CN102492626A

CN102492626A - 拟微绿球藻及其应用

Info

Publication number: CN102492626A
Application number: CN2011104252101A
Authority: CN
Inventors: 吴洪; 尹顺吉; 陈传红; 张成武; 马建源; 王冰
Original assignee: ENN Science and Technology Development Co Ltd
Current assignee: ENN Science and Technology Development Co Ltd
Priority date: 2011-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2031-12-16
Also published as: CN102492626B

Abstract

一种保藏号为CGMCC No.5148的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A。本发明提供的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A具有生物量高的特性，该藻株具有生长速度快、培养密度高的优势，适合产业化应用。而且本发明提供的藻株由于油脂含量高而特别适合生物柴油的生产。本发明提供的藻株富含EPA等长链不饱和脂肪酸并且蛋白质脂肪含量总和达到60％以上，适合用于保健品、医药品、食品的开发。

Description

拟微绿球藻及其应用

技术领域

本发明涉及微生物工程领域，具体而言，本发明涉及一种拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)及其应用。

背景技术

化石能源的大量使用，极大地加剧了大气环境污染和气候变化以及酸雨区面积的增大，寻找新的可持续的环境安全的生物资源来生产生物燃料以替代化石燃料势在必行。生物柴油(Biodiesel)又是用未加工过的或者使用过的植物油以及动物脂肪通过不同的化学反应制备出来的一种被认为是环保的生物燃料。这种生物燃料可以像柴油一样使用。生物柴油是已得到证明的燃料，其在能源性质方面可以部分替代化石柴油，是最具发展潜力的液体生物燃料之一。

微藻是一类在水中生长的种类繁多且分布极其广泛的低等植物，它是有阳光驱动的细胞工厂，通过微藻细胞高效的光合作用，吸收CO₂，将光能转化为脂肪或淀粉等化合物的化学能，并放出O₂。微藻是光合效率最高的微生物，也是自然界中生长最为迅速的一种低等生物，而且某些微藻可以生长在高盐、高碱环境的水体中，可充分利用滩涂、盐碱地、沙漠进行大规模培养，也可利用海水、盐碱水、工业废水等非农用水进行培养，还可利用工业废气中的CO₂。因此，微藻生物柴油成为了潜在的能源研究热点。

拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)细胞个体较小，生长速度快，可进行超高密度培养。在诱导的条件下，拟微绿球藻细胞中会大量积累三脂酰甘油(TAG)，它是生物柴油生产的最好原料。其营养价值丰富，含有较高不饱和脂肪酸和类胡萝卜素，特别是二十碳五烯酸(EPA)和独特的堇菜黄素，EPA含量占细胞含量的4％左右，EPA具有抗血栓形成、调节血脂、抗凝血、扩张血管、降血压、抗心律失常等作用，是中老年人保持健康血脂指标最佳选择。此外，拟微绿球藻被广泛用作为许多水产品幼体的开口饵料或轮虫的饵料。同时，拟微绿球藻可用作商业应用的色素、二十碳五烯酸(EPA)和维生素E的生产藻株。

魏东，张学成等在名称为富含EPA的海洋微藻眼点拟微球藻的大规模培养(中国海洋药物，2003，1：5-10)的文献中公开了一种眼点拟微绿球藻。该文献中的眼点拟微绿球藻在1999年10月间在83.5m²户外池中大规模获得生物量的平均面积产率为1.09g/m²·d。

发明内容

由于现有技术中的微藻具有生长速度慢、生物量低，总油脂含量低、或是EPA等长链不饱和脂肪酸含量低等这些缺点，限制了微藻在产业上的应用。因此，本发明提供了一种新的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A，该藻株已于2011年8月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5148。

本发明提供的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的核苷酸序列包括序列1所示的核苷酸序列。

序列1为：

CCTACGGAAACCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCTAAATGATGAGGTT

TAGATAACTTCTCACGCTGCCGACCGAGGCCAGTGGCGCAATCCGAA

AGCTTCACCGAATCATTCAATCGGTAAGTGCGACGGGCGGTGTGTAC

AAAGGGCAGGGACGTAATCAATGCGAGCTGATGACTCGCGTTTACTA

GGAATTCCTCGTTCAAGATTAATAGTTGCAATAATCTATCCCTATCAC

GATGCGCATTTCAAGATTACCCGGTCCTTCCGGACAAGGTTATAAACT

CGTTGAACGCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGGACATCTAAGG

GCATCACAGACCTGTTATTGCCCCCAACTTCCTTCGGCCTAGCGCCGA

AAGTCCCTCTAAGAAGTCTCTGGCAATGCTAAGCATTCCCAGTACTAT

TTAGCAGGCGGGGGTCTCGTTCGTTAACGGAATTAACCAGACAAATC

ACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAGTCAAG

AAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTAAGT

TTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTG

CCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCC

GGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAAGGTGCCGATGGGGCCTTAC

AATGCACCCACCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTAC

GATGGTATCTAATCATCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATTAATG

AAAACATCCTTGGTAAATGCTTTCGCAGTAGTTCGTCTTCCATAAATC

CAAGAATTTCACCTCTGACAATTGAATACGAATACCCCCAACTATCCC

TATTAATCATTACCTTGGCGTGCAAACCAACAAAATAGACCACCAAG

GTCGTATCTTATTATTCCATGCTAATGTATTCAGGGCCTAAGCCTGCT

TCGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGATAGGGATCCCGACCCC

AACAACTTAATGCCAGAATCGCTCTCCCCAAGGATGACAGGAACCAA

CAATAGTACGGCCCCTTATCGGAACCGACCAGCCGTCCCTGCCAGAA

ATCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAGTATACGCTATTG

GAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTG

ATCCTCGATAAGGGATTTAAATTGTTCTCATTCCAATTGCCAGAGTTA

AACCCCGGCATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTG

GGTAATTTACGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTCTCTC

AGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCCAATTCTCCGTTACCCGTTAGAG

CCATGGTAGGCCAATACCCTACCATCCAAAGCTGATAGGGCAGAAAC

TTGAATGATTCGTCGCTGGCGAAAGCCGGCGATCCGCAAAGTTATCA

TGATTCACCACAATACCGGGTTGCCCCGCATTGGTTTCTATCTAATAA

ATACATCCCGTCCGACAAGCAGTTGGGAGTTGATGCATGTATTAGCT

CTAGAATTACTACGGTTATCCAAGTAGTAAAGGACTATCAAATAAAC

TATAACTGATATAATGAGCCATTCGCAGGTTCAGAGAAAACTCTTTAT

TCTCAGACGTGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCGTATGACTA

本发明提供的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的核苷酸序列包括序列2所示的核苷酸序列。

序列2为：AAGGATCATTACCAAAACATTACATGCCTCCTGGCGT

ACGCTTCGAGGCATTACACTTCACAACCTGTGCATTGTTTACTCCTGTGAACGCTATACAAGCACGTGCTCCCGGCCACGCCCTGCGATGGTTGCTTTGGATGGTTCCTCGGAACACGTCGAAGCCGTGGCCGAATGTGGGAGGGCGTCTCTAAATATCCTCAAACACCATTCGCAACATTTTATCAACCTTTCCAAACCGATTGTTTATACCTCATTCAAGGCTTTTCTAGTCTTCCGACAGAAAAGCCTGGTGCATGTTTCCATGCGAAACGAGCGCCCGCAATGAAAATACAACTTTCAGCAACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAATTGCAGAATTCCGCGAGTCATCAAACCTTTGAACGCACCTTGCGCTTTCGGGATATGCCCGTTAGCATGTTTGTTGGAGTGTCTGTTAACCCCAATCACCACCTTGTTGTGACTTCAGAGTCATGCCAAGCAGTCGGTGGACGTTACTTGCTCCCGATACTTCGCCCGCTGCGAATTCTGTTGTCACCTCCTCTGACGAGGAACTGGCCAGAAGCTGGAGTGCGGGCGTGGAGTGAAGTAGGGCCGGCCACATACAGTCACTGGGACCACGCAACTCCTAGAGCTGCCCCCGTGAACGTGACGAGTCTTCTAATCAAGGCAATCCGTTTGCGGTCTAAAAGGTGCTCGTTTAACGGAAGCGCTAGTCTACACCAAACAGTTTCGACTTGGCGGCATCTTCTCGGTGACTTTTAACAAACACCGAGAAAGCCTTTGGACTGATCCTGGCACTCGTTGCCGTGTCATTCCATCTCCAATTCGGACCTCCAATCAAGCAAGGCTACCCGCTGAATTTAA。

本发明提供的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的形态特征为：细胞大小为2～5μm；细胞形状为球形或近球形；细胞颜色为绿色或黄绿色；细胞分裂形成两个似亲孢子；细胞内有红色眼点。

根据本发明的一个方面，本发明提供的拟微绿球藻(Nannochloropsissp)ENN1003A在培养16天时干重达到9g/L；该微藻的藻粉的总脂含量为藻粉干重的45.9％(重量百分比)。

本发明还提供了拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的以下用途：在制备预防和治疗心脑血管疾病的药物或保健品方面的应用；在食品方面的应用；在生产生物燃料尤其是生物柴油中的应用；在废水处理、废气处理、CO₂减排方面的应用；在生产色素、水产品饵料、动物饲料、化妆品方面的应用。

本发明通过自然界藻种分离纯化及筛选，获得一株性能良好的拟微绿球藻藻株。

由于本发明提供的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A在培养16天时干重可达到9g/L，10月间户外池中培养平均面积产率可达5～8g/m²·d，因此具有生物量高、生长速度快、培养密度高的优势，适合产业化应用。

而且本发明提供的藻株的总油脂含量可达60％(重量百分比)，具有油脂含量高的特性，特别适合生物柴油的生产。

本发明提供的藻株中的EPA含量为藻粉干重的3％～7.5％(重量百分比)；花生四烯酸含量为藻粉干重的0.7％～3.5％(重量百分比)，EPA具有抗血栓形成、调节血脂、抗凝血、扩张血管、降血压、抗心律失常等作用，是中老年人保持健康血脂指标最佳选择，花生四烯酸具有酯化胆固醇、增加血管弹性、降低血液粘度，调节血细胞功能等一系列生理活性，对预防心血管疾病、糖尿病和肿瘤等具有重要功效，因此本发明提供的藻株可以用于开发用于预防和治疗心脑血管疾病的药物、保健品和食品。

本发明提供的藻株中的蛋白质含量为藻粉干重的10～30％(重量百分比)，总油脂含量为藻粉干重的10～60％(重量百分比)，是做营养品的最佳原料来源。

本发明提供的藻株作为生长迅速、富含EPA的拟微绿球藻可被广泛用作为许多水产品幼体的开口饵料或轮虫的饵料。此外，其富含蛋白质、各种不饱和脂肪酸和必须氨基酸，可用于开发生产动物饲料。

附图说明

图1为拟微绿球藻(Nannochloropsis sp)ENN1003A的显微镜检图片。

图2为不同藻株18S序列进化树。以莱茵衣藻，三角褐指藻，梅氏小环藻和部分拟微绿球藻(Nannochloropsis)的18S序列为基础，使用邻接法(Neighbor-Joining)制作进化树。

图3示出不同藻株ITS序列进化树，以莱茵衣藻，三角褐指藻，梅氏小环藻和部分拟微绿球藻(Nannochloropsis)的ITS序列为基础，使用Neighbor-Joining法制作进化树。

图4为Blast获得的部分拟微绿球藻(Nannochloropsis)藻株ITS序列进化树，使用Neighbor-Joining法制作。

图5示出ENN1003A与UTEX LB2164(Nannochloropsis oculata)的OD₇₅₀(Optical Density，在750nm处的吸光度)值变化曲线。

图6示出ENN1003A与UTEX LB2164(Nannochloropsis oculata)的叶绿素a含量变化曲线。

图7示出ENN1003A与UTEX LB2164(Nannochloropsis oculata)的干重变化曲线。

图8示出ENN1003A与UTEX LB2164(Nannochloropsis oculata)的油脂含量变化。

图9为不同水源ENN1003A生物量变化图。

图10为不同气源ENN1003A干重变化曲线图。

图11为不同气源ENN1003AOD₇₅₀值变化曲线图。

图12示出不同水源和气源对ENN1003A油脂累积的影响。

图13示出不同水源和气源对ENN1003AEPA含量的影响。

具体实施方式

下面将详细描述本发明的具体实施方式，这仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

实施例1藻种分离、纯化、筛选

在青岛石老人附近海域取水样。向水样中加1/3体积的海水培养基，在25℃、光照强度为50μmol/m²·s的条件下培养10天左右，取该水样于显微镜下观察，判断水样中存在的主要物种。调整细胞浓度约为1000个/ml，取100μl水样铺于海水培养基的固体琼脂板上，在25℃、光照强度为50μmol/m²·s左右的条件下培养两周左右，即可看到单藻落长出，用接种环或无菌牙签挑取藻落接种于表1示出的海水培养基中培养。

表1海水培养基配方

组分	克/升
		NaCl	27.0
MgSO₄.7H₂O	6.6
		MgCl₂.6H₂O	5.6
KNO₃	1.45
		CaCl₂.2H₂O	1.5
KH₂PO₄	0.12
		NaHCO₃	0.04
Fe-EDTA溶液	1.0mL
		微量元素溶液	1.0mL

Fe-EDTA溶液的配置：2.76g FeCl₃·6H₂O溶入1000mL的0.05MNa₂EDTA溶液中。

微量元素溶液的配方如表2所示：

表2微量元素溶液的配方

组分	毫克/升
		CuSO₄.5H₂O	10
ZnSO4.7H₂O	22
		CoCl₂.6H₂O	10
MnCl₂.4H₂O	180
		Na₂MoO₄.2H₂O	6

将生长出的纯系藻液分别在三角瓶、柱式反应器中培养，定期测定干重和油脂含量，从中挑选生长速度快、油脂含量高的藻株。其中编号为ENN1003A的藻株具有较高的生长速度、油脂含量，并富含EPA(二十碳五烯酸)。

实施例2分类鉴定

①形态鉴定：

在显微镜下观察ENN1003A，细胞较小，细胞球形或近球形；细胞大小在2～6μm；细胞通常为绿色或黄绿色，细胞分裂通常形成两个似亲孢子。细胞内红色色素点明显。初步鉴定为Nannochloropsis sp。

显微镜检图片如图1所示。

②分子鉴定：

18s序列扩增采用真核生物ITS扩增通用引物(引物合成由上海生工生物工程公司合成)。

引物1 5’TTGATCCTTCTGCAGGTTCA 3’

引物2 5’CCTGGTTGATCCTGCCAG 3’

PCR扩增获得约1500bp片断。

ENN1003A 18s部分序列序列1(加粗字体代表引物序列)如下：

CCTACGGAAACCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCTAAATGATGAGGTTTAGATAACTTCTCACGCTGCCGACCGAGGCCAGTGGCGCAATCCGAAAGCTTCACCGAATCATTCAATCGGTAAGTGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAATGCGAGCTGATGACTCGCGTTTACTAGGAATTCCTCGTTCAAGATTAATAGTTGCAATAATCTATCCCTATCACGATGCGCATTTCAAGATTACCCGGTCCTTCCGGACAAGGTTATAAACTCGTTGAACGCATCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGGACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCCCCAACTTCCTTCGGCCTAGCGCCGAAAGTCCCTCTAAGAAGTCTCTGGCAATGCTAAGCATTCCCAGTACTATTTAGCAGGCGGGGGTCTCGTTCGTTAACGGAATTAACCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCATAGAGTCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTACTATGTCTGGACCTGGTAAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCGGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCATAAGGTGCCGATGGGGCCTTACAATGCACCCACCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGATGGTATCTAATCATCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACATCCTTGGTAAATGCTTTCGCAGTAGTTCGTCTTCCATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATTGAATACGAATACCCCCAACTATCCCTATTAATCATTACCTTGGCGTGCAAACCAACAAAATAGACCACCAAGGTCGTATCTTATTATTCCATGCTAATGTATTCAGGGCCTAAGCCTGCTTCGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGATAGGGATCCCGACCCCAACAACTTAATGCCAGAATCGCTCTCCCCAAGGATGACAGGAACCAACAATAGTACGGCCCCTTATCGGAACCGACCAGCCGTCCCTGCCAGAAATCCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAGTATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGATCCTCGATAAGGGATTTAAATTGTTCTCATTCCAATTGCCAGAGTTAAACCCCGGCATTGTTATTTATTGTCACTACCTCCCTGTGTCAGGATTGGGTAATTTACGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTCTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCCAATTCTCCGTTACCCGTTAGAGCCATGGTAGGCCAATACCCTACCATCCAAAGCTGATAGGGCAGAAACTTGAATGATTCGTCGCTGGCGAAAGCCGGCGATCCGCAAAGTTATCATGATTCACCACAATACCGGGTTGCCCCGCATTGGTTTCTATCTAATAAATACATCCCGTCCGACAAGCAGTTGGGAGTTGATGCATGTATTAGCTCTAGAATTACTACGGTTATCCAAGTAGTAAAGGACTATCAAATAAACTATAACTGATATAATGAGCCATTCGCAGGTTCAGAGAAAACTCTTTATTCTCAGACGTGCATGGCTTAATCTTTGAGACAAGCGTATGACTA

将ENN1003A的18s扩增序列登录GenBank数据库进行BLAST比对，结果显示与索引号为AF067956.1的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.StrainIOLR)的18S核糖体RNA基因序列序列最为相似，匹配度为99％，覆盖率为100％。

排在比对结果第二位的是索引号为AF045035.1的拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.CCAP211/78)的18S核糖体RNA基因序列，它与ENN1003A 18s序列的匹配度为99％，覆盖率为99％。

根据ENN1003A 18s核糖体RNA基因序列的Blast结果，选取莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，梅氏小环藻(Cyclotella meneghiniana strain G18W41)，拟微绿球藻(Nannochloropsis sp.Strain IOLR)，拟微绿球藻(Nannochloropsismaritima)，眼点拟微绿球藻(Nannochloropsis oculata CCMP533)，湖泊拟微绿球藻(Nannochloropsis limnetica isolate AS3-9)，球形拟微绿球藻(Nannochloropsis granulata CCMP535)，海洋拟微绿球藻(Nannochloropsisoceanica)和ENN1003A的18s序列，输入MEGA4.0，进行clustal W同源比对，然后采用Neighbor-Joining算法，Bootstrap值为1000，根据比对结果绘制进化树(如图2所示)。

从图2中可看出三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)和梅氏小环藻(Cyclotella meneghiniana strain G18W41)与Nannochloropsis的亲缘关系较近，莱茵衣藻最远。

ITS序列扩增采用真核生物ITS扩增通用引物(引物合成由上海生工生物工程公司合成)。

引物1 5’TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3’

引物2 5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’

PCR扩增获得约1000bp片断。

ENN1003A ITS部分序列(粗体字体代表引物序列)序列2如下：

AAGGATCATTACCAAAACATTACATGCCTCCTGGCGTACGCTTCGAGGCATTACACTTCACAACCTGTGCATTGTTTACTCCTGTGAACGCTATACAAGCACGTGCTCCCGGCCACGCCCTGCGATGGTTGCTTTGGATGGTTCCTCGGAACACGTCGAAGCCGTGGCCGAATGTGGGAGGGCGTCTCTAAATATCCTCAAACACCATTCGCAACATTTTATCAACCTTTCCAAACCGATTGTTTATACCTCATTCAAGGCTTTTCTAGTCTTCCGACAGAAAAGCCTGGTGCATGTTTCCATGCGAAACGAGCGCCCGCAATGAAAATACAACTTTCAGCAACGGATGTCTTGGCTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAATTGCAGAATTCCGCGAGTCATCAAACCTTTGAACGCACCTTGCGCTTTCGGGATATGCCCGTTAGCATGTTTGTTGGAGTGTCTGTTAACCCCAATCACCACCTTGTTGTGACTTCAGAGTCATGCCAAGCAGTCGGTGGACGTTACTTGCTCCCGATACTTCGCCCGCTGCGAATTCTGTTGTCACCTCCTCTGACGAGGAACTGGCCAGAAGCTGGAGTGCGGGCGTGGAGTGAAGTAGGGCCGGCCACATACAGTCACTGGGACCACGCAACTCCTAGAGCTGCCCCCGTGAACGTGACGAGTCTTCTAATCAAGGCAATCCGTTTGCGGTCTAAAAGGTGCTCGTTTAACGGAAGCGCTAGTCTACACCAAACAGTTTCGACTTGGCGGCATCTTCTCGGTGACTTTTAACAAACACCGAGAAAGCCTTTGGACTGATCCTGGCACTCGTTGCCGTGTCATTCCATCTCCAATTCGGACCTCCAATCAAGCAAGGCTACCCGCTGAATTTAA

将ENN1003A的ITS部分序列登录GenBank数据库进行BLAST比对，结果显示与ACCESSION号为DQ074696.1的拟微绿球藻(Nannochloropsismaritima)藻的ITS序列最为相似，匹配度为98％，覆盖率为100％。

排在比对结果第二位的是ACCESSION号为DQ069777.1的海洋拟微绿球藻(Nannochloropsis oceanica strain MBIC 10090)藻的ITS序列序列，它与ENN1003A ITS序列的匹配度为97％，覆盖率为100％。

根据ENN1003A ITS序列的Blast结果，选取莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)，三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)，梅氏小环藻(Cyclotella meneghiniana strain G18W41)，拟微绿球藻(Nannochloropsismaritima)，海洋拟微绿球藻(Nannochloropsis oceanica strain MBIC 10090)，海洋拟微绿球藻(Nannochloropsis oceanica strain LAMB0001)，球形拟微绿球藻(Nannochloropsis granulata strain MBIC 10054)，湖泊拟微绿球藻(Nannochloropsis limnetica strain SAG 18.99)和ENN1003A的ITS序列，输入MEGA4.0，进行clustal W同源比对，然后采用Neighbor-Joining算法，Bootstrap值为1000，根据比对结果绘制进化树(如图3所示)。

从图3中可看出三角褐指藻和梅氏小环藻与拟微绿球藻(Nannochloropsis)的亲缘关系较近，莱茵衣藻最远。

同时，使用同样的方法，将Blast获得的部分拟微绿球藻藻株的ITS序列输入MEGA4.0，进行clustal W同源比对，然后采用Neighbor-Joining算法，Bootstrap值为1000，根据比对结果绘制进化树(如图4所示)。

从图4中可看出ENN1003A与Nannochloropsis maritima和Nannochloropsis oceanica的亲缘关系较近，位于同一个分支上。而Nannochloropsis granulata和Nannochloropsis limnetica则位于另一分支上，与ENN1003A关系较远。

实施例3组分测定

将表3的三份ENN1003A藻粉送检，样品1为绿色期藻粉(即生长前期，未诱导产油)，样品2和样品3为黄色期藻粉(即生长后期，营养限制诱导或光诱导产油)。

表3送检的3份样品基本情况

表4送检的3份藻粉生长条件

谱尼分别使用以下方法测定各组分含量：

GB/T 6435-2006测定水分，GB-T 6438-2007测定灰分，GB-T 6432-1994测定蛋白质，GB/T 6433-2006测定总脂肪，GB/T 6434-2006测定粗纤维。

表5送检的藻粉组成成分(％藻粉干重)

谱尼使用AOAC 996.06测定脂肪酸含量。

表6送检的藻粉中脂肪酸含量(％藻粉干重)

表7送检的藻粉中三类脂肪酸的含量(％藻粉干重)

谱尼使用以下方法测定重金属含量：

GB/T 5009.12-2003测定铅含量，GB/T 5009.11-2003测定砷含量，GB/T5009.17-2003测定汞含量，GB/T 5009.15-2003测定镉含量。

表8样品1中重金属含量(mg/kg)

绿色期藻粉(即生长前期，未诱导产油)样品1蛋白、脂肪含量共占藻粉干重的63.6％，黄色期藻粉(即生长后期，营养限制诱导或光诱导产油)样品2蛋白、脂肪含量共占藻粉干重的68.8％，并且重金属含量低于国家食品卫生安全标准，是做营养品的最佳原料来源，且符合饲料国家标准，可用于开发饲料产品。ENN1003A藻粉富含多不饱和脂肪酸，其中样品1(绿色期藻粉)含有藻粉干重7.2％的EPA(二十碳五烯酸)和3.1％的花生四烯酸(二十碳四烯酸)，是良好的保健品与食品原料。

实施例4三角瓶培养

将培养至对数生长期的ENN1003A藻种转接到装有200ml无菌培养基的三角瓶(容量为500ml)中，初始接种OD₇₅₀为0.2左右；光照强度约100μmol·m^-2s^-1光暗周期12∶12，温度为25+1℃，光源为日光灯，静置培养，每天摇瓶。培养17天，测定干重，并离心收集藻细胞，真空干燥，使用气相色谱测定藻粉脂肪酸组成及含量。

细胞干重测定：

使用的Whatman(GF/C)滤纸，空白滤纸事先烘干(105℃)称重，移取一定体积的藻液(根据所培养的藻液的浓度来确定取样的体积)真空抽滤，并用3倍样品量以上的体积的纯水清洗藻细胞，后放置在105℃的烘箱中过夜烘干，取出放置在干燥器中冷却后称重。计算单位体积细胞干重。

该藻培养17天平均干重为2.978g/L，脂肪酸组成及含量见表9：

总脂含量为18.19％，其中EPA(C20:5)含量较高为4.025％，占总脂的22.13％。

表9脂肪酸组成及含量表

实施例5.ENN1003A与UTEX LB2164(Nannochloropsis oculata)的柱式反应器培养对比

眼点拟微绿球藻UTEX LB2164(Nannochloropsis oculata)保存于德克萨斯大学藻类种质库UTEX(The Culture Collection of Algae at TheUniversity of Texas at Austin)，为该属典型藻种。

将培养至对数生长期的ENN1003A和UTEX LB2164藻种转接到容量500ml左右的4cm内径的柱式反应器中，调整初始接种OD₇₅₀为0.5-1左右；光源为日光灯，光照强度根据细胞状态和密度逐步增加，24h光照，通入掺有1-1.5％CO₂的空气培养，温度控制在25+2℃。定期取适量藻液，进行参数测定。

(1)细胞密度：用分光光度计测定750nm下藻液的吸光值(OD₇₅₀)来确定藻细胞密度。结果如图5所示。由图可见ENN1003A在整个生长周期保持旺盛生长速度，而对照眼点拟微绿球藻UTEX LB2164则培养第九天生长进入平台期。

(2)叶绿素a含量：移取一定体积的藻液放置在15ml的离心管中，3500转离心5min，去上清液；然后加入一定体积的甲醇震荡混匀留下的藻团，将离心管放置在70℃的水浴中加热提取5min，3500转离心5min，取上清液在665nm和750nm下测定吸光值。

叶绿素a含量(mg/L)＝13.9(OD₆₆₅-OD₇₅₀)*U/V

U：加入的甲醇体积；V：藻液体积

结果如图6所示。如图所示，叶绿素a含量呈先增加后下降的趋势，ENN1003A叶绿素a含量要明显高于对照眼点拟微绿球藻UTEX LB2164。

(3)细胞干重测定：

结果如图7所示。干重的变化总体上随时间的延长呈增加趋势，但ENN1003A在后期生物量积累能力要明显高于对照眼点拟微绿球藻UTEXLB2164。第16天，ENN1003A干重为9.05g/L，平均生长速度为0.54g/L/d；对照眼点拟微绿球藻UTEX LB2164干重为5.225g/L，平均生长速度为0.29g/L/d。

(4)总脂提取测定：

50mg或100mg冻干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶盖的体积为15-20ml的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2-4ml 10％DMSO-甲醇溶液，40℃砂浴(盛砂的烧杯放置恒温加热磁力搅拌器上)5分钟；然后在4℃下磁力搅拌抽提30分钟，3500转离心，转移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1∶1的乙醚-己烷4-8ml 4℃下磁力搅拌抽提1小时，3500转离心，转移上清液到上述一小瓶中。可重复上述过程直到藻渣变白。在上述合并抽提液中加入纯水使四者比例为1∶1∶1∶1，震荡分相，移取有机相转移到另一小玻璃瓶中，在通风橱中用氮气吹至较浓缩液转移到事先称重过的1.5ml塑料离心管中，再用氮气吹干至恒重。结果如图8所示。培养第16天时ENN1003A的总脂含量为藻粉干重的45.9％，对照眼点拟微绿球藻UTEXLB 2164的总脂含量仅为藻粉干重37.5％。

从以上结果可见，ENN1003A在OD₇₅₀值、叶绿素a、生物量和油脂含量上明显优与同种的UTEX LB 2164。第16天时该藻的干重比UTEXLB2164高出73.2％，OD₇₅₀值比UTEX LB 2164高出100％，叶绿素a含量在整个生长时期也明显高于UTEX LB 2164，在培养末期(第16天)ENN1003A总脂含量占干重的45.9％，而UTEX LB 2164总脂含量仅占干重的37.5％。

实施例6.废水、废气处理

利用达旗新奥新能化工反渗透浓排水(废水)和废气养殖ENN1003A实验。

不同水源(自来水、纯净水、反渗透浓排水)对ENN1003A藻类细胞生长影响见图9。水源为新能化工反渗透浓排水、达旗自来水和纯净水。结果表明达旗自来水对藻细胞的促生长效果最佳，其次为反渗透浓排水，且二者均高于对照组纯净水。其中对照组纯净水的单日生物量增长量为0.17g/L/d，而自来水和反渗透浓排水的单日生物量增长量分别为0.291g/L/d和0.216g/L/d，分别为对照组的1.712和1.271倍。

不同气源对ENN1003A藻细胞生长的影响见图10和图11。气源为达旗废气和钢瓶气。结果表明，无论是反渗透浓排水和纯净水，废气组的促生长效果优于钢瓶气，但差异不大，因此单从细胞生长角度，可以用达旗生产废气来替代钢瓶气提供该藻细胞生长所需要的碳源，并调整微藻的生存环境pH值在适宜的范围内。

对比纯净水钢瓶气和纯净水废气以及反渗透浓排水钢瓶气和反渗透浓排水废气四个实验组的油脂含量(图12)和EPA含量(图13)可以看出，废气对ENN1003A油脂含量和EPA无明显影响。而对比各种水源的油脂含量可以看出，总体而言，反渗透浓排水的油脂含量偏低一些，而自来水油脂含量最高，而反渗透浓排水完全可以用来做培养水源。

以上实验可见ENN1003A可以利用废水、废气生长，并积累油脂。在生长过程中可以吸收废水、废气中的N、P、S等元素化合物，起到废水与废气处理的效果。

实施例7脂肪酸组成及含量方法

为了使实验结果具有代表性，本发明综合不同培养条件及反应器培养的不同批次实验结果，测试了各批次ENN1003A藻的脂肪酸成分。结果见表10。

1)总脂提取方法：

取100mgENN1003A冻干藻粉放置在具Telfnon螺口瓶盖的体积为15-20ml的小玻璃瓶中，再放置一小磁力棒，加入2-4ml 10％DMSO-甲醇溶液，40℃砂浴(盛砂的烧杯放置恒温加热磁力搅拌器上)5分钟，然后在4℃下磁力搅拌抽提30分钟，3500转离心，转移上清液到另一小瓶中。剩下藻渣再加入1∶1的乙醚、正己烷4-8ml 4℃下磁力搅拌抽提1小时，3500转离心，转移上清液到上述一小瓶中。可重复上述过程直到藻渣变白。在上述合并抽提液中加入纯水使四者(水、DMSO-甲醇、乙醚、正己烷)体积比例为1∶1∶1∶1，震荡分相，移取有机相转移到另一小玻璃瓶中，在通风橱中用氮气吹至成浓缩液，然后转移到事先称重过的1.5ml塑料离心管中，再用氮气吹干至恒重，测定离心管增重量即为100mg冻干藻粉的总脂含量。

2)脂肪酸成分分析方法：

照上面方法进行提取脂肪酸后，用正己烷溶解，使用Agilent 6820气相色谱仪进行气相色谱分析(色谱条件为载气：氮气流量1ml/min、氢气流量30ml/min、空气流量300ml/min，进样口温度：280℃，检测器温度：280℃，检测器类型：FID，色谱柱：DB-5毛细管色谱柱(30m×0.25mm，0.25μm)，分流比：4∶1。分析方法：内标法(气相色谱用氮气作载气，相当于液相色谱的流动相)。

表10脂肪酸组成及含量表

实施例8ENN1003A耐低温实验

ENN1003A在24小时连续低温(13℃)的条件下连续生长17天，可达到干重9.46g/L。在-20℃条件下速冻该藻株48小时，取出后低光常温培养仍能存活。表明ENN1003A具有较好的耐低温性能和存活性能。