CN108220175B - 酿酒酵母高密度培养方法及其pH调控方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种酿酒酵母高密度培养方法及其pH调控方法，所述高密度培养方法包括以下步骤：一级和二级种子扩大培养；离心、洗涤后富集种子；将种子接入仅装有水的发酵罐内发酵培养，发酵过程中流加糖蜜和酵母浸粉溶液。pH调控方法包括，在线实时监测发酵罐内菌体的生理状态，根据二氧化碳释放速率、氧气摄入速率和呼吸商的变化调控流加糖蜜和酵母浸粉的速率，以调控发酵罐内的pH，整个发酵调控过程无需额外添加无机盐、酸、碱和微量元素；发酵结束，分离洗涤，收集酿酒酵母菌体。本发明方法操作简单，成本低，制备得到的酿酒酵母为食品级，蛋白含量高，发酵原料的转化率高，不外加酸碱，提高了操作的安全性。

Description

酿酒酵母高密度培养方法及其pH调控方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及酿酒酵母高密度培养方法及发酵过程中的pH调控方法。

背景技术

酵母有是一种纯天然、无污染、生物态的健康营养源，营养成分达50多种，含有人体所必需的完全蛋白质、维生素B群、核酸等，被营养学界誉为最有魅力的营养品。酵母细胞中含水量为65-70％，其中约有15％为游离水；含糖类物质35-45％，其中主要以多糖的形式存在；含35-45％蛋白质，有单体蛋白质和结合蛋白质；含3-5％脂肪，主要是卵磷脂和固醇；含灰份5-10％，主要是钾，磷含量。此外还含有多种维生素，以B族维生素的含量最多。酿酒酵母具有繁殖率高，产率高，易培养等特性。酵母幼龄细胞，其细胞壁较薄，所以不明显；细胞到达衰老期，细胞壁会较厚，可达1.2μm，约占细胞质量的20％～25％。

从19世纪末至本世纪20年代，酵母生产工艺的主要变化有：

l)通气培养的广泛应用：19世纪70年代，巴斯德效应的发现为酵母的通风培养法奠定了理论基础，即在有氧条件下，酵母的繁殖速率加快，而酒精的产率下降。1877年，哥本哈根的Eusebius Bruun提出了通风培养生产酵母的方法。通风的作用使酵母的浓度大大提高，酒精的浓度大大下降，使酵母工业与酒精工业分离。

2)流加工艺的发现：1910-1920年，丹麦和德国的科学家首先发明并完善了流加工艺。时至今日，该工艺仍然是既能最大限度地得到生物量，又能尽量少产乙醇的唯一可行的方法。在这种方法中，开始培养时，培养液中的糖浓度较低，在培养过程中不断补加浓糖液，酵母利用多少，就补加多少，使得在整个培养过程中培养液保持较低的糖浓度。采用此方法，既可获得较高的酵母收得率，又可获得高的酵母浓度。

3)用糖蜜替代粮食作为生产原料：本世纪20至30年代，廉价的废糖蜜逐渐取代玉米、麦芽等粮食成为酵母主要生产原料，进一步降低了酵母的生产成本。此工艺有三大优点:一是简化酵母生产工艺，取消了以粮食为原料工艺中复杂的原料处理过程；二是价格比粮食低得多；三是糖蜜的营养比粮食原料的酸法水解糖更丰富。在糖蜜中含有多种维生素是酵母生长所必须的，如生物素、泛酸盐、肌醇、硫胺素等，都有利于促进酵母生长和提高酵母质量。

现如今酵母传统工业化生产方式有以下几种：

1)传统的工艺发酵，即将糊化后的淀粉糖化，水解成酵母易于利用的单糖，然后接入酵母菌，在适宜温度下进行发酵，但此工艺的缺点是发酵周期长，易染菌，产率也不高。

2)一步发酵法，将木薯等天然成分磨碎成粉状或粒状，直接作为发酵原料，在一定温度下进行发酵。该工艺特点是同时糖化和发酵，原料不需要蒸煮或糖化，可大量节省能耗和生产成本，发酵产率也较高。

3)固定化酵母发酵技术，即采用性能优良无毒的高分子聚合物为载体(通常采用海藻酸钠、琼脂等载体)，利用发泡技术包埋固定酵母，使酵母在载体内形成稳定的酵母场，结构外形呈蜂窝状，用不锈钢网围放在发酵罐内，以源源不断地保持酒精发酵。固定化酵母发酵技术较之传统的发酵技术，发酵速率、设备利用率和酒精产量可同时提高10％-30％，此工艺既缩短酵母培养时间，又能减少酵母染菌，另外工艺操作简单，能适应生产条件的变化，提高生产效率。

4)絮凝酵母自固定化发酵，利用酵母自身的絮凝能力，菌体在发酵分离过程中不流失而自絮凝固定于发酵罐中，从而提高循环发酵速率，提高生产效率。此工艺优点在于细胞固定化操作简单，无需额外添加化学制品，也不用考虑固定化细胞的强度问题。

5)高密度发酵培养，高密度培养技术(High Cell Density Culture，HCDC)即利用一定的培养方式和发酵设备，使菌体的发酵密度较普通发酵的有一定提高，以此来提高菌体特定代谢产物的比生产率。用来评价的单位是干细胞重/升(DCW/L)。在微生物的高密度培养过程中，培养基及培养条件占有很重要的地位。培养基与特定产物产量系数和比生长速率之间存在直接联系，高浓度的培养基成分对菌体有一定的抑制作用；培养条件则与发酵过程中不同菌体的生理生化特性有关，二者均是高密度培养过程中优化的必要途径。

在酵母细胞的高密度培养研究上已经有许多成功的报道，利用分阶段控制比生长速率(μ)的高密度培养酿酒酵母干重达20.2g/L，采用恒速流加补料方式高密度培养重组毕赤酵母细胞干重达53.4g/L；采用pH-state控制流加培养红发夫酵母产虾青素细胞干重达30.1g/L。

综上所述，在高密度发酵流加策略研究方面，国内外主要采取恒速补料，变速补料(拟指数补料)，恒pH(pH-state)，RQ偶联DO(呼吸商偶联溶氧)控制补料等方法，收获菌体生物量水平在(DCW)20-54g/L，而且生产周期在30-60h，存在生产周期长，原料利用率低的缺陷。

发明内容

本发明解决的技术问题是：现有技术中的高密度培养周期长，以离线参数酒精浓度作为反馈调控补料流加的信号，存在迟滞缺陷，原料利用率低，产品的菌体密度低；现有技术中需使用酸碱调节pH，存在安全隐患。

本发明的目的是利用优质的高蛋白酿酒酵母作为生产菌种，提供一种短周期内收获高密度酵母菌体的方法。通过实时监测酵母代谢生理参数(CER：二氧化碳释放速率，OUR：氧气摄入速率和RQ：呼吸商)，基于pH-state偶联RQ反馈，控制流加糖蜜和酵母浸粉(YE)的速率，实现酵母的按需补给，克服传统发酵工艺中主要依靠离线参数酒精浓度反馈调节补糖速率的迟滞缺陷。发酵全过程不用酸碱调节pH，通过糖蜜与氮源YE的配合流加实现整个发酵过程的pH稳态波动，避免使用强酸强碱在生产中的安全隐患。

具体来说，针对现有技术的不足，本发明提供了如下技术方案：

一方面，本发明提供了一种酿酒酵母高密度培养的方法，所述方法包括以下步骤：

b.种子培养：将保存斜面的菌体进行一级和二级种子培养；

c.种子富集：离心、洗涤，富集得到酿酒酵母种子；

d.发酵调控：将步骤c的酿酒酵母种子接入仅装有水的发酵罐内进行发酵培养，发酵罐内的通气比为1.6-2.5VVM，溶氧体积45-70％，在线实时监测菌体的生理状态，根据实时监测的生理参数调控流加补料的速率，所述生理参数包括二氧化碳释放速率、氧气摄入速率和呼吸商，所述发酵调控过程除流加补料外无需额外添加无机盐、酸、碱和微量元素；

e.发酵结束，分离洗涤，收集酿酒酵母菌体。

优选的，所述发酵调控过程中流加的补料含碳源和氮源，所述碳源包括糖蜜、蔗糖、葡萄糖或麦芽汁中的一种，所述氮源包括酵母浸粉或玉米浆，在线实时监测所用的仪器包括生物尾气分析仪。

优选的，所述发酵调控过程中流加的补料为糖蜜和酵母浸粉。

优选的，所述高密度培养方法还包括以下步骤：

a.发酵原料处理：糖蜜去渣沉淀，加酸酸化水解得到还原糖重量占20-25％的发酵型糖蜜，所述酸选自硫酸、盐酸、硝酸或磷酸中的一种或几种。

优选的，所述发酵调控过程中的呼吸商值控制在0.6-1.2，当呼吸商值大于1.2时，降低补料的流加速率；当呼吸商值小于0.6时，提高补料的流加速率。

优选的，所述发酵调控过程控制pH在4.2-6.0。

优选的，所述一级种子培养使用的一级培养基的组成按重量计，包括：1-2％酵母膏，2-4％蛋白胨和2-4％葡萄糖；所述一级种子培养的接种量为按照每200mL一级培养基接种一环菌种计算，培养条件为28-32℃温度，200-300rpm转速下培养18-26小时。

优选的，所述二级种子培养使用的二级培养基的组成按重量计，包括：2-4％葡萄糖，2-4％酵母浸粉，0.1-0.3％磷酸二氢钾和0.1-0.3％磷酸氢二钾，其pH控制在5.5-5.8；所述二级种子培养的接种量为二级培养基体积的10-15％，培养条件为28-32℃温度，200-300rpm转速下培养18-25小时。

优选的，所述发酵培养的接种量为发酵罐内装液量体积的10-15％，发酵温度为26-35℃，压力为0.03-0.15MPa，时间为14-20小时。

优选的，步骤c富集得到的酿酒酵母种子的湿重为400-700g/L。

优选的，以干基计算，步骤e得到的酿酒酵母菌体密度为60-80g/L。

优选的，步骤e中收集菌体的方法为在4500-6000rpm转速，15-20℃下离心10-20分钟。

优选的，所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiaeFX-2)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为M2016418。

另一方面，本发明提供了利用所述的高密度培养方法制备的酿酒酵母在食品领域、保健领域或微生物发酵领域中的应用。

再一方面，本发明还提供了一种酿酒酵母高密度培养的pH调控方法，所述方法包括以下步骤：

b.种子培养：将保存斜面的菌体进行一级和二级种子培养；

c.种子富集：离心、洗涤，富集得到酿酒酵母种子；

d.发酵培养：将步骤c的酿酒酵母种子接入仅装有水的发酵罐内进行发酵培养，发酵罐内的通气比为1.6-2.5VVM，溶氧体积45-70％；

步骤d中的pH调控方法为：在线实时监测菌体的生理状态，根据实时监测的生理参数调控流加补料的速率，保持发酵罐内的呼吸商值在0.6-1.2，pH在4.2-6.0，所述生理参数包括二氧化碳释放速率、氧气摄入速率和呼吸商，所述发酵调控过程无需额外添加无机盐、酸、碱和微量元素。

优选的，流加的补料为糖蜜和酵母浸粉，所述糖蜜经酸处理后得到还原糖重量占20-25％的发酵型糖蜜，所述酵母浸粉配成溶液后流加。

优选的，当发酵罐内的呼吸商值大于1.2时，降低补料的流加速率；当发酵罐内的呼吸商值小于0.6时，提高补料的流加速率。

与现有技术相比，本发明的效果和益处在于：本发明利用在线生理学参数CER，OUR和RQ作为发酵调控指标，反馈调控碳氮源流加，科学精准调控，提高菌体产品的密度，原料转化率提高到85％以上。发酵过程中pH调控无需使用酸碱调控，克服了无机酸碱的添加对发酵pH环境的快速改变，缓冲能力差的弊端。此外，采用YE作为氮源后营养组分充足，能够完全满足酵母生长所需，且经过酵母代谢产生的NH₄ ⁺可缓冲中和碳源代谢产生有机酸性中间代谢产物，起到酵母发酵pH自身平衡调控，提高安全性。

菌株保藏信息

本发明所用的菌种酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)于2016年8月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为M2016418，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮政编码：430072；电话：(027)-68752319。

附图说明

图1为实施例1发酵调控过程中在线实时监测的生理参数变化图；

图2为实施例2及对比例1-4发酵过程在线监测的二氧化碳释放速率和氧气摄入速率变化曲线图。

图1中的曲线1表示CER的变化，2表示OUR的变化，3表示pH变化，4表示RQ的变化，5表示溶氧变化，6表示尾碳的变化，7表示尾氧的变化，8表示转速变化。

图2中的曲线11和曲线21表示的是对比例4发酵罐中的CER和OUR变化；曲线12和曲线22表示的是实施例2发酵罐中的CER和OUR变化；曲线13和曲线23表示的是对比例1发酵罐中的CER和OUR变化；曲线14和曲线24表示的是对比例2发酵罐中的CER和OUR变化；曲线15和曲线25表示的是对比例3发酵罐中的CER和OUR变化。

具体实施方式

本发明提供了一种培养酿酒酵母产品的方法，特别是一种利用在线生理学参数，调控发酵过程的pH无需使用无机酸碱试剂调节，环保、安全性高。本发明所述的高密度培养是指菌体的密度超过常规10倍以上的发酵培养，一般菌体密度为20-100DCW/L都可称为高密度培养。本发明方法制备得到的产品可应用于食品领域，生产调味品例如酵母抽提物，烘焙领域的活性干酵母，人类健康保健领域的即食酵母粉，以及微生物发酵领域的作为微生物培养基用酵母粉及浸出物。

本发明以食品级酵母浸粉和糖蜜为原料，以生物尾气分析仪监测的在线生理学参数CER，OUR和RQ为反馈调控信号，实现对高密度生产酵母的调控。酵母高密度培养所用的菌种为非转基因型食品级高蛋白酿酒酵母，将酵母菌从保种斜面经逐级放大液体培养，再经水洗富集使种子的湿重浓度达到400-700g/L，再转接至发酵罐液体培养；培养全过程无需额外添加无机盐、酸碱及微量元素；根据在线生理学参数RQ值决定无菌物料糖蜜和酵母浸粉的流加速率，当RQ大于1.2时，同步降低糖蜜和酵母浸粉的流加速率，当RQ小于0.6时，同步提高糖蜜和酵母浸粉的流加速率，按需补给，使得原料利用率均在85％以上，发酵结束时酿酒酵母菌体密度可达60-80g/L(干基)，蛋白含量可达60％以上，再经洗涤，离心浓缩，压滤，干燥获得酵母及其酵母源类产品。

本发明将在线生理学参数CER，OUR和RQ作为发酵调控指标，反馈调控碳氮源流加，按需补给，提高物料转化率及生产效率，避免产物及中间代谢产物及巴斯德效应抑制，实现酿酒酵母零酒精发酵。此外，采用YE作为氮源一方面是其营养组分充足能够完全满足酵母生长所需，另一方面，经过酵母代谢产生的NH₄ ⁺可缓冲中和碳源代谢产生有机酸性中间代谢产物，起到酵母发酵pH自身平衡调控。因此，本发明能够取消传统工业化生产中的强酸强碱，降低生产环保维护费用及生产安全风险，实现工业化发酵清洁生产。

本发明所使用的酿酒酵母FX-2来自于发酵面团，发酵面团中含有多种野生菌，以发酵面团为样品，制备面团浸出液，经过稀释涂布平板分离法分离得到纯种的菌株，经鉴定确认该菌株属于酿酒酵母。

菌株鉴定方法为:采用16S rRNA测序进行鉴定，结果表明序列同源性大于99％，从而确定本发明分离得到的菌株属于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，生物学分类为酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)。

本发明所述酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)于2016年8月1日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为M2016418。

在一优选实施方式中，酿酒酵母的高密度培养方法包括以下步骤:

a.发酵原料处理：糖蜜去渣沉淀，酸化水解得到还原糖重量占20-25％的发酵型糖蜜；糖蜜预处理过程中加入的酸包括浓硫酸、盐酸、硝酸和磷酸等；酵母浸粉加水配成浓度20-25％的溶液；将处理后的糖蜜和酵母浸粉溶液灭菌；

b.种子培养：一级种子培养，从菌种保存斜面接入一环菌体进入200ml一级培养基；二级种子培养，按照10％接种量接入1L二级培养基；

c.种子富集：离心，用去离子水反复洗涤，富集得到酿酒酵母种子，种子的湿重为400-700g/L；

d.发酵培养：往50L发酵罐内装30L发酵底水，按照发酵底水体积的10％将富集后的种子接入到发酵罐中，控制温度26-35℃，罐压0.03-0.15MPa，通气比为1.6-2.5VVM，溶氧控制在45-70％，发酵过程中，通过控制蠕动添加酵母浸粉溶液的速率，保持生物尾气分析仪监测的在线参数RQ值在0.6-1.2，通过糖蜜及YE流加速率控制pH保持在4.2-6.0；

e.分离洗涤：发酵14-20h结束，5000rpm条件下离心10min后收集菌体。

本发明方法制备得到的酵母菌体密度可达60-80g/L(干基)，原料利用率高，且制备过程中不需要流加无机酸碱调控pH，发酵体系环境的pH稳定，利于菌体生长，产品的菌体密度高。

本发明方法流加糖蜜和YE的速率是在实时监测到的发酵罐内的RQ值的指导下进行的，上调或者下调补料糖蜜和YE的流加速率的目的是保持发酵罐内的RQ值在0.6-1.2，对应的pH在4.2-6.0，为菌种的生长提供适宜的环境。不同生长阶段的菌种代谢强度不同，体系的RQ值和pH变化，补料的流加速率变化大，但无论如何调节补料的流加速度，都要保证体系的RQ值和pH值在适宜范围内。在工业应用中，对于300m³的发酵罐，采用本发明所述高密度培养方法培养酵母菌株的产量超过15t/罐(干物质)，糖蜜的流加速率在1000-8000L/h，YE的流加速率在50-550L/h，糖蜜的转化率在90％-95％。

下面通过实施例作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不限于具体的实施例。

下面的实施例中所用的实验材料与设备的制造厂商名称如下：

糖蜜：广西柳州市金黔湾糖蜜有限公司

酵母浸粉：安琪酵母股份有限公司，FM888

蛋白胨：安琪酵母股份有限公司，FP101

葡萄糖：上海阿拉丁生化科技股份有限公司

磷酸氢二钾：上海阿拉丁生化科技股份有限公司

磷酸二氢钾：上海阿拉丁生化科技股份有限公司

酿酒酵母FX-2(Saccharomyces cerevisiae FX-2)：保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2016418

摇瓶(蜀牛)：蜀玻集团

种子罐(10L)：上海国强生化工程装备有限公司

发酵罐(FUS-50L)：上海国强生化工程装备有限公司

生物尾气分析系统PAS7000：重庆哈特曼科技有限公司

贝克曼离心机：Beckman Coulter J6-MI大容量冷冻离心机

以下所有实施例和对比例中使用的菌种均为酿酒酵母FX-2(Saccharomycescerevisiae FX-2)，该菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为M2016418。

以下所有实施例中涉及的酵母菌体密度测试方法为光密度法，蛋白含量测定方法为凯氏定氮法。

实施例1

本实施例是基于在线生理学参数调控酿酒酵母高密度培养的方法，其步骤包括：

a.发酵原料处理：糖蜜去渣沉淀，加浓硫酸酸化至pH2.0，使糖蜜水解得到还原糖重量占20％的发酵型糖蜜；酵母浸粉加水配成浓度20％的溶液；将处理后的糖蜜和酵母浸粉溶液在110℃灭菌10分钟。

b.种子培养：一级种子培养，从菌种保存斜面接入一环菌体(酿酒酵母FX-2)进入200ml一级培养基，在30℃下，220rpm转速下培养18h；二级种子培养，按照二级培养基体积的10％将一级培养的种子接入1L二级培养基，28℃下，200rpm转速下培养18h；

按重量计，所述一级培养基组成为：1％酵母膏，2％蛋白胨和2％葡萄糖；二级培养基的组成为：2％葡萄糖，2％酵母浸粉，0.1％磷酸二氢钾和0.1％磷酸氢二钾，其pH控制在5.5。

c.种子富集：离心，用钙离子和镁离子含量低的去离子水洗涤3次，富集得到酿酒酵母种子，酵母湿重为400g/L。

d.发酵培养：将65L不添加任何营养因子的发酵底水加入100L的发酵罐内，按照10％的体积接种量将富集后的种子接入到发酵罐中，控制温度30℃，常压发酵，通气比为1.667VVM，通过调节转速将溶氧体积控制在50％。发酵过程中，通过生物尾气分析仪在线实时监测的生理学参数RQ，CER和OUR(见附图1)，保持在线参数RQ值在0.85-1.1小幅波动，当RQ大于1.1时，同步降低糖蜜和YE的流加速率来降低RQ值，当RQ小于0.85时，同步提高糖蜜和YE的流加速率来提高RQ值，整个调控过程中，糖蜜的流加速率范围控制在10-40mL/min，酵母浸粉溶液的流加速率范围控制在1-3mL/min，控制发酵全过程pH在4.2-4.5；发酵5.22h的时候，罐内的各项生理参数数值如下：CER为240.16mmoL/(h·L)，OUR为253.38mmoL/(h·L)，RQ为0.95，pH为4.49，溶氧11.3％，尾碳4.80％，尾氧15.97％，发酵罐内转速为399rpm，菌株处于生长阶段，生理状态好。

e.发酵液分离：发酵14小时后，通过贝克曼离心机，在5000rpm，15℃条件下离心10min，收获菌相，再加去离子水洗涤，重复洗涤一次，收获菌体。

发酵培养过程中，采用光密度法测定菌体密度，发酵结束后，酿酒酵母菌体密度达60g/L(干基)；采用凯氏定氮法测定本发明方法培养得到的酿酒酵母菌体中的蛋白含量，酿酒酵母菌体中的蛋白质量含量为60％。发酵结束后，发酵液中的还原糖占加入的发酵型糖蜜的2％，糖蜜的转化率达90％。

实施例2

本实施例是基于在线生理学参数调控酿酒酵母的高密度培养方法，其步骤包括：

a.发酵原料处理：糖蜜去渣沉淀，加浓盐酸酸化至pH2.5，使糖蜜水解得到还原糖重量占25％的发酵型糖蜜，酵母浸粉加水配成浓度25％的溶液；将处理后的糖蜜和酵母浸粉溶液在110℃灭菌10分钟。

b.种子培养：一级种子培养，从菌种保存斜面接入一环菌体(酿酒酵母FX-2)进入200ml一级培养基，在28℃下，200rpm转速下培养20h；二级种子培养，按照二级培养基体积的12％接种量接入1L二级培养基，30℃下，220rpm转速下培养20h；

按重量计，所述一级培养基组成为：2％酵母膏，4％蛋白胨和4％葡萄糖；二级培养基的组成为：3％葡萄糖，3％酵母浸粉，0.2％磷酸二氢钾和0.2％磷酸氢二钾，其pH控制在5.6。

c.种子富集：离心，用钙离子和镁离子含量低的去离子水洗涤3次，富集得到酿酒酵母种子，酵母湿重为500g/L。

d.发酵培养：将30L不添加任何营养因子的发酵底水加入到50L的发酵罐内，按照15％的体积接种量将富集后的种子接入到发酵罐中，控制温度26℃，压力0.03MPa下发酵，通气比为1.6VVM，溶氧体积控制在45％，发酵过程中，通过生物尾气分析仪在线实时监测的生理学参数RQ，CER和OUR(在线CER和OUR变化曲线见附图2中的曲线12和曲线22，发酵9小时的时候，发酵罐内的CER数值为275.00mmoL/(h·L)，OUR数值为296.46mmoL/(h·L)，保持在线参数RQ值在0.6-1.0小幅浮动，当RQ大于1.0时，同步降低糖蜜和YE的流加速率来降低RQ值，当RQ小于0.6时，同步提高糖蜜和YE的流加速率来提高RQ值，整个调控过程中，糖蜜的流加速率范围为5-30mL/min，酵母浸粉溶液的流加速率范围为0.3-2.0mL/min，控制发酵全过程pH在4.6-4.8。

e.发酵液分离：发酵16小时后，通过贝克曼离心机，在4500rpm，20℃条件下离心15min，收获菌相，再加去离子水洗涤，重复洗涤一次，收获菌体。

发酵培养过程中，采用光密度法测定菌体密度，发酵结束后，酿酒酵母菌体密度达64g/L(干基)；采用凯氏定氮法测定本发明方法培养得到的酿酒酵母菌体中的蛋白含量，酿酒酵母菌体中的蛋白质量含量为61％。发酵结束后，发酵液中的还原糖占加入的发酵型糖蜜的3％，糖蜜的转化率达88％。

实施例3

本实施例是基于在线生理学参数调控酿酒酵母的高密度培养方法，其步骤包括：

a.发酵原料处理：糖蜜去渣沉淀，加浓硝酸酸化至pH3.5，使糖蜜水解得到还原糖重量占22％的发酵型糖蜜，酵母浸粉加水配成浓度22％的溶液；将处理后的糖蜜和酵母浸粉溶液在110℃灭菌10分钟。

b.种子培养：一级种子培养，从菌种保存斜面接入一环菌体(酿酒酵母FX-2)进入250ml一级培养基，在32℃下，300rpm转速下培养26h；二级种子培养，按照二级培养基体积的15％接种量接入1L二级培养基，32℃下，300rpm转速下培养25h。

按重量计，所述一级培养基组成为：1％酵母膏，2％蛋白胨和2％葡萄糖；二级培养基的组成为：4％葡萄糖，4％酵母浸粉，0.3％磷酸二氢钾和0.3％磷酸氢二钾，其pH控制在5.8。

c.种子富集：离心，用钙离子和镁离子含量低的去离子水洗涤3次，富集得到酿酒酵母种子，酵母湿重为700g/L。

d.发酵调控：将30L水加入发酵罐内，不添加任何营养因子，按照11％的体积接种量将富集后的种子接入到发酵罐中，控制温度35℃，压力0.15MPa下发酵，通气比为2.5VVM，溶氧体积控制在70％，发酵过程中，通过生物尾气分析仪在线实时监测的生理学参数RQ，CER和OUR，保持在线参数RQ值在1.1-1.2小幅浮动，当RQ大于1.2时，同步降低糖蜜和YE的流加速率来降低RQ值，当RQ小于1.1时，同步提高糖蜜和YE的流加速率来提高RQ值，整个调控过程中，糖蜜的流加速率范围为5-35mL/min，酵母浸粉溶液的流加速率范围为0.5-2.0mL/min，控制发酵全过程pH保持在5.0-6.0。

e.发酵液分离：发酵20小时后，通过贝克曼离心机，在6000rpm，15℃条件下离心20min，收获菌相，再加去离子水洗涤，重复洗涤一次，收获菌体。

发酵培养过程中，采用光密度法测定菌体密度，发酵结束后，酿酒酵母菌体密度达80g/L(干基)；采用凯氏定氮法测定本发明方法培养得到的酿酒酵母菌体中的蛋白含量，酿酒酵母菌体中的蛋白质量含量为70％。发酵结束后，发酵液中的还原糖占加入的发酵型糖蜜的2％，糖蜜的转化率达91％。

对比例1

本对比例也是基于在线参数调控酿酒酵母的发酵方法，其与实施例2的区别在于，流加的氮源不是酵母浸粉，而是氨水。本对比例中使用的菌种、培养基及培养方法和处理方法均与实施例2相同，发酵9小时的时候，发酵罐内的CER数值为68.55mmoL/(h·L)，OUR数值为63.00mmoL/(h·L)，在线的CER和OUR参数变化见附图2中的曲线13和曲线23。

对比例2

本对比例也是基于在线参数调控酿酒酵母的发酵方法，其与实施例2的区别在于，流加的氮源不是酵母浸粉，而是碳酸钠。本对比例中使用的菌种、培养基及培养方法和处理方法均与实施例2相同，发酵9小时的时候，发酵罐内的CER数值为184.52mmoL/(h·L)，OUR数值为177.93mmoL/(h·L)，在线的CER和OUR参数变化见附图2中的曲线14和曲线24。

对比例3

本对比例也是基于在线参数调控酿酒酵母的发酵方法，其与实施例2的区别在于，流加的氮源不是酵母浸粉，而是氢氧化钠。本对比例中使用的菌种、培养基及培养方法和处理方法均与实施例2相同，发酵9小时的时候，发酵罐内的CER数值为68.46mmoL/(h·L)，OUR数值为62.77mmoL/(h·L)，在线的CER和OUR参数变化见附图2中的曲线15和曲线25。

对比例4

本对比例与实施例2的菌种相同、培养基相同、投料量相同，并且同样以糖蜜和酵母浸粉分别做发酵培养的碳源和氮源，但是本实施例是预先将所有原料一次性加入发酵罐内，然后监测发酵罐内的CER和OUR变化，发酵9小时的时候，发酵罐内的CER数值为305.90mmoL/(h·L)，OUR数值为3.31mmoL/(h·L)，CER和OUR随时间的变化曲线如图2中的曲线11和曲线21所示。

附图2给出了以酵母浸粉、氨水、碳酸钠和氢氧化钠作发酵培养流加的氮源时，在线实时监测到的二氧化碳释放速率和氧气摄入速率随时间的变化，以及一次性投料时，监测发酵罐内的CER和OUR随时间变化曲线。由图2可以看出，采用本发明所述高密度培养方法流加氮源时，相比以氨水、碳酸钠和氢氧化钠作氮源时，以酵母浸粉为氮源的条件下，整个发酵过程中的CER和OUR都保持在较高的生理活性状态，发酵菌株的生理状态好，由此说明本发明使用酵母浸粉的效果要比使用无机盐或碱作氮源好得多。

根据附图2给出的曲线变化趋势，以及发酵9小时发酵罐内的CER和OUR数值，可以看到，采用一次性投料发酵时，发酵9小时后罐内的菌株生长达到最高值，CER值达305.90mmoL/(h·L)，而OUR值仅为3.31mmoL/(h·L)，菌株即将进入衰减阶段，相比之下，采用本发明所述方法进行流加培养的CER和OUR随时间变化的趋势一致，相对数值也接近，菌株处于较高的生理状态；进一步说明了本发明所述的流加补料，实时监测罐内生理参数的高密度培养方法要比一次性加料的发酵方法好得多。

实施例4

本实施例研究了实施例1制备得到的酿酒酵母的产品质量，其结果如下：

香气:鲜酵母味

活细胞率为98-100％(GB/T20886规定≥75％)；水分含量为4-7％；

微量元素含量：铁：13.3mg/Kg、锌为12.6mg/Kg、镁为70.0mg/Kg、锰为6.5mg/Kg、维生素VB₁为0.066mg/100g、维生素C为104mg/100g；

水解氨基酸：总量为60-65％(干基)；

重金属检测数据表明：有机酵母总砷、铅、致病菌均符合GB/T20886-2007标准要求。

将实施例1制备的酿酒酵母产品与传统方法制备的酿酒酵母产品进行对比，结果见表1。

表1实施例1与传统方法制备得到的酿酒酵母产品指标对比

本发明制备的酿酒酵母符合有关于酵母的各项标准和规定，且相比传统制备方法，本发明方法使用的原料仅有糖蜜和酵母浸粉，不需要添加无机盐、酸和碱，而传统生产工艺中采用浓硫酸和纯碱调节发酵pH。因此，本发明避免了强酸强碱对微生物生长的抑制作用；减小了安全隐患，符合清洁生产原则，减少了对环境的污染。此外，相比传统制备方法，本发明的单罐生产效率及原料转换率均有优势。从酵母营养组分对比：本发明制备的酿酒酵母产品的游离氨基酸组分谷氨酸和胱氨酸有明显提高，谷氨酸由2.55提高到3.78，胱氨酸由0.47提高到3.5，这在微生物培养领域应用有显著优势。

以上通过实施例描述了本发明的具体实施方式，本领域技术人员应理解的是，上文实施例仅出于举例的目的，不应认为以此限定本发明之保护范围，本领域技术人员在不脱离本发明精神的前提下可以对其进行修改、变化或替换，但是，依照本发明所作的各种等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (12)

1.一种酿酒酵母高密度培养的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a. 发酵原料处理：糖蜜去渣沉淀，加酸酸化水解得到还原糖重量占20-25%的发酵型糖蜜，所述酸选自硫酸、盐酸、硝酸或磷酸中的一种或几种；

b. 种子培养：将斜面保存的菌株进行一级和二级种子培养；

c. 种子富集：离心、洗涤，富集得到酿酒酵母种子；

d. 发酵培养：将步骤c的酿酒酵母种子接入仅装有水的发酵罐内进行发酵培养，发酵罐内的通气比为1.6-2.5VVM，溶氧体积45-70%，在线实时监测菌体的生理状态，根据实时监测的生理参数调控流加补料的速率，所述生理参数包括二氧化碳释放速率、氧气摄入速率和呼吸商，所述调控过程除流加补料外无需额外添加无机盐、酸、碱和微量元素；

所述调控过程中的呼吸商值控制在0.6-1.2，当呼吸商值大于1.2时，降低补料的流加速率；当呼吸商值小于0.6时，提高补料的流加速率；

所述调控过程控制pH在4.2-6.0；

e. 发酵结束，分离洗涤，收集酿酒酵母菌体；

所述调控过程中流加的补料为糖蜜和酵母浸粉；

所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母FX-2（Saccharomyces cerevisiae FX-2），该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO. M 2016418。

2.根据权利要求1所述的高密度培养方法，其特征在于，步骤b所述的一级种子培养使用的一级培养基的组成按重量计，包括：1-2%酵母膏，2-4%蛋白胨和2-4%葡萄糖；所述一级种子培养的接种量为按照每200-250mL一级培养基接种一环菌种计算，培养条件为28-32℃温度，200-300rpm转速下培养18-26小时。

3.根据权利要求1所述的高密度培养方法，其特征在于，步骤b所述的二级种子培养使用的二级培养基的组成按重量计，包括：2-4%葡萄糖，2-4%酵母浸粉，0.1-0.3%磷酸二氢钾和0.1-0.3%磷酸氢二钾，其pH控制在5.5-5.8；所述二级种子培养的接种量为二级培养基体积的10-15%，培养条件为28-32℃温度，200-300rpm转速下培养18-25小时。

4.根据权利要求2所述的高密度培养方法，其特征在于，步骤b所述的二级种子培养使用的二级培养基的组成按重量计，包括：2-4%葡萄糖，2-4%酵母浸粉，0.1-0.3%磷酸二氢钾和0.1-0.3%磷酸氢二钾，其pH控制在5.5-5.8；所述二级种子培养的接种量为二级培养基体积的10-15%，培养条件为28-32℃温度，200-300rpm转速下培养18-25小时。

5.根据权利要求1所述的高密度培养方法，其特征在于，步骤d的接种量为发酵罐内装液量体积的10-15%，发酵温度为26-35℃，压力为0.03-0.15MPa，时间为14-20小时。

6.根据权利要求2所述的高密度培养方法，其特征在于，步骤d的接种量为发酵罐内装液量体积的10-15%，发酵温度为26-35℃，压力为0.03-0.15MPa，时间为14-20小时。

7.根据权利要求3所述的高密度培养方法，其特征在于，步骤d的接种量为发酵罐内装液量体积的10-15%，发酵温度为26-35℃，压力为0.03-0.15MPa，时间为14-20小时。

8.根据权利要求4所述的高密度培养方法，其特征在于，步骤d的接种量为发酵罐内装液量体积的10-15%，发酵温度为26-35℃，压力为0.03-0.15MPa，时间为14-20小时。

9.根据权利要求1-8任一项所述的高密度培养方法，其特征在于，步骤c富集得到的酿酒酵母种子的湿重为400-700g/L。

10.根据权利要求1-8任一项所述的高密度培养方法，其特征在于，以干基计算，步骤e得到的酿酒酵母菌体密度为60-80g/L。

11.根据权利要求1-8任一项所述的高密度培养方法，其特征在于，步骤e中收集菌体的方法为在4500-6000rpm转速，15-20℃下离心10-20分钟。

12.一种酿酒酵母高密度培养的pH调控方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a. 发酵原料处理：糖蜜去渣沉淀，加酸酸化水解得到还原糖重量占20-25%的发酵型糖蜜，所述酸选自硫酸、盐酸、硝酸或磷酸中的一种或几种；

b. 种子培养：将保存斜面的菌株进行一级和二级种子培养；

c. 种子富集：离心、洗涤，富集得到酿酒酵母种子；

d. 发酵培养：将步骤c的酿酒酵母种子接入仅装有水的发酵罐内进行发酵培养，发酵罐内的通气比为1.6-2.5VVM，溶氧体积45-70%；

步骤d中的pH调控方法为：在线实时监测菌体的生理状态，根据实时监测的生理参数调控流加补料的速率，保持发酵罐内的呼吸商值在0.6-1.2，pH在4.2-6.0，所述生理参数包括二氧化碳释放速率、氧气摄入速率和呼吸商，所述调控过程无需额外添加无机盐、酸、碱和微量元素；

当发酵罐内的呼吸商值大于1.2时，降低补料的流加速率；当发酵罐内的呼吸商值小于0.6时，提高补料的流加速率；

所述调控过程中流加的补料为糖蜜和酵母浸粉；

所述酿酒酵母菌株为酿酒酵母FX-2（Saccharomyces cerevisiae FX-2），该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO. M 2016418。

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