CN116179356B - 高密度异养培养莱茵衣藻的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高密度异养培养莱茵衣藻的方法，其包括：以莱茵衣藻GUN4为藻种，接种到发酵罐进行异养培养；基础培养基含有70mM‑90mM的乙酸根和计算量的氯化铵，其余成分与TAP培养基相同，C/N为8‑32；补料培养基含有250‑280g/L冰乙酸、25‑30g/L乙酸铵和计算量的氯化铵，其余成分与浓缩50倍TAP培养基相同，C/N为16‑20。采用pH恒定补料策略结合控制碳氮源浓度策略，随培养时间增加逐步调低pH阈值以快速及时补充补料培养基。本发明使用的莱茵衣藻GUN4相较于其他莱茵衣藻具有非常高的底物耐受力和乙酸根利用率，经培养后获得远高于现有技术的生物量和生长速率，乙酸根转化率可达到51％，藻蛋白含量可提高到36％，满足食品原料标准，培养过程不需滤除或置换培养液，降低了培养成本。
Description
技术领域
本发明属于微藻培养领域，尤其涉及一种高密度异养培养莱茵衣藻的方法及其应用。
背景技术
藻粉是以微藻作为生产原料，通过发酵、提纯和后续精细加工而成，其不仅含有丰富的蛋白质、膳食纤维、多糖、维生素和微量元素，被誉为地球上最好的可持续蛋白质资源，还因不同的微藻种属可以积累各种附加产物，从而被食品和医药工业所青睐。莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是一种单细胞真核藻类，上属于绿藻门(Chlorophyta)、绿藻纲(Chlorophyceae)、团藻目(Volvocales)、衣藻科(Chlamydomonadaceae)、衣藻属(Chlamydomonas)。作为模式生物，在分子遗传和生产重组蛋白的领域受到了极大的关注。莱茵衣藻拥有三套遗传表达体系，并已经建立了成熟的遗传操作手段，其中高效表达的叶绿体同源重组法，目前已经在药物生产、抗体研制等领域获得了广泛的运用。此外莱茵衣藻有外泌蛋白的能力，降低了后续相关蛋白的分离提纯的难度，甚至可以不需要提纯，直接将藻粉添加进食品，也可达到相同的效果。Mayfield等人基于重组抗体计算了每克蛋白的生产成本，其中哺乳动物细胞，植物表达细胞和微藻生物反应器分别为150美元、0.05美元和0.02美元，可见相比传统的生物反应器，使用莱茵衣藻作为底盘生物可以达到更低的生产成本。莱茵衣藻有望成为下一个“细胞工厂”。
近年来为了降低藻类培养成本，各领域均寻求废弃碳源代替葡萄糖来进行微藻的大规模培养，而有机废水以及废水处理过程中产生的有机碳源及微量元素含量丰富，若将产酸废水用于微藻培养，或许可降低成本，若能在利用产酸废水的同时进一步诱导提高微藻产率，不仅可以缓解环境问题，还能提供更多微藻生物资源。目前大部分可异养培养的经济微藻所使用的碳源为葡萄糖，极少数藻类如杜氏盐藻、菱形藻等只能利用有机酸离子进行异养生长。莱茵衣藻同样无法利用葡萄糖作为碳源进行异养发酵，有学者推测，一些藻类由于缺少相关的葡萄糖转运蛋白，因此无法吸收葡萄糖。但是相比大分子的葡萄糖，很多小分子有机酸根离子可以直接穿透细胞膜被吸收进入藻细胞，并在细胞内被催化转化为乙酸根，最后在乙酰辅酶A合成酶的催化下，转化为乙酰辅酶A加入三羧酸循环。因此相比其他利用葡萄糖发酵的藻类，衣藻的异养过程中减少了转运葡萄糖耗费的能量和糖酵解途径中关键酶的限速，且有不受光照调控的二型果糖1,6磷酸化酶，可在黑暗条件下完成糖异生途径，提供细胞代谢过程中各种关键底物。异养培养体系中，乙酸根本身对藻细胞有一定的毒性，而莱茵衣藻对该碳源底物的抑制作用敏感，当乙酸根浓度超过一定阈值时会导致衣藻细胞无法生长。抑制原因主要是使用的碳源底物乙酸盐会在培养体系中引入大量金属阳离子，这些阳离子随着补料过程浓度不断升高达到一定阈值，抑制藻细胞的正常生长，限制了该培养工艺进一步发展。
基于上述原因，目前关于莱茵衣藻的报道多以提高油脂含量或产氢效率为目的，且培养方式也多以自养(光合)和兼养(同时利用光能和有机物)为主，最终的培养密度也不高，通常细胞数目在106数量级，干重为1-2g/L。为了解决异养培养底物抑制及阻碍衣藻高密度培养的问题，曾有学者提出了培养基置换实现高密度培养的方法(FENGCHEN,MICHAELR.JOHNS.A strategy for high cell density culture of heterotrophicmicroalgae with inhibitory substrates[J].Journal of Applied Phycology,1995,7(1):43-46)，在1L小体积发酵罐中最高密度能达到9g/L。该方法需引入中空纤维膜循环系统，将培养体系内有抑制作用的金属离子过滤出去的同时，补充新鲜的培养基，从而实现了对培养体系的“净化”作用，以解决浓度逐渐增加的底物对莱茵衣藻的抑制。但该系统过于昂贵，且有过于复杂繁琐的反冲洗收获过程，不适用于发酵产业，且培养周期长达540h，并不具有产业优势。后有研究报道(ZHANG,ZHEN,TAN,YINGYING,WANG,WEILIANG,etal.Efficient heterotrophic cultivation of Chlamydomonas reinhardtii[J].Journal of Applied Phycology,2019,31(3):1545-1554.)将培养条件扩大到50L发酵罐内，通过恒定pH的补料策略，每当pH高于7.9时进行补料，以乙酸钠和乙酸作为碳源，未进行培养基滤出和置换，经240h的培养最高细胞生物量可达25.44g/L，生长速率为106mg/L/h。该方案虽然使用pH恒定的补料策略实现了发酵过程中的补料，但是体系内积累的金属离子还是限制了衣藻细胞的生长速率和最大生物量的进一步增加。虽然该方法培养的莱茵衣藻蛋白质含量突破了40％，但培养周期长达240h，生长速率慢，乙酸根转化率仅为26％，耗费了过多成本。
造成上述现状的一个主要原因是莱茵衣藻对乙酸根碳源底物的抑制作用敏感，当乙酸根浓度超过一定阈值时会导致藻细胞无法生长。目前报道的用于异养培养的莱茵衣藻，都存在相似问题，在培养中均不占优势，导致产量和产率都低下。由此可见，虽然莱茵衣藻是食品医药领域的“潜力股”，但目前的细胞生物量和培养工艺远不能满足未来市场需求。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种高密度异养培养莱茵衣藻的方法，该方法基于不同莱茵衣藻藻株对乙酸根的耐受性程度不同及对乙酸根的利用效率不同等特点，从众多已有莱茵衣藻中选出一株优势衣藻，并优化了基础培养基和补料培养基的成分(包括碳源和氮源选择)、C/N和培养条件(包括补料方式)，使莱茵衣藻在实现高密度培养的同时其蛋白质含量提高到30％(细胞干重)以上，达到培养密度和蛋白质含量同时提高的目的，满足了食品原料标准要求，为藻源蛋白的市场化提供技术支持。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种高密度异养培养莱茵衣藻的方法，包括：
以莱茵衣藻GUN4为藻种，接种到发酵罐中进行异养培养，异养培养的培养基包括基础培养基和补料培养基；
基础培养基含有70mM-90mM的乙酸根和计算量的氯化铵，其余成分与TAP培养基相同；所述氯化铵为基础培养基的氮源，基础培养基C/N为8-32；
补料培养基为酸性补料培养基，含有250-280g/L冰乙酸、25-30g/L乙酸铵和计算量的氯化铵，其余成分与浓缩50倍的TAP培养基相同；补料培养基中，冰醋酸为碳源，乙酸铵为碳氮源，氯化铵为氮源；补料培养基C/N为16-20；
培养过程的补料机制为：采用pH恒定补料策略结合控制碳氮源浓度策略，在培养0-24h不补料，待pH升至8.9±0.5开始补料，在培养第24-60h内，按照pH维持在8.7±0.5进行补料；在培养第60-84h内，按照pH维持在8.45±0.5进行补料；在培养第84-96h内，按照pH维持在8.3±0.5进行补料；在培养第96h至发酵结束，按照pH维持在8.0±0.5进行补料；
培养24h至发酵结束，通过补料使发酵培养体系实时乙酸根浓度维持在20mM-115mM，铵离子浓度维持在0.2-2mM；当莱茵衣藻GUN4细胞生长达到平台期，培养结束。
本发明使用的莱茵衣藻GUN4来源可参见文献1：BONENTE,G.,FORMIGHIERI,C.,MANTELLI,M.,et al.Mutagenesis and phenotypic selection as a strategy towarddomestication of Chlamydomonas reinhardtii strains for improved performancein photobioreactors.[J].Photosynthesis Research:An International Journal,2011,108(2/3):107-120.和文献2：FORMIGHIERI,C.,CEOL,M.,BONENTE,G.,etal.Retrograde signaling and photoprotection in a gun4 mutant of Chlamydomonasreinhardtii.[J].Molecular Plant,2012,5(6):1242-1262.文献1是由Bonente等人从插入突变的cw15突变体库中分离出来突变藻株。文献2是由Cinzia Formighieri等人鉴定了该突变藻株的表型并进行了生化分析，分析结果显示该株莱茵衣藻表现出了叶绿素缺陷的特征，其叶绿素含量仅为野生型的50％，培养过程中还发现其具有光敏感特性，平板上的GUN4藻落在超过50μmol photons m-2s-1的光照下生长受到抑制，更高的光照强度会对藻落产生致死效应。本发明经过实验研究发现，莱茵衣藻GUN4相较于其他突变株或野生型莱茵衣藻具有非常高的底物耐受力和乙酸根利用率，可耐受高浓度乙酸根，并能在大规模培养的条件下实现0-156h持续生长，以获得高生物量和高蛋白质产率，并免去采用中空纤维膜对培养基中对藻生长有抑制作用的金属离子滤除或置换的操作和成本。对此，前述文献1-2均未有记载。
根据本发明的较佳实施例，所述方法还包括：先进行摇瓶种子液培养，得到种子液后，再接种到发酵罐中进行异养培养。
根据本发明的较佳实施例，所述摇瓶种子液培养条件为：液体培养基以乙酸根为碳源，氯化铵为氮源，调节初始pH为7.2±0.5，其余成分与TAP培养基相同；且液体培养基中，乙酸根浓度为70mM-87.5mM；培养温度是26-30℃；碳氮比为8-32；在黑暗摇床中培养。
优选地，所述摇瓶种子液培养条件为：液体培养基以乙酸根为碳源，氯化铵为氮源，调节初始pH为7.2±0.5，其余成分与TAP培养基相同；且液体培养基中，乙酸根浓度为87.5mM；培养温度是30℃；碳氮比为16-24；在黑暗摇床中培养。
优选地，摇床中培养的转速为120-150rpm，优选135rpm。
根据本发明的较佳实施例，接种到发酵罐中进行异养培养时，初始接种浓度为初始干重1.4-2.0g/L；异养培养温度为28-30℃，溶解氧设定为20-25％，搅拌速度和溶解氧偶联控制罐内溶氧；异养培养时间为120-156h时进行收获，以获得高含蛋白质的莱茵衣藻；优选地，异养培养温度为30℃，溶解氧设定为20％，搅拌速度和溶解氧偶联控制罐内溶氧；异养培养时间为144-156h时进行收获，以获得高含蛋白质的莱茵衣藻。
根据本发明的较佳实施例，所述基础培养基含有87.5-90mM的乙酸根和计算量的氯化铵，其余成分与TAP培养基相同；所述氯化铵为基础培养基的氮源基础培养基C/N为16-24。优选地，所述基础培养基含有87.5mM的乙酸根和7mM氯化铵。
根据本发明的较佳实施例，补料培养基含有262.5g/L冰乙酸、27.5g/L乙酸铵和计算量的氯化铵(按照C/N计算)，其余成分与浓缩50倍的TAP培养基相同；补料培养基中C/N为16-18。采用冰乙酸作为补料培养基中的碳源，可中和发酵罐中随着乙酸根代谢pH逐渐升高的碱值；
发酵罐同时还连接稀氨水；在补入酸性补料培养基后导致pH下降超出设定范围时，补入氨水将pH回调至设定值；当发酵培养体系中氮源浓度过低，补入氨水调高氮源浓度。
(三)本发明的技术效果
(1)本发明主要是从众多已有莱茵衣藻中选出一株优势莱茵衣藻GUN4，该衣藻同样可利用乙酸根为碳源进行异养培养，且相较于其他莱茵衣藻，该藻株具有很强的底物耐受力和乙酸根利用率，可耐受高浓度乙酸根。经实验发现，在TAP培养基的基础上，使用87.5mM乙酸根为碳源和7mM氯化铵为氮源，于30℃，转速为135rpm的黑暗摇床中摇瓶批次培养，最终达到最大生物量2.03g/L和最高生长速率933mg/L/d，乙酸转化率达到40％，摇瓶的结果是目前文献报道的1.5倍和4.56倍。
在补料培养基C/N＝20的发酵罐培养体系中，培养156h后莱茵衣藻GUN4生物量达到53.85g/L，生长速率达345mg/L/h。可见，该莱茵衣藻GUN4能在大规模培养的条件下实现0-156h持续生长，其具有很强的底物耐受力。相比现有技术采用中空纤维膜对培养基中金属离子滤除或培养液置换等方法，本发明培养全程无需设置滤除设备或对培养基进行更换，故能大幅减少培养成本。
(2)莱茵衣藻可以乙酸为碳源进行高密度异养培养，若能将产酸废水用于微藻培养，不仅降低藻的培养成本，缓解环境问题，还能在利用产酸废水的同时提供更多微藻生物质。此外，相比其他利用葡萄糖发酵的藻类，莱茵衣藻作为模式生物，可用于生产需要的重组蛋白。莱茵衣藻有外泌蛋白的能力，降低了后续相关蛋白的分离提纯的难度。
(3)相比现有技术通过恒定pH的补料策略，经240h的培养最高细胞生物量可达25.44g/L，生长速率为106mg/L/h。在本发明的培养框架下，莱茵衣藻GUN4在补料培养基C/N＝20的发酵培养体系中培养156h的生物量(53.85g/L)，生长速率(345mg/L/h)分别是前述现有技术的2.1倍和3.25倍。在补料培养基C/N＝16的发酵培养体系中培养108h后，最大生物量为46g/L，其相对补料培养基C/N＝20的培养体系的最大生物量有所下降，但生长速率上升，达到了416mg/L/h；最为重要的是，藻粉蛋白质含量从26％提高到了36％(达到30％即满足食品原料相关标准)，达到了国家卫检委食品原料添加的标准。同时，乙酸根的转化率由38％提高到了51％，进一步提高碳源利用率节省了生产成本。因此，补料培养基C/N＝20的发酵培养体系适于获得高的生物量和藻细胞干重，补料培养基C/N＝16适于获得高产率的藻粉蛋白质。
附图说明
图1为实施例1测定不同莱茵衣藻藻株在TAP培养基中的异养生长状况。
图2为实施例1测定对比GUN4、CC124、CC4253和UVM11在不同乙酸根浓度下的生长状况。
图3为实施例2测定莱茵衣藻GUN4在乙酸根浓度为3.5mM，17.5mM，35mM，52.5mM，70mM，78.5mM，87.5mM，105mM下(氯化铵浓度为标准TAP培养基中的7mM)的生长状况。
图4为实施例2测定GUN4在26、28和30℃下的生长状况(使用87.5mM浓度乙酸根，氯化铵浓度为标准TAP培养基中的7mM)。
图5为实施例2测定莱茵衣藻GUN4在不同种类氮源(硝酸钠、氯化铵和尿素)体系的生长状况(87.5mM浓度乙酸根和30℃培养，N元素浓度为标准TAP培养基中的7mM)，发现只有当氮源为NH4Cl时，藻细胞才能生长。
图6为实施例2测定GUN4在碳氮比为4、8、16、24、32和40体系内的生长状况(87.5mM浓度乙酸根和和30℃培养，氯化铵浓度为根据碳氮比的计算量)。
图7为实施例3测定当补料培养基C/N为20时，GUN4在7.5L发酵罐中培养的生长曲线、溶氧水平和机械搅拌转速。
图8为实施例3测定当补料培养基C/N为20时，GUN4在7.5L发酵罐中不同培养时段的总碳水化合物含量、蛋白质含量和总脂肪酸含量。
图9为实施例3测定当补料培养基C/N为20时，GUN4在7.5L发酵罐中不同培养时段的铵根离子浓度。
图10为实施例4测定当补料培养基C/N调整为12、14、16和18时，GUN4在7.5L发酵罐中培养的生长曲线、溶氧水平和机械搅拌转速。
图11为实施例4测定当补料培养基C/N调整为12、14、16和18时，GUN4不同培养时段体系内铵根离子浓度。
图12为实施例4测定当补料培养基C/N调整为12、14、16和18时，GUN4不同培养时段的总碳水化合物含量、蛋白质含量和总脂肪酸含量。
图13为实施例4发酵罐中莱茵衣藻GUN4发酵后期的培养照片。
图14为实施例4发酵罐中补料C/N为12时，莱茵衣藻GUN4发酵后期的培养照片。
图15为实施例4发酵罐中莱茵衣藻GUN4发酵后期的细胞显微照片。
图16为实施例4发酵罐中补料碳氮比为12时的莱茵衣藻GUN4的细胞显微照片。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
背景技术提到的两个有代表性的异养发酵研究进展，均未进行异养培养藻种的筛选，忽略了不同株藻种之间生长的差异。同时均未提出解决底物抑制作用的合理方案，导致最后得到的生物量过低，生长速率慢，使得莱茵衣藻异养发酵工艺还有极大的突破空间。为了实现本发明的目的，本发明首先对异养底盘藻株进行筛选，选出了莱茵衣藻GIN4为目标藻株，然后探究了发酵基础培养基和补料培养基中碳源和氮源的种类、浓度、C/N和补料策略，最终在摇瓶培养和发酵罐培养两种培养模式下，获得了远高于现有技术的最大生物量浓度及生长速率和最高蛋白含量达到36％的莱茵衣藻生物质。
以下结合本发明的具体实施例进行说明。
实施例1
本实施例为藻株筛选。挑选14株不同表型的莱茵衣藻藻株(包括6株野生型和8株突变体，藻株及来源详见表1)，将生长在固体TAP平板上的单克隆藻落分别挑到装有20mlTAP液体培养基中培养5天后，转接至装有125ml TAP培养基的锥形瓶中，置于26℃，转速为125rpm的黑暗摇床中培养，待细胞生长到对数末期，按照106cells/ml的接种量转接到装有125ml TAP培养基的锥形瓶中，每隔24h取样测定生物量，并绘制生长曲线，统计每个藻株可达到的最大生物量(见图1a)和生长速率(见图1b)。据生长状况来看，GUN4生物量最高，为0.44g/L，最大生长速率为0.14g/L/d，因此挑选GUN4作为后续研究生产工艺的藻株。
接下来，挑选了上述实验中的优势藻种GUN4，CC124，UVM11，CC4253继续探究其在不同浓度乙酸根下的生长状况，图2a为在乙酸根17.5mM、35mM、70mM、87.5mM四个梯度浓度下的细胞干重(g/L)，图2b为生长速率(g/g)。实验结果说明，随着乙酸根浓度的升高，GUN4可达到的最大生物量最高，为2.03g/L。GUN4在培养过程中，乙酸根转化率变化不大，维持在0.4g/g左右，其他三株衣藻的乙酸根转化率均随着乙酸根浓度的增加而显著降低。GUN4表现出对高浓度乙酸的耐受力。
表1不同莱茵衣藻藻株信息
本发明使用的莱茵衣藻GUN4来源可参见文献1：BONENTE,G.,FORMIGHIERI,C.,MANTELLI,M.,et al.Mutagenesis and phenotypic selection as a strategy towarddomestication of Chlamydomonas reinhardtii strains for improved performancein photobioreactors.[J].Photosynthesis Research:An International Journal,2011,108(2/3):107-120.和文献2：FORMIGHIERI,C.,CEOL,M.,BONENTE,G.,etal.Retrograde signaling and photoprotection in a gun4 mutant of Chlamydomonasreinhardtii.[J].Molecular Plant,2012,5(6):1242-1262。
发明人研究发现，莱茵衣藻GUN4相较于其他突变株或野生型莱茵衣藻具有非常高的底物耐受力和乙酸根利用率，可耐受高浓度乙酸根，并具有在大规模培养的条件下实现0-156h持续生长、获得高生物量和高蛋白质产率等优势。这些优势为本发明方案首次披露，且本发明的方案皆基于对该藻株优势的发掘和利用，包括培养条件的优化。
在综合分析了最大生物量、生长速率、底物耐受性和碳源利用效率之后，挑选优势藻株GUN4作为后续进一步培养的目标藻株。
实施例2
本实施例为摇瓶种子液培养的条件优化。摇瓶种子液培养过程同样是异养发酵培养，只是培养过程中不补充补料培养基和调控pH。
摇瓶培养基以乙酸根为碳源，氯化铵为氮源，用氢氧化钠调节培养基初始pH为7.2±0.5，其余成分与TAP培养基相同。按照0.16g/L的接种量接种到装有125ml摇瓶培养基的锥形瓶，设置不同浓度梯度的乙酸根和碳氮比体系，置于不同温度下，转速为135rpm的黑暗摇床中培养，每隔24h取样测定生物量，并绘制生长曲线。
如图3所示，为实验测定GUN4在乙酸根浓度为3.5mM，17.5mM，35mM，52.5mM，70mM，78.5mM，87.5mM，105mM下(氯化铵的浓度为标准TAP培养基中的7mM)的生长状况。图3a为在不同乙酸根浓度下，GUN4随着培养天数的干重曲线，图3b为在不同乙酸根浓度下，生长速率。图示统计结果说明，当培养体系乙酸根浓度不超过87.5mM时，随着乙酸根浓度的升高，莱茵衣藻GUN4的生物量和最大生长速率增加，但生长延滞期变长。当乙酸根浓度为87.5mM时，GUN4在第五天达到最大生物量1.808g/L和最快生长速率354mg/L/d。当乙酸根浓度为105mM时，细胞不生长。因此确定摇瓶培养基中乙酸根浓度不超过90mM为宜，更优选不超过87.5mM。而乙酸根浓度70mM-87.5mM的组别相比较于乙酸根浓度在52.5mM以下的组别，衣藻生长速率要大得多，而培养6天时，生物量也要更高。因此确定摇瓶培养基中，乙酸根浓度为70-90mM，更优选是70-87.5mM。
如图4所示，为实验测定GUN4在26℃、28℃和30℃下的生长状况(三种温度下乙酸根浓度保持下87.5mM，氯化铵的浓度为标准TAP培养基中的7mM)。图4a为三种温度下的GUN4随着培养天数的干重曲线，图4b为三种温度下的GUN4的生长速率。实验结果表明，在30℃的条件下，通过两天的培养生物量可达1.85g/L，在26和28℃下，通过三天的培养生物量达到2.08g/L。30℃时达到最大生长速度866mg/L/d。
如图5所示，为实验测定莱茵衣藻GUN4在不同种类氮源体系的生长状况，采用三种不同氮源(氮的摩尔浓度为标准TAP培养基中的7mM)进行摇瓶培养(使用87.5mM浓度乙酸，30℃，摇床转速135rpm)，三种氮源分别是氯化铵、硝酸钠和尿素。实验结果表明，只有当氮源为NH4Cl时藻细胞才能生长。因此后续发酵罐的异养培养的主要氮源同样采用氯化铵。
参见图6所示，为实验测定不同碳氮比4、8、16、24、32和40下培养莱茵衣藻GUN4的生长曲线和生长速率。培养条件为：以87.5mM的乙酸根为碳源，摇瓶培养温度为30℃，摇床转速135rpm，氮源为氯化铵。各组中氯化铵的浓度按照碳氮比4、8、16、24、32和40进行换算。其中，图6a为不同碳氮比条件下随着培养条数增加的细胞干重(g/L)，图6b为不同碳氮比条件下的生长速率。其中C/N为16和24时，通过2days培养，最大生物量达到2g/L，最大生长速率为933mg/L/d；C/N为32和40时，通过三天的培养，最大生物量达到1.93g/L，最大生长速率为787mg/L/d。C/N为4和8时，通过两天的培养，最大生物量达到1.7g/L，最大生长速率为771mg/L/d。实验结果表明，当乙酸根浓度固定在87.5mM，C/N为8-32时可以获得较大生长速率，而更优是在C/N为16-24时，培养速率和干重最大。
摇瓶培养是在黑暗环境下的异养发酵培养，培养过程中不补料也不调控pH值，保持适当的摇床转速(增加溶氧和保持均匀)和环境温度等。
从以上实验总结出：摇瓶种子液培养的较佳条件为：液体培养基以乙酸根为碳源，氯化铵为氮源，调节初始pH为7.2±0.5，其余成分与TAP培养基相同；且液体培养基中，乙酸根浓度为70mM-87.5mM；培养温度是26-30℃；碳氮比为8-32；在黑暗摇床中培养，摇床中培养的转速为120-150rpm；而更优培养条件为：调节初始pH为7.2±0.5，其余成分与TAP培养基相同；且液体培养基中，乙酸根浓度为87.5mM；培养温度是30℃；碳氮比为16-24；在黑暗摇床中培养，摇床中培养的转速为135rpm。
摇瓶培养实验所优化的培养条件可指导大体量发酵培养条件，包括溶氧和培养温度等都适用于发酵罐的培养体系，可按照摇瓶培养基的优化配方配制基础发酵基础培养基的组成并进一步优化，摇瓶培养还为发酵罐培养提供足量且有活力的种子液。
实施例3
本实施例为发酵培养条件。异养培养所使用的基础培养基组成参见表2，补料培养基母液组成参见表3：
表2底料(基础)培养基配方
表3补料培养基母液配方：
异养基础培养基(又称底料培养基)含有87.5mM乙酸根和7mM氯化铵，其余成分与TAP培养基相同，此时碳氮比为:21.42。除碳氮源之外，其余成分与TAP培养基相同。
表3中补料培养基母液中乙酸根浓度来自冰乙酸和醋酸铵两部分，经计算，乙酸根浓度为4.732mol/L，铵离子浓度为0.357mol/L，碳氮比为22.7。除碳氮源之外，其余成分与浓缩50倍TAP培养基相同。
实验中，为了得到不同碳氮比实验需要的补料培养基，实验中还采用氯化铵作为氮源调节实际补料培养基的C/N(下同)。本实施例中，按照如下条件进行异养发酵培养：
将莱茵衣藻GUN4摇瓶种子液，以初始干重为1.6g/L接种于7.5L发酵罐中，培养温度为30℃，溶解氧设定为20％，搅拌速度和溶解氧偶联控制罐内溶氧。底料培养基如表2，补料培养基为在表3补料培养基母液中加入氯化铵使C/N＝20。
培养过程随着基础配基的消耗，pH不断升高，需要及时补入补料培养基。因此可根据pH的变化掌握莱茵衣藻GUN4对营养物质的利用速度和生长周期。培养期间，随着培养时间增加，衣藻对补料培养基的需求越来越大，因此通过逐步调低pH阈值，当达到阈值时补料泵即启动补料，以快速及时补充酸性补料培养基。
本实施例的补料机制为：采用pH恒定补料策略结合控制碳氮源浓度策略，在培养0-24h不补料，待pH升至8.9±0.5开始补料，在培养第24-60h内，按照pH维持在8.7±0.5进行补料；在培养第60-84h内，按照pH维持在8.45±0.5进行补料；在培养第84-96h内，按照pH维持在8.3±0.5进行补料；在培养第96h至发酵结束，按照pH维持在8.0±0.5进行补料。
通过补料使发酵培养体系实时乙酸根浓度维持在20mM-115mM，铵离子浓度维持在0.2-2mM即可；当补入的酸性培养基过量时，可手动补充氨水回调pH并同时因此补充了一些氮源。培养第四天时，每隔12h取样真空冻干，测定藻粉蛋白质含量。培养至第6.5天时，莱茵衣藻GUN4细胞生长达到平台期，培养过程结束。
如图7所示，(a)为干重(g/L)随培养时间(h)变化曲线，(b)为溶氧随培养时间(h)变化曲线，(c)为发酵罐转速随培养时间(h)变化曲线。
实验结果表明，当补料碳氮比为20时，通过156h的培养，最终生物量达到53.85g/L，生长速率达到345mg/L/h。溶解氧随着细胞密度增加而下降，最后维持在20％左右。搅拌速度随着细胞密度增加而上升(细胞密度增加对氧需求量增大)，最高达到600rpm，在发酵后期开始下降。培养156h的生物量(53.85g/L)，生长速率(345mg/L/h)分别是现有技术中培养240h的2.1倍和3.25倍。由此可见，补料培养基C/N＝20有利于获得更多生物量。
如图8所示，为实验测定当补料碳氮比为20时GUN4在7.5L发酵罐中不同培养时段的总碳水化合物含量、蛋白质含量和总脂肪酸含量；(a)为碳水化合物(％，DCW)随着培养时间(h)变化的柱状统计图，(b)为蛋白质含量(％，DCW)随着培养时间(h)变化的柱状统计图，(c)为总脂肪酸含量(％，DCW)随着培养时间(h)变化的柱状统计图。实验结果表明，当补料碳氮比为20时，各培养时间段的细胞生化组成无明显变化趋势，各时间段细胞总碳水化合物含量、蛋白质含量和总脂肪酸的平均含量分别为54.1％，26％和6.1％。其中，在培养第108-144h时蛋白质含量(％，DCW)最高。
如图9所示，为实验测定当补料碳氮比为20时7.5L发酵罐中不同培养时段的铵根离子浓度。其中(a)为乙酸根离子浓度随培养时间的变化曲线，(b)为铵根离子浓度随培养时间的变化曲线。由图9可知，前面的0-25h小时内，铵根离子消耗很快，在快速生长阶段的铵根离子浓度未超过2mM(包括使用氨水瓶额外补充的氮源)。在发酵后期铵根离子消耗变慢，浓度上升。由于浓度上升的铵根离子对细胞具有一定抑制性。因此在发酵罐培养体系中氮源应维持较低的浓度，以提高衣藻生长速率。
实施例4
本实施例是在实施例3基础上，向补料培养基母液中加入计算量的氯化铵调节补料培养基中C/N＝12，14，16和18，测定当补料碳氮比为12，14，16和18时，GUN4在发酵罐中培养的生长曲线、溶氧水平和机械搅拌转速。本实施例的补料机制与实施例3相同。
如图10所示，(a)为干重(g/L)随培养时间(h)变化曲线，(b)为溶氧随培养时间(h)变化曲线，(c)为发酵罐转速随培养时间(h)变化曲线。由图示可知，在补料培养基C/N12和14的体系里，生物量无法积累，转速始终较低，且溶氧水平下降慢(异养是好氧的，溶氧水平的下降速度直接反应生长速率)。在补料培养基C/N为18的体系里，84h时细胞开始出现死亡的情况(但生物量仍远高于C/N＝12和14的情况)，最大生物量达到35g/L。在补料培养基C/N为16的体系里，生物量在4.5天(108h)达到47g/L，生长速率达到416mg/L/h。由该实验结果可知，C/N为18时，培养周期不宜过长。而补料培养基C/N为16的体系中，相比补料培养基C/N为20(实施例3)在培养156h的最大生物量(53.85g/L)有所下降，但培养至108h的生长速率大于实施例3。
如图11所示，为实验测定当补料C/N为12，14，16和18时，不同时段的体系内铵根离子浓度。由图可知，在24h后开始补料的情况下，36h时C/N为12和14实验组的体系内铵根离子浓度超过2mM，并在后续的培养过程中不断累计上升，而C/N为16和18的实验组在后续的培养过程中浓度均未超过2mM。且在C/N为18的实验组，48h后铵根离子降低至0.2mM，后续培养过程中均未能积累，处于氮源短缺的状态。由图10的实验结果可知，C/N为12和14实验组的生物量未能积累，而C/N为18的实验组生物量未能达到C/N为16组的水平，故得出结论，开始补料后的培养过程中，铵根离子浓度宜维持在0.2-2mM范围内。
如图12所示，为实验测定当补料碳氮比为12，14，16和18时，GUN4不同培养时段的总碳水化合物含量、蛋白质含量和总脂肪酸含量。(a)为碳水化合物(％，DCW)随着培养时间(h)变化的柱状统计图，(b)为蛋白质含量(％，DCW)随着培养时间(h)变化的柱状统计图，(c)为总脂肪酸含量(％，DCW)随着培养时间(h)变化的柱状统计图。由图示可知，当补料培养基C/N为12和14时，细胞积累了更多的碳水化合物，蛋白质含量最高可达31％,不适合工业化，并随培养时间变化逐渐降低，而当补料培养基C/N提高至16和18时，细胞蛋白质含量最高可达到36％，比之前提高了10％，且随着生物量的积累没有显著变化。因此，补料培养基C/N优选是16-18；同时，结合图10的实验结果，C/N＝18时，培养周期不宜过长，限制了生物量进一步增加，故为了获得更多衣藻蛋白质，更优选补料培养基C/N＝16。因此，与补料培养基C/N＝20相比，补料培养基C/N＝16有利于获得更多蛋白质。
图13为莱茵衣藻GUN4在补料碳氮比为16时的发酵后期(84h以后)培养照片，可见衣藻细胞已经达到可观密度，肉眼直观发酵罐内衣藻细胞密度已很高，并随着补料的不断添加，体积已经超过5.5L。图14为莱茵衣藻GUN4在补料碳氮比12时的发酵后期(84h以后)培养照片，可见细胞密度小，培养体积也难以扩增，且细胞因为铵中毒导致叶绿素分解，使藻液外观显现出黄色。
图15为本实施例莱茵衣藻GUN4在7.5L发酵罐中培养后期(84h)的细胞显微照片,可见细胞形态完整，培养体系无菌，大部分细胞依旧处于分裂期。图16为莱茵衣藻GUN4在补料碳氮比12时的发酵后期(84h以后)的细胞显微照片，由图11可知此时的铵根离子浓度，可见细胞形态较图15有了很大变化，细胞体积变大，细胞壁变薄。因此，在培养体系中尤其是培养后期，铵根离子浓度应维持在0.2-2mM的较低水平。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种高密度异养培养莱茵衣藻的方法，其特征在于，包括：
以莱茵衣藻GUN4为藻种，先进行摇瓶种子液培养，得到种子液后，再接种到发酵罐中进行异养培养，异养培养的培养基包括基础培养基和补料培养基；
接种到发酵罐中进行异养培养时，初始接种浓度为初始干重1.4-2.0 g/L；异养培养温度为28-30℃，溶解氧设定为20-25%，搅拌速度和溶解氧偶联控制罐内溶氧；异养培养时间为120-156h时进行收获，以获得高含蛋白质的莱茵衣藻；
基础培养基含有70-90 mM的乙酸根和氯化铵，氯化铵的量根据基础培养基C/N计算得到，其余成分与TAP培养基相同；所述氯化铵为基础培养基的氮源，基础培养基C/N为8-32；
补料培养基为酸性补料培养基，含有250-280 g/L冰乙酸、25-30 g/L乙酸铵和氯化铵，氯化铵的量根据补料培养基C/N计算得到，其余成分与浓缩50倍的TAP培养基相同；补料培养基中，冰乙酸为碳源，乙酸铵为碳氮源，氯化铵为氮源；补料培养基C/N为16-20；
培养过程的补料机制为：采用pH恒定补料策略结合控制碳氮源浓度策略，在培养0-24h不补料，待pH升至8.9±0.5开始补料，在培养第24-60 h内，按照pH维持在8.7±0.5进行补料；在培养第60-84 h内，按照pH维持在8.45±0.5进行补料；在培养第84-96 h内，按照pH维持在8.3±0.5进行补料；在培养第96 h至发酵结束，按照pH维持在8.0±0.5进行补料；
培养24 h至发酵结束，通过补料使发酵培养体系实时乙酸根浓度维持在20-115 mM，铵离子浓度维持在0.2-2 mM；当莱茵衣藻GUN4细胞生长达到平台期，培养结束。
2.根据权利要求1所述的高密度异养培养莱茵衣藻的方法，其特征在于，所述摇瓶种子液培养条件为：液体培养基以乙酸根为碳源，氯化铵为氮源，调节初始pH为7.2±0.5，其余成分与TAP培养基相同；且液体培养基中，乙酸根浓度为70-87.5 mM；培养温度是26-30℃；碳氮比为8-32；在黑暗摇床中培养。
3.根据权利要求1所述的高密度异养培养莱茵衣藻的方法，其特征在于，所述摇瓶种子液培养条件为：液体培养基以乙酸根为碳源，氯化铵为氮源，调节初始pH为7.2±0.5，其余成分与TAP培养基相同；且液体培养基中，乙酸根浓度为87.5 mM；培养温度是30℃；碳氮比为16-24；在黑暗摇床中培养。
4.根据权利要求1所述的高密度异养培养莱茵衣藻的方法，其特征在于，异养培养温度为30℃，溶解氧设定为20%，搅拌速度和溶解氧偶联控制罐内溶氧；异养培养时间为144-156h时进行收获，以获得高含蛋白质的莱茵衣藻。
5.根据权利要求1所述的高密度异养培养莱茵衣藻的方法，其特征在于，所述基础培养基含有87.5-90 mM的乙酸根和氯化铵，氯化铵的量根据基础培养基C/N计算得到，其余成分与TAP培养基相同；所述氯化铵为基础培养基的氮源，基础培养基C/N为16-24。
6.根据权利要求1所述的高密度异养培养莱茵衣藻的方法，其特征在于，补料培养基含有262.5 g/L冰乙酸、27.5 g/L乙酸铵和氯化铵，氯化铵的量根据补料培养基C/N计算得到，其余成分与浓缩50倍的TAP培养基相同；补料培养基中C/N为16-18。
7.根据权利要求1所述的高密度异养培养莱茵衣藻的方法，其特征在于，所述发酵罐同时还连接稀氨水；在补入酸性补料培养基后导致pH下降超出设定范围时，补入氨水将pH回调至设定值；当发酵培养体系中氮源浓度过低，补入氨水调高氮源浓度。
8.一种生产藻源蛋白的方法，其特征在于，按照权利要求1-7所述的方法培养莱茵衣藻，由莱茵衣藻中提取蛋白。
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