藻分离藻株的培养基的pH值可为约pH1至约pH14(例如约pH1、约pH1.5、约pH2、约pH2.5、约pH3、约pH3.5、约pH4、约pH4.5、约pH5、约pH5.5、约pH6、约pH6.5、约pH7、约pH7.5、约pH8、约pH8.5、约pH9、约pH9.5、约pH10、约pH10.5、约pH11、约pH11.5、约pH12、约pH12.5、约pH13、约pH13.5或约pH14)，优选为约pH4至约pH10，更优选为约pH5至约pH7。

于本发明的实施态样中，可视需要调整培养绿球藻分离藻株的培养基的盐度。本文中所谓“盐度”意旨溶解于培养基中的盐类含量。本发明中培养基的盐度可为0％(w/w)至约6％(w/w)(例如0％(w/w)、约0.5％(w/w)、约1％(w/w)、约1.5％(w/w)、约2％(w/w)、约2.5％(w/w)、约3％(w/w)、约3.5％(w/w)、约4％(w/w)、约4.5％(w/w)、约5％(w/w)、约5.5％(w/w)或约6.0％(w/w))，优选为0％(w/w)至约3％(w/w)，更优选为1.5％(w/w)。

本发明制备绿球藻分离藻株培养产物的方法中，可视需要包含分离所述的培养产物的步骤，而所述的分离步骤可为如离心和/或过滤等习知的方法步骤。

本发明亦提供由上述方法所获得的培养产物。本发明的培养产物中富含三酸甘油酯和/或脂肪酸，故可用作获得三酸甘油酯和/或脂肪酸的原料，进而分别用于制作健康油脂和/或生质燃料。

本文中的“三酸甘油酯”意旨具有1个甘油分子和3个脂肪酸分子的酯类化合物，其中该3个脂肪酸分子可具有完全相同、部份相同或完全相异的碳数和不饱和键。

本文中的“脂肪酸”意旨具有8至30个碳原子和0至6个不饱和键的羧酸化合物，其较佳为具有12至20个碳原子和0至5个不饱和键的羧酸化合物，更佳为具有16至18个碳原子和0至3个不饱和键的羧酸化合物。

三酸甘油酯和脂肪酸的获得可使用本技术领域所熟知的任何萃取和分离方法，例如Folch等人(Folch,J.et al.,A simple method for the isolation and purificationof total lipids from animal tissue.,The Journal of Biological Chemistry,1957；23:497-509)、Balasubramanian等人(Balasubramanian S.et al.,Oil extraction fromScenedesmus obliquus using a continuous microwave system–design,optimization,and quality characterization.,Bioresource Technology,2011,102:3396-3403)和Sajilata等人(Sajilata M.G.et al.,Supercritical CO₂extraction ofγ-linolenicacid(GLA)from Spirulina platensis ARM 740using response surface methodology.,Journal of Food Engineering 2008,84:321–326)所述的方法。简而言之，所述的方法可包含将绿球藻细胞以如研磨法或超音波法等方式击碎，藉由适当的溶剂萃取绿球藻细胞中的三酸甘油酯和/或脂肪酸，再藉由如HPLC和/或离子交换树脂的技术获得三酸甘油酯和/或脂肪酸。

本发明的绿球藻培养产物可经化学转化(如氢化、转酯化、水热碳化(hydrothermal carbonisation)、发酵或裂解等)或萃取而成固态、液态或气态的生质燃料，其包括(但不限于)生质柴油、生物甲醇、生物乙醇、生物丁醇、生物甲烷、生物氢或生质煤炭。

上述生质燃料的获得可使用本技术领域所熟知的任何方法，诸如Tran D.T.等人(Tran D.T.et al.,Effect of solvents and oil content on directtransesterification of wet oil-bearing microalgal biomass of Chlorellavulgaris ESP-31for biodiesel synthesis using immobilized lipase as thebiocatalyst.,Bioresource Technology 2013；135:213-221)、Cheng H.H.等人(ChengH.H.,et al.,Biological butanol production from microalgae-based biodieselresidues by Clostridium acetobutylicum.,Bioresource Technology 2015；184:379-385)、Sambusiti C.等人(Sambusiti C.,et al.,Algae as promising feedstocks forfermentative biohydrogen production according to a biorefinery approach:Acomprehensive review.,Renewable&Sustainable Energy Reviews 2015；44:20-36)和Heilmann S.M.等人(Heilmann S.M.et al.,Hydrothermal carbonization ofmicroalgae.,Biomass&Bioenergy2010；34(6):875–882和Heilmann S.M.et al.,Hydrothermal carbonization of microalgae II.Fatty acid,char,and algalnutrient products.,Applied Energy 2011；88(10):3286–3290)所述的方法。

本文所述的所有公开案、专利与专利文献均以全文引用的方式并入本文中。

提供以下实例以辅助所属领域的技术人员实施本发明。即使如此，不应将所述实例视为本发明的限制，因为本发明所属技术领域的技术人员在不背离本发明的精神或范围的情况下对本文所讨论的实施例进行的修改与变化，而仍属于本发明的范围。

实施例

材料与方法

1.培养基配方

1.1 C培养基

将Ca(NO₃)₂·4H₂O 15mg、KNO₃ 10mg、β-甘油磷酸二钠·5H₂O 5mg、MgSO₄·7H₂O4mg、维生素B12 0.01μg、生物素(Biotin)0.01μg、噻胺(Thiamine)HCl 1μg、PIV微量金属溶液0.3mL与Tris 50mg混合后将其体积补水至100mL，调整pH至7.5后进行高压灭菌。若为1.5％(w/v)洋菜固体培养基则需加入15g的洋菜胶一同灭菌。

PIV微量金属溶液的配制为依序加入Na₂EDTA·2H₂O 100mg、FeCl₃·6H₂O 19.6mg、MnCl₂·4H₂O 3.6mg、ZnCl₂ 1.04mg、CoCl₂·6H₂O 0.4μg与Na₂MoO₄·2H₂O 0.25μg，随后将其体积补水至100mL后进行高压灭菌。

测试不同盐度生长特性时，使用C培养基组成，另外加入NaCl调整盐度，并使用盐度计测量盐度使达到所需的盐度。测试不同pH生长特性时，使用C培养基组成，另外加入HCl或NaOH调整pH值，并使用酸碱量测计测量使达到所需的pH值。

1.2 TSB培养基(胰蛋白酶大豆培养液(Tryptic Soy Broth))

依序加入15.0g的胰水解蛋白(Tryptone)、5.0g的大豆水解蛋白(Soytone)和5.0g的NaCl水中，随后将其体积补水至1L，调pH至7.3后进行高压灭菌。

1.3 PDB培养基(马铃薯葡萄糖培养液；Potato Dextrose Broth)

依序加入200.0g的切丁马铃薯和20.0g的葡萄糖，随后将其体积补水至1L，调pH至7.3后进行高压灭菌。

1.4 NB培养基(营养培养液；Nutrient Broth)

依序加入3.0g的牛肉萃取物和5.0g的蛋白胨(Peptone)，随后将其体积补水至1L，调pH至7.0后进行高压灭菌。

2.藻样采集、分离和培养

取台湾桃园的有机稻田的水样与土样均匀混合后取出约10mL置于50mL的离心管中，加入约30mL的C培养基，于25℃照光培养。培养期间以显微镜观察是否有藻体生长，之后取出适量含藻体的培养液，将其转至平板培养基，于25℃照光培养。待藻体生长后取单一藻种将其于平板培养基中涂开，以上步骤需重复至筛选获得单一藻体为止。平板培养则取单一藻落涂至C平板培养基，于25℃照光培养。

3.油脂染色分析

将培养好的藻体取20μL与1μL Nile Red(于二甲基亚砜中0.1mg/mL)混合以进行油滴染色，染色后于室温静置5分钟，再利用荧光显微镜进行观察(Chen,W.et al.,A highthroughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids inmicroalgae.,Journal of Microbiological Methods 2009；77:41-47和Huang,G.H.,etal.,Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile redfluorescence.,Biomass&Bioenergy 2009；33:1386-1392)。

4.藻种的分子鉴定

4.1藻体基因体(genomic)DNA的抽取

自平板培养基上刮取适量的新鲜培养的藻体，将其收集在2mL微量离心管中，依照ZYMO RESEARCH的ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep^TM kit说明书操作取得基因体DNA，并以NanoDrop(ND-1000分光亮度计)检测DNA浓度。

4.2 PCR增幅、定序和亲源分析

将藻体基因体DNA作为PCR模板，以18S rRNA与ITS区域(包含18S核糖体RNA的后端、内转录间隔区(internal transcribed spacer)1、5.8S核糖体RNA、内转录间隔区2與28S核糖体RNA的前端等序列)的相关引子组(http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)来扩增其基因片段。PCR反應溶液如下：適量的基因体DNA溶液作為PCR模板，于含10mM dNTP 8μL、10X PCR緩衝液10μL、10pmole的5′端引子与3′端引子与Taq DNA聚合酵素5U。PCR反應條件為96℃/30秒、50℃/30秒、72℃/150秒；補齊增殖段共1循環72℃/10分鐘；最後保持在4℃。取5μL產物進行電泳跑膠分析。

将PCR产物纯化后以适当引子(http://biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)进行定序，将定序结果以Vector NTI Suite 10软件(VNTI)与NCBI/Blastn(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)进行序列重组与序列相似性比对分析。另，分别将定序所得的C40序列经NCBI/Blastn后所得相近的藻株与数个藻种中心较接近的藻株和藻属列为比较范围，进行演化树分析，以MEGA 6.0软件做比对，接着利用最大概似法(Maximum Likelihood)以GTR+G+I的方式绘制演化树，Bootstrap则为100次，分析的结果可作为分类地位上的鉴别参考。

5.藻体分析

5.1藻体含油量分析

C40以800mL C培养基，培养于1L血清瓶中，并通入无菌空气，于30℃照光培养一个月。收集藻体后将其冷冻干燥成藻粉，秤取定量的藻粉，萃取其油脂。油脂萃取方法参考Folch等人的方法(Folch,J.et al.,A simple method for the isolation andpurification of total lipids from animal tissue.,The Journal of BiologicalChemistry 1957；23:497-509)并经修饰来进行，其过程为将30mg冷冻干燥的藻粉(A值)置入2mL微量离心管，加入约2.0mL氯仿/甲醇(v:v＝2:1)与适量大颗玻璃珠，以撞击式细胞破碎仪( MM400)振荡约5分钟，重复两次。以10,000rpm离心5分钟后，取出上清液并将其加入抛弃式15mL离心管中，随即于2mL微量离心管内加入约2.0mL氯仿/甲醇(v:v＝2:1)，再以超音波振荡与离心处理，取出上清液并将其加入另一抛弃式15mL离心管中，重复上述萃取离心步骤直到萃取液无色为止。于装有萃取液的15mL离心管中加入等体积的145mMNaCl溶液后，以试管旋转混合器混和均匀后，经离心管在4,500rpm下离心10分钟。以玻璃吸管取下层液体到已秤重的玻璃瓶(B值)中。将此玻璃瓶内液体隔夜风干再秤重(C值)，计算藻干含油量的百分比(D值)。藻干含油量计算公式:

5.2脂肪酸图谱分析

将抽取的藻油样品以HPLC分析其油脂组成，HPLC分析条件：分离管柱为德国Merck公司制造的Silica gel(4.6mm id×250mm,5μm particle size)；冲提溶剂A：hexane；冲提溶剂B：hexane/ethyl acetate/iso-propanol＝80：10：10(v/v)，在0分钟溶剂A/B＝98：2(v/v)，在8分钟线性增加至溶剂A/B＝50：50(v/v)，在8.5分钟线性增加至溶剂A/B＝2：98(v/v)，15分钟维持相同梯度，20分钟线性减少至溶剂A/B＝98：2(v/v)；流速：1.2mL/min；蒸发光散射检测器(ELSD；Evaporative Light Scattering Detector)条件；气体流量2.6L/min；蒸发器温度：40℃(詹国靖,黄启纹,范少怡,朱燕华.以甘油与植物油利用脂解酶的转酯化反应生产1,3-双酰甘油.台湾农业化学与食品科学2010；48:19)。

5.3脂肪酸图谱分析方法

刮取适量干燥藻体置于玻璃试管中，加入1mL solution 1(NaOH 45g,methanol150mL,ddH₂O 150mL)，震散藻体。于100℃加热5分钟，再将所有藻体震散，续加热25分钟。加入2mL solution 2(6N HCl 325mL,methanol 200mL)，于80℃加热10分钟，完成后迅速冷却。加入1.25mL solution 3(hexane 200mL,tert-butyl methyl ether 200mL)，缓慢混合10分钟，以玻璃吸管尖吸取下层液体并丢弃。将上层液体加入3mL solution 4(NaOH10.8g,ddH2O 900mL)，混合5分钟后，吸取上层液体以GC/MS(HP 5973GC/MS System)分析其脂肪酸含量。GC/MS分析方法参考2007年Valencia,I.等人的方法(Valencia I,AnsorenaD,Astiasarán I.Development of dry fermented sausages rich in docosahexaenoicacid with oil from the microalgae Schizochytrium sp.:Influence on nutritionalproperties,sensorial quality and oxidation stability.Food Chemistry 2007；104:1087)，GC/Mass分析条件为：毛细管管柱：SP-2560,75m x 0.18mm I.D.,0.14μm。注入口温度：Inj,250℃。离子源温度：FID,250℃。管柱烘箱温度：起始温度140℃，保持5分钟后以4℃/min的升温速率升温至240℃，保持2分钟。Carrier gas：He。Column流量：40cm/sec@175℃。Injection:1μL。split ratio：1/100。脂肪酸标准品：37-Component FAME Mix(Cat.18919-1AMP,Sigma-Aldrich)。设定好条件后，先分析标准品确认图谱正确后再进行样品分析。样品层析数据利用质谱数据与标准品位置进行比对，以确认脂肪酸组成与比例。

6.藻种培养特性分析

6.1不同培养温度测试

放入含20％二氧化碳的密封袋中，以不同温度20℃、30℃与40℃进行照光培养，光照周期为12小时照光：12小时黑暗(12L:12D)。于培养第0小时、24小时和96小时观察生长情形。

6.2同盐度培养基测试

以C培养基作为基础，以此制作0％、1.5％和3％盐度的培养基平板。藻种均匀涂布于培养基平板上，放入含20％二氧化碳的密封袋中，以30℃进行照光培养，光照周期12L:12D。于培养第0小时、24小时和96小时观察生长情形。

6.3不同pH值培养基测试

以C培养液作为基础，以此制作pH 3-10的培养基。因酸性固体培养基制作较困难，洋菜不易凝固，故使用液体方式进行培养。作法为添加酸液或碱液并充分溶解后，以pH测定仪测量pH值，培养液以高温高压进行灭菌。将藻种均匀接种于各pH值的培养液中，做三重复。以30℃进行照光培养，于培养第0天、第4天和第19天观察生长情形。

6.4固碳效率测定

C40藻株于二氧化碳固碳筛选平台，以体积为1公升的C培养基(含氮量为原培养基的2倍：添加20mg KNO₃)，在30℃全日照光条件下进行监测。固碳筛选平台以通气量为0.1vvm持续通入5％二氧化碳至潜力藻株藻液，再利用二氧化碳自动监测系统持续监测进流和出流的二氧化碳浓度(浓度单位为％，1％＝10,000ppm)，经由气体浓度转换公式的计算将二氧化碳浓度单位转换为毫克/立方米，计算每日固定二氧化碳毫克数(Ya-junH.Brief Discussion on conversion coeficient between the concentration unitsppm and mg/m3of nitrogen oxides(NO_X).Sichuan Environment 2010；1:006)：

二氧化碳气体浓度转换的计算公式：

分子量(二氧化碳)：44.01

t：测定温度(30℃)

固碳效率计算公式：

R＝(C_in-C_out)×V×Q×T

R：每日固定毫克数(mg)

V：微藻培养体积(m³)

Q：气体通气量(vvm，volume per volume per minute)

T：每日通气时间(min)

C_in：二氧化碳进流浓度(mg/m³)

C_out：二氧化碳出流浓度(mg/m³)

6.5有机培养基培养测试

测试的有机培养基包括TSA、PDA和NA共三种。C40藻体均匀涂布于有机培养基平板上，各有机培养基涂布两片，一片置于30℃光照培养箱，光照条件12L：12D。另一片置于30℃黑暗培养箱，于培养第0小时、第24小时和第96小时观察生长情形。

实例一、藻株鉴定

于台湾桃园有机稻田土壤与水样样品，分离纯化得到藻株C40。以1,000X显微镜观察，此藻以单一藻体存在，细胞为圆球状，直径约为5～10μm，经Nile Red染色后，以荧光显微镜观察到藻体内部有大量明显且呈现黄色的油滴分布，显示其藻体内可以蓄积油滴(图1A和B)。

18S序列分析：分析C40藻株的18S rDNA序列(SEQ ID NO:1)和NCBI的nr数据库比对后，发现与小球藻(Chlorella sorokiniana)UTEX 2714(LK021940.1)和绿球藻(Chlorella lewinii)CCAP 211/90(FM205861.1)，覆盖率为100％，相似度99％。以亲源分析结果得知，C40与Chlorella lewinii CCAP 211/90关系最近，结果如图2A所示，但由于18S序列鉴别度不高，故再进行ITS序列比对。

ITS序列分析：将C40的ITS序列(SEQ ID NO:2)和NCBI的nr数据库比对后，发现与藻株Chlorella lewinii KU220(KM061464.1)、Chlorella lewinii KU201(KM061450.1)和Chlorella lewinii KU213(KM061460.1)的ITS序列相近，故以KU220、KU201、KU213和上述CCAP 211/90的ITS序列与C40的ITS序列进行比对。以亲源分析结果各藻种ITS序列得知，C40与Chlorella lewinii CCAP 211/90关系最近，结果如图2B所示。利用VNTI AlignX软件比对，结果发现比对覆盖率100％时，相似度为分别为99.3％、99.1％、98.8％和98.8％，比对结果如图3所示，分析发现C40的ITS序列与上述各藻株的序列至少有5个核酸序列位置不同。

综合上述序列分析结果得知C40应为Chlorella lewinii，且与目前被发表的最相近藻种仍有差异。

Chlorella lewinii C40已于2016年12月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2016742。

实例二、C40的组成分析

油脂分析

C40以800mL C培养基，培养于1L血清瓶中，并通入无菌空气，于30℃照光培养一个月。收集藻体后将其冷冻干燥成藻粉，秤取定量的藻粉萃取其油脂，发现其含油量为40.2％的藻体干重。分析其油脂成分，三酸甘油酯(TAG)含量为99.3％(表1)。脂肪酸组成则为C16:0占22.3％、C18:1占42.5％、C18:2占20.3％、C18:3占14.9％。饱和脂肪酸比例为22.3％，单元不饱和脂肪酸比例为42.5％，多元不饱和脂肪酸比例为35.2％。欧盟生质柴油标准的DU值经计算为112.9，优于标准值(表2)。又其C18:1为ω-9形式、C18:2为ω-6形式，C18:3为ω-3形式，皆是食用油脂中对人体较好的油脂，在此藻体中含量丰富，因此本藻种亦可作为食用油。根据上述结果显示，C40的油脂可作为食用油和生质柴油。

表1

注:TAG:三酸甘油酯(triacylglycerol)

FA:脂肪酸(fatty acid)

1,3-DAG:1,3-双酰基甘油酯(1,3-diacylglycerol)

1,2-DAG:1,2-双酰基甘油酯(1,2-diacylglycerol)

MAG:单酰基甘油酯(monoacylglycerol)

-:低于检测极限

表2

DU：不饱和度(Degree of Unsaturation)＝(单不饱和,w％

+2(多不饱和,w％)(Ramos,M.J.,et al.,Influence of fatty acidcomposition of raw materials on biodiesel properties.Bioresource Technology2009；100:261-268)

实例三、C40的培养特性分析

1.不同温度培养测试

将藻体均匀接种于C培养基中，各平板放入含20％二氧化碳的密封袋中，以不同温度20℃、30℃与40℃进行照光培养。结果显示C40可生长在20-40℃，以30℃培养生长最好，20℃和40℃亦生长良好(图4)。

2.不同盐度培养基测试

比较C40于不同盐度培养基的生长状况，结果显示在0-3％盐度的环境皆可生长(图5)，以1.5％盐度生长最好，故此藻种能够以淡水与海水进行培养。

3.不同pH值培养基测试

比较C40于不同pH值培养液中的生长状况，结果显示C40在pH4-10的C培养液中均可生长(图6)，以pH5-7之间生长最好。故此藻种可生长于pH4-10的范围。

4.有机培养基培养测试结果

C40以TSA、PDA和NA培养的结果分述如下：

TSA培养：混营条件下，于30℃且给予12小时光照12小时黑暗的光周期条件下，观察C40呈现快速的生长，且约在24小时后即可观察到明显的藻体生长状态。异营条件下，于30℃的黑暗条件下，于24小时后也可观察到明显的藻体生长状态(图7)。故C40以TSA培养时，可行混营与异营生长。

以PDA培养：混营条件下，于30℃且给予12小时光照12小时黑暗的光周期条件下，于24小时和96小时观察C40有生长。异营条件下，于30℃的黑暗条件下，于24小时和96小时观察C40有生长(图7)。故C40以PDA培养时，也可以混营与异营方式生长。

NA培养：混营条件下，于30℃且给予12小时光照12小时黑暗的光周期条件下，于24小时和96小时观察C40有生长。异营条件下，于30℃的黑暗条件下，于24小时和96小时观察C40也有生长(图7)。故C40以NA培养时，可以混营与异营方式生长。

由上述结果得知C40在混营与异营条件下，分别以TSA、PDA和NA培养，皆可快速生长，其中以TSA混营条件下生长最快。TSA培养基中含有胰水解蛋白(Tryptone)和大豆水解蛋白(Soytone)两种成分，C40可以利用此两种氮源生长，故C40可能具有处理乳清或是大豆废水，降低废水中含氮量的潜力。

5.藻株固碳效率测试

C40藻株以1公升的体积利用5％的二氧化碳气体，以0.1vvm的通气量培养10天后，共固定6.3克的二氧化碳生成微藻的藻体。利用第6～10天固碳稳定期进行评估，C40藻株的固碳效率为595.78±37.79mg/L/day(图8)。

根据以上测试结果发现，C40可生长在20-40℃，以30℃培养生长最好，20℃和40℃生长良好。又其可生长在0-3％盐度的环境，以1.5％盐度生长最好。又其可生长在pH4-10的环境，以pH5-7之间生长最好。C40亦可行自营、混营与异营性生长。以C培养基通入空气培养一个月后其油量占微藻体干重的40.2％，其脂肪酸组成适合作为生质柴油与食用油。又其固碳效率为595.78±37.79mg/L/d，可作为固碳之用。

结论

由台湾分离一株产油微藻C40，经由鉴定为Chlorella lewinii。本藻种可生长于温度20-40℃、盐度0-3％和pH4-10。又本藻株可行混营和异营培养。C40藻株的培养条件测试结果得知，本藻株在高低温、淡水海水、各种pH(pH4～10)和自营、异营与混营皆可生长，是一个在任何环境下皆可生长的优良藻株。此藻株的干燥藻体的含油量在40.2％。油脂的脂肪酸组成以C16～C18的脂肪酸为主，占总组成100％，其中C18:1占42.5％，可作为食用油脂。其固碳效率为595.78±37.79mg/L/d。由以上的结果显示Chlorella lewinii C40藻株可以做为生产食用油脂和生质柴油的原料，也可做为二氧化碳和废水减废之用。

序列表

<110> 财团法人食品工业发展研究所

<120> 绿球藻(CHLORELLA LEWINII)藻株及其用途

<130> F16083-CN26210

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1691

<212> DNA

<213> 绿球藻(Chlorella lewinii)

<220>

<221> 18S rDNA

<222> (1)..(1691)

<400> 1

cagtatagtt tatttgatgg tacctactac tcggataccc gtagtaaatc tagagctaat 60

acgtgcgtaa atcccgactt ctggaaggga cgtatttatt agataaaagg ccgaccgggc 120

tctgcccgac tcgcggtgaa tcatgataac ttcacgaatc gcatggcctc gcgccggcga 180

tgtttcattc aaatttctgc cctatcaact ttcgatggta ggatagaggc ctaccatggt 240

ggtaacgggt gacggaggat tagggttcga ttccggagag ggagcctgag aaacggctac 300

cacatccaag gaaggcagca ggcgcgcaaa ttacccaatc ctgacacagg gaggtagtga 360

caataaataa caatactggg ccttttcagg tctggtaatt ggaatgagta caatctaaac 420

cccttaacga ggatcaattg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct 480

ccaatagcgt atatttaagt tgctgcagtt aaaaagctcg tagttggatt tcgggtgggg 540

cctgccggtc cgccgtttcg gtgtgcactg gcagggccca ccttgttgcc ggggacgggc 600

tcctgggctt cactgtccgg gactcggagt cggcgctgtt actttgagta aattagagtg 660

ttcaaagcag gcctacgctc tgaatacatt agcatggaat aacacgatag gactctggcc 720

tatcctgttg gtctgtagga ccggagtaat gattaagagg gacagtcggg ggcattcgta 780

tttcattgtc agaggtgaaa ttcttggatt tatgaaagac gaactactgc gaaagcattt 840

gccaaggatg ttttcattaa tcaagaacga aagttggggg ctcgaagacg attagatacc 900

gtcctagtct caaccataaa cgatgccgac tagggatcgg cggatgtttc ttcgatgact 960

ccgccggcac cttatgagaa atcaaagttt ttgggttccg gggggagtat ggtcgcaagg 1020

ctgaaactta aaggaattga cggaagggca ccaccaggcg tggagcctgc ggcttaattt 1080

gactcaacac gggaaaactt accaggtcca gacatagtga ggattgacag attgagagct 1140

ctttcttgat tctatgggtg gtggtgcatg gccgttctta gttggtgggt tgccttgtca 1200

ggttgattcc ggtaacgaac gagacctcag cctgctaaat agtcacggtt ggctcgccag 1260

ccggcggact tcttagaggg actattggcg actagccaat ggaagcatga ggcaataaca 1320

ggtctgtgat gcccttagat gttctgggcc gcacgcgcgc tacactgatg cattcaacga 1380

gcctagcctt ggccgagagg cccgggtaat ctttgaaact gcatcgtgat ggggatagat 1440

tattgcaatt attaatcttc aacgaggaat gcctagtaag cgcaagtcat cagcttgcgt 1500

tgattacgtc cctgcccttt gtacacaccg cccgtcgctc ctaccgattg ggtgtgctgg 1560

tgaagtgttc ggattggcga ccgagggcgg tctccgctct cggccgccga gaagttcatt 1620

aaaccctccc acctagagga aggagaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt gaacctgcgg 1680

aaggatcatt g 1691

<210> 2

<211> 751

<212> DNA

<213> 绿球藻(Chlorella lewinii)

<220>

<221> ITS

<222> (1)..(751)

<400> 2

aatcgatcga atccacaccg gtaaccaaac gtcgccctcg ggtgttgtcg tagccttggt 60

gctgccactt acccgagcgt cggcccctgg tctggggctc tcacgagccg cttccaggtc 120

cggcgggctc ctcccttggg ttcatcccct ggggttggcg tcggccaaaa cacctctgta 180

tccaaccctc ttttttccct cctcccctgg gaggaggttg aaaagaggca acacacccca 240

aaacacaacc acttctgaag catctttggt ggctcggccc cgtgccgtcc actgcaaacc 300

aaagacaact ctcaacaacg gatatcttgg ctcccgtatc gatgaagaac gcagcgaaat 360

gcgatacgta gtgtgaattg cagaattccg tgaaccatcg aatctttgaa cgcaaattgc 420

gcccaaggct tcggccgagg gcatgtctgc ctcagcgtcg gtttacaccc tcgccctccc 480

ccaccctgtt gtggtgggcg gttggtgcgg acctggccct cccggctcca ctctctcctt 540

tgtgagcgag cgtccgggtt ggctgaagtt gagaggcttg agcatggacc ccgtttgcag 600

ggcaatggct tggtaggtag gcacccccta cacagcctgt cgttgcccga ggggactttg 660

ctggaggccc agcaggaatt cggctgtcca ccggacagtt ggagtactca ctcattcgac 720

ctgagctcag gcaagattac ccgctgaatt t 751

- 2 -

Claims (13)

1.一种绿球藻(Chlorella lewinii)分离藻株，其包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的18S rDNA序列和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的ITS区域序列。

2.根据权利要求1的绿球藻分离藻株，其中所述的绿球藻分离株为保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016742的藻株，或为与保藏于中国典型培养物保藏中心且保藏编号为CCTCC M 2016742的藻株具有实质上完全相同特征的变异株。

3.一种制备绿球藻培养产物的方法，其包含将根据权利要求1或2中所述的的绿球藻分离藻株接种于培养基中，和进行培养以获得所述的培养产物。

4.根据权利要求3的方法，其中所述的培养基为液态培养基。

5.根据权利要求3的方法，其中所述的培养在不照光下、12小时光照12小时黑暗的光周期下、或持续光照下进行。

6.根据权利要求3的方法，其中所述的培养系在约10℃至约60℃下进行。

7.根据权利要求3的方法，其中所述的培养基的pH值为约pH1至约pH14。

8.根据权利要求3的方法，其中所述的培养基的盐度为约0％至约6％。

9.根据权利要求3至8中任一权利要求所述的方法，其进一步包含分离所述的培养产物的步骤。

10.一种绿球藻培养产物，其可由权利要求3至9中任一权利要求所述的方法来获得。

11.根据权利要求10的绿球藻培养产物，其包含三酸甘油酯和脂肪酸。

12.一种制备三酸甘油酯和/或脂肪酸的方法，其包含自根据权利要求10或11中所述的绿球藻培养产物中分离出三酸甘油酯和/或脂肪酸。

13.一种制备生质燃料的方法，其包含使用根据权利要求10或11中所述的绿球藻培养产物作为原料。