CN112430546B

CN112430546B - 莱茵衣藻、莱茵衣藻粉的异养发酵制备方法及应用

Info

Publication number: CN112430546B
Application number: CN202011352884.9A
Authority: CN
Inventors: 牛志国; 周萍; 赵元芬; 王力平; 王照雪; 吴会广
Original assignee: Shanxi Touyun Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanxi Touyun Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2022-11-11
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN112430546A

Abstract

本发明提供了一种莱茵衣藻、莱茵衣藻粉的异养发酵制备方法及应用，莱茵衣藻粉的制备方法包括以下步骤：（a）将莱茵衣藻种子接种到种子罐中进行异养培养，培养完成后，以1～5vol%的接种量接种到发酵罐中进行异养发酵；所述种子罐和发酵罐的培养温度均为15～38℃、压力为0.03～0.08MPa、pH为5.0～8.0、溶解氧为10～100%、搅拌转速为0～700转/分；（b）发酵结束后，将所得发酵液进行膜分离得到莱茵衣藻固体产物；（c）将所得产物进行喷雾干燥即得莱茵衣藻粉。本发明制得的莱茵衣藻粉具有优质的蛋白、多糖、不饱和脂肪酸、维生素等营养物质，同时安全性高，具有显著的降血糖效果。

Description

莱茵衣藻、莱茵衣藻粉的异养发酵制备方法及应用

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体地说是涉及一种莱茵衣藻、莱茵衣藻粉的异养发酵制备方法及应用。

背景技术

糖尿病是由于胰岛素的分泌缺陷及(或)胰岛素生物学作用障碍而导致以慢性糖代谢障碍、高血糖为特征的一组慢性代谢性疾病。久病可引起多系统损害，导致眼、肾、神经、心脏、血管等组织的慢性进行性病变，引起功能缺陷及衰竭。近十年来，糖尿病患者率再世界各地与日俱增。随着人们生活水平的提高和社会的额老龄化，糖尿病已经成为一种世界性的非传染性流行疾病。目前，全球约有1.37亿糖尿病患者，中国又近4000万，其中2型糖尿病占95％以上。

糖尿病患者可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌，也可以采用定期注射胰岛素的方式来维持血糖。除了借助药物作用以外，糖尿病患者的日常饮食也需尤为注意，尽量不吃或少吃含糖量的食品，由于我国主食通常以米面等淀粉类食物为主，就这给糖尿病患者的日常生活造成困扰。由于目前市场上还没有一种能彻底根治糖尿病的药物，并且降血糖化学药品长期服用具有一定的毒副作用。因此通过调整饮食辅助控制血糖是一种较为健康的方式，特别需要进一步研发降血糖的保健食品，可以在辅助糖尿病人降低血糖的同时补充机体营养，提高免疫力。

近年来，大量研究表明藻类物质含有生物活性物质，能有效降低血糖，藻类含有丰富的蛋白质、膳食纤维、糖类物质、矿物质、维生素和微量元素；微量元素中的铁、锌和硒的含量较高，可以作为糖尿病人的营养品。目前应用最广的藻类保健食品是螺旋藻，20世纪90年代，一些国际组织曾认为螺旋藻是“21世纪最理想的保健品”、“最安全的保健食品”。但近年来发现，螺旋藻产品由于其天然、粗放的生产方式，产品中可能含有同属蓝藻的微囊藻毒素，给螺旋藻营养保健品的安全性带来了影响。螺旋藻非常容易受到生产环境的影响，如果环境受到了污染，螺旋藻便会从中吸收重金属等对人体有害的物质，造成产品重金属超标和细菌超标，所以螺旋藻这个本来最安全高效的营养保健品也有可能给人体带来副作用。

随着食品工业的发展和人民生活水平的提高，消费观念的不断变化，人们对于优质食品的需求量越来越大，而藻类是一种具有巨大潜力的资源。因此研究一种适用于食品工业的、且营养丰富安全性高的藻类原料具有重要的实际意义，目前，还没有关于莱茵衣藻及其工业化原料大规模生产工艺的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种莱茵衣藻、莱茵衣藻粉的异养发酵制备方法及应用，以解决现有技术中缺乏营养好、安全性高且降血糖效果好的保健食品原料。

本发明采用的技术方案是：一种莱茵衣藻，所述莱茵衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)TY-01，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.20293，保藏日期为2020年9月1日。莱茵衣藻TY-01为我公司自行筛选得到。

一种莱茵衣藻粉的制备方法，包括以下步骤：

(a)以上述的莱茵衣藻为种子，将其接种到种子罐中进行异养培养，接种量为0.1～1vol％，当培养至干重10-60g/L时，以1～10vol％的接种量将种子罐所得培养液接种到发酵罐中进行异养发酵；所述种子罐和发酵罐的培养温度均为15～38℃、压力为0.03～0.08MPa、pH为6.3～8.0、溶解氧为10～100％、搅拌转速为0～700转/分；种子罐和发酵罐的培养基均包含无机盐离子、碳源、氮源；

(b)当发酵罐培养至干重60-200g/L时，终止发酵，将所得发酵液进行离心分离或膜分离得到莱茵衣藻固体产物；

(c)将步骤(b)所得产物进行喷雾干燥或真空冷冻干燥即得莱茵衣藻粉，所述喷雾干燥的进风温度为160～190℃，排风温度为80～95℃；所述真空冷冻干燥条件为冷冻温度-5～-60℃，真空度-0.099～-0.05MPa；所得莱茵衣藻粉的蛋白质含量在30％以上、灰分在5.5％以下、水分在4％以下。

步骤(a)中，所述的无机盐离子包括Cu²⁺、Zn²⁺、Na⁺、K⁺、Ga²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺；所述碳源为CO₃ ^2-、CH₃COO^-、C₅H₇O₅COO^-、C₂O₄ ^2-中的至少两种，所述氮源为铵盐或氨水。

步骤(a)中，种子罐和发酵罐的培养基均包含乙酸盐。

步骤(a)中，种子罐和发酵罐的培养基均包含以下重量份的原料：硫酸铜7～9份、草酸锌70～90份、乙酸钠330～370份、磷酸二氢钾180～220份、氢氧化钙780～820份、碳酸镁9～11份、硫酸铁19～21份、硫酸锰19～21份、氨水260～290份、水450000～480000份。

步骤(a)中，种子罐和发酵罐培养过程需加入消泡剂，所述消泡剂为聚丙二醇、聚乙二醇、聚丁二醇、三聚甘油中的至少两种，其中三聚甘油是必需的，三聚甘油为消泡剂总质量的20～30％，消泡剂加入量为培养基总质量的0.1～8％。

步骤(a)中，在种子罐和发酵罐培养过程中补加无机盐离子、碳源、氮源，每隔8～24h补加初始量的5～30％。

步骤(b)中，所述膜分离采用孔径为50～200nm的膜；或者发酵过程控制盐浓度等指标，使其达到质量标准，不用洗涤发酵液可直接喷雾干燥，也能达到质量标准。

上述方法所得的莱茵衣藻粉在制备辅助降血糖保健食品中的应用。

本发明以特定筛选的莱茵衣藻为种子进行工业化发酵，通过特定的发酵工艺条件及产品品质的把控，消除了人工养殖产出的藻类可能受自然环境水污染带来的安全隐患。

本发明制得的莱茵衣藻粉具有优质的蛋白、多糖、不饱和脂肪酸、维生素等营养物质，同时安全性高，具有显著的降血糖效果。其可直接作为糖尿病患者的辅助降血糖及营养补充产品，增强服用者免疫能力，也可以在日常制作馒头、面条、米饭、米粉等主食时加入，还可作为原料应用到具有辅助降血糖功效的保健品生产中。海藻培养通常是通过光合作用自养发酵培养，无菌及卫生控制困难。本发明采用莱茵衣藻异养发酵，通过配方、工艺、消泡剂的优化达到100～200g/L水平。通过发酵后膜处理及洗涤，达到较高的质量标准。

附图说明

图1是本发明莱茵衣藻种子的照片。

图2是本发明实施例1制备的莱茵衣藻粉的成品照片。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明，实施例中未提及的试剂和操作均按本领域的常规操作实施。

实施例1

将莱茵衣藻种子接种到6m³种子罐中，种子罐培养基为：硫酸铜80g、草酸锌80g、乙酸钠350g、磷酸二氢钾200g、氢氧化钙800g、碳酸镁10g、硫酸铁20g、硫酸锰20g、氨水0.3L，加水至4m³，用乙酸调pH至7.0，然后开始接种发酵，接种量为0.5vol％。培养温度为20℃、压力为0.05MPa、溶解氧为50％、搅拌转速为200转/分，培养过程中维持pH在6.3～8.0之间。当罐内产生大量泡沫时，加入消泡剂，消泡剂为3公斤玉米油加入1公斤三聚甘油，消泡剂加入量为4公斤。发酵过程中，三天后，每隔2h加入0.2kg培养基。当发酵120h时，检测培养液中干重达到30g/L时，种子罐发酵结束。

以10vol％的接种量将种子罐所得培养液接种到60m³发酵罐中进行异养发酵；发酵罐培养基为：硫酸铜800g、草酸锌800g、乙酸钠3500g、磷酸二氢钾2000g、氢氧化钙8000g、碳酸镁100g、硫酸铁200g、硫酸锰200g、氨水3L，加水至48m³，乙酸调pH为7.0，开始接种发酵。培养温度为20℃、压力为0.05MPa、溶解氧为50％、搅拌转速为200转/分，培养过程中维持pH在6.3～8.0之间。当罐内产生大量泡沫时，加入消泡剂，消泡剂组成为玉米油20公斤加入10公斤三聚甘油，消泡剂加入量为30公斤。发酵过程中，三天后，每隔2h加入3公斤培养基。当发酵120h时，检测培养液中干重达到100g/L时，发酵罐发酵结束。

将60m³发酵罐所得的4吨发酵液，用100nm膜分离，得到浓缩液和透析水，用水进行三次洗涤，去除发酵液，最终得到莱茵衣藻固体产物；将所得产物进行喷雾干燥，喷雾干燥的进风温度为180℃，排风温度为90℃。干燥完成后得到莱茵衣藻粉220Kg，收率为70％，如图2所示，检测莱茵衣藻粉的蛋白质含量为36.5％、灰分为2.8％、水分为2.2％，符合产品要求。

实施例2

以5vol％的接种量将种子罐所得培养液接种到60m³发酵罐中进行异养发酵；发酵罐培养基为：硫酸铜800g、草酸锌800g、乙酸钠3500g、磷酸二氢钾2000g、氢氧化钙8000g、碳酸镁100g、硫酸铁200g、硫酸锰200g、氨水3L，加水至48m³，乙酸调pH为7.0，开始接种发酵。培养温度为20℃、压力为0.05MPa、溶解氧为50％、搅拌转速为200转/分，培养过程中维持pH在6.3～8.0之间。当罐内产生大量泡沫时，加入消泡剂，消泡剂组成为玉米油20公斤加入10公斤三聚甘油，消泡剂加入量为30公斤。发酵过程中，三天后，每隔2h加入3公斤培养基。当发酵120h时，检测培养液中干重达到60g/L时，发酵罐发酵结束。

将所得发酵液用碟片离心机进行离心分离，转速为8000转/分，排渣时间为10分钟/次，离心过程用水进行三次洗涤，去除发酵液，最终得到莱茵衣藻固体产物；将所得产物进行喷雾干燥，喷雾干燥的进风温度为180℃，排风温度为90℃；干燥完成后得到莱茵衣藻粉160Kg，收率为50％，检测莱茵衣藻粉的蛋白质含量为35.5％、灰分为3.5％、水分为2.3％，符合产品要求。

实施例3

将莱茵衣藻种子接种到6m³种子罐中，种子罐培养基为：硫酸铜80g、草酸锌80g、乙酸钠350g、磷酸二氢钾200g、氢氧化钙800g、碳酸镁10g、硫酸铁20g、硫酸锰20g、氨水0.3L，加水至4m³，用乙酸调pH至7.0，然后开始接种发酵，接种量为0.5vol％。培养温度为35℃、压力为0.08MPa、溶解氧为80％、搅拌转速为600转/分，培养过程中维持pH在6.3～8.0之间。当罐内产生大量泡沫时，加入消泡剂，消泡剂为3公斤玉米油加入1公斤三聚甘油，消泡剂加入量为4公斤。发酵过程中，三天后，每隔2h加入0.2kg培养基。当发酵120h时，检测培养液中干重达到50g/L时，种子罐发酵结束。

以10vol％的接种量将种子罐所得培养液接种到60m³发酵罐中进行异养发酵；发酵罐培养基为：硫酸铜800g、草酸锌800g、乙酸钠3500g、磷酸二氢钾2000g、氢氧化钙8000g、碳酸镁100g、硫酸铁200g、硫酸锰200g、氨水3L，加水至48m³，乙酸调pH为7.0，开始接种发酵。培养温度为35℃、压力为0.08MPa、溶解氧为80％、搅拌转速为600转/分，培养过程中维持pH在6.3～8.0之间。当罐内产生大量泡沫时，加入消泡剂，消泡剂组成为玉米油20公斤加入10公斤三聚甘油，消泡剂加入量为30公斤。发酵过程中，三天后，每隔2h加入3公斤培养基。当发酵120h时，检测培养液中干重达到180g/L时，发酵罐发酵结束。

将60m³发酵罐所得的发酵液，用100nm膜分离，得到浓缩液和透析水，用水进行三次洗涤，去除发酵液，最终得到莱茵衣藻固体产物；将所得产物进行喷雾干燥，喷雾干燥的进风温度为180℃，排风温度为90℃。干燥完成后得到莱茵衣藻粉390Kg，收率为78％，检测莱茵衣藻粉的蛋白质含量为35％、灰分为2.5％、水分为2.0％，符合产品要求。

实施例4

将实施例1所得莱茵衣藻粉送至天津市疾病预防控制中心进行辅助降血糖试验。具体如下：

一、正常小鼠降血糖试验

选用健康雌性小鼠20只，按照禁食5h后所测的血糖水平，随机分为1个对照组和1个高剂量组。对照组给予蒸馏水，高剂量组按3.0g/kg·BW给予受试样品(用蒸馏水灌胃)，连续灌胃30天后，禁食5h测空腹血糖值，比较两组小鼠血糖值。结果见表1所示。

表1：莱茵衣藻粉对正常小鼠空腹血糖的影响(mmol/L)

组别	动物数(只)	试验前	试验后
				对照组	10	7.22±0.76	6.99±0.81
高剂量组	10	7.23±0.89	6.96±0.74

二、高血糖模型小鼠降血糖试验

采用胰岛损伤高血糖模型：将适应后健康雌性小鼠，随机选取15只禁食5h，测空腹血糖，作为该批次小鼠的基础血糖值，随后将小鼠禁食24h后，腹腔注射一次给予四氧嘧啶130mg/kg·BW(给予量0.1ml/10g·BW)，6天后禁食5h，用毛细管吸取尾血，测定血糖值。血糖值在10～25mmol/L为高血糖模型成功小鼠。

选用高血糖模型小鼠按照禁食5h的血糖水平，随机分为1个模型对照组和低、中、高三个剂量组(组间差不大于1.1mmol/L)，剂量组给予1.0g/kg·BW(低剂量)、2.0g/kg·BW(中剂量)、3.0g/kg·BW(高剂量)不同浓度受试样品，模型对照组给予等量蒸馏水，连续灌胃30天后，禁食5h测空腹血糖值，比较血糖下降率。血糖下降率％＝(给予前血糖值-给予后血糖值)/给予前血糖值×100％。结果见表2所示。

表2：莱茵衣藻粉对高血糖模型小鼠空腹血糖及下降百分率的影响

(*与模型对照组比较，差异有统计学意义)

三、高血糖模型大鼠糖耐量试验

采用胰岛损伤高血糖模型：将适应后健康雌性大鼠，禁食4h，取尾血，测定给葡萄糖前(即0h)血糖值、给予2.5g/kg·BW葡萄糖(灌胃量1.0ml/100g·BW)后0.5h、2h血糖值，作为该批次大鼠的基础血糖。以0、0.5h血糖水平分5个组，即1个空白对照组、1个模型对照组和3个剂量组，每组15只。空白对照组正常饲养不做处理，3个剂量组分别给予不同剂量受试样品：0.5g/kg·BW(低剂量)、1.0g/kg·BW(中剂量)、2.0g/kg·BW(高剂量)，蒸馏水灌胃，模型对照组给予同体积蒸馏水，连续33天后，各组禁食4h，测定给予2.5g/kg·BW葡萄糖前(即0h)血糖值，20min后各组经口给予葡萄糖2.5g/kg·BW，测定给葡萄糖后各组0.5h、2h的血糖值，观察各组血糖曲线下面积的变化，结果见表3所示。血糖曲线下面积＝[(0h血糖+0.5h血糖)×0.5/2]+[(2h血糖+0.5h血糖)×1.5/2]。

表3：莱茵衣藻粉对高血糖模型大鼠糖耐量的影响

(*与模型对照组比较，差异有统计学意义)

由上述可知，本发明莱茵衣藻粉对正常动物血糖无影响，对高血糖模型动物具有辅助降血糖功效，可应用于辅助降血糖的保健食品中。

Claims

1.一种莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii），其特征是，所述莱茵衣藻为莱茵衣藻TY-01，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.20293，保藏日期为2020年9月1日。

2.一种莱茵衣藻粉的异养发酵制备方法，其特征是，包括以下步骤：

（a）以权利要求1所述的莱茵衣藻为种子，将其接种到种子罐中进行异养培养，接种量为0.1～1vol%，当培养至干重10-60g/L时，以1～10vol%的接种量将种子罐所得培养液接种到发酵罐中进行异养发酵；所述种子罐和发酵罐的培养温度均为15～38℃、压力为0.03～0.08MPa、pH为6.3～8.0、溶解氧为10～100%、搅拌转速为0～700转/分；种子罐和发酵罐的培养基均包含无机盐离子、碳源、氮源；

（b）当发酵罐培养至干重60-200g/L时，终止发酵，将所得发酵液进行离心分离或膜分离得到莱茵衣藻固体产物；

（c）将步骤（b）所得产物进行喷雾干燥或真空冷冻干燥即得莱茵衣藻粉，所述喷雾干燥的进风温度为160~190℃，排风温度为80~95℃；所述真空冷冻干燥条件为冷冻温度-5～-60℃，真空度-0.099～-0.05MPa；所得莱茵衣藻粉的蛋白质含量在30%以上、灰分在5.5%以下、水分在4%以下。

3.根据权利要求2所述的莱茵衣藻粉的制备方法，其特征是，步骤（a）中，所述的无机盐离子包括Cu²⁺、Zn²⁺、Na⁺、K⁺、Ga²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺；所述碳源为CO₃ ^2-、CH₃COO^- 、C₅H₇O₅COO^- 、C₂O₄ ^2-中的至少两种，所述氮源为铵盐。

4.根据权利要求2所述的莱茵衣藻粉的制备方法，其特征是，步骤（a）中，种子罐和发酵罐的培养基均包含乙酸盐。

5.根据权利要求2所述的莱茵衣藻粉的制备方法，其特征是，步骤（a）中，种子罐和发酵罐的培养基均包含以下重量份的原料：硫酸铜7~9份、草酸锌70~90份、乙酸钠330~370份、磷酸二氢钾180~220份、氢氧化钙780~820份、碳酸镁9~11份、硫酸铁19~21份、硫酸锰19~21份、氨水260~290份、水450000~480000份。

6.根据权利要求2所述的莱茵衣藻粉的制备方法，其特征是，步骤（a）中，种子罐和发酵罐培养过程需加入消泡剂，所述消泡剂为聚丙二醇、聚乙二醇、聚丁二醇、三聚甘油中的至少两种，其中三聚甘油是必需的，三聚甘油为消泡剂总质量的20～30%，消泡剂加入量为培养基总质量的0.1～8%。

7.根据权利要求2所述的莱茵衣藻粉的制备方法，其特征是，步骤（a）中，在种子罐和发酵罐培养过程中补加无机盐离子、碳源、氮源，每隔8~24h补加初始量的5~30%。

8.根据权利要求2所述的莱茵衣藻粉的制备方法，其特征是，步骤（b）中，所述膜分离采用孔径为50~200nm的膜。

9.权利要求2~8所得的任一莱茵衣藻粉在制备辅助降血糖保健食品中的应用。