CN101429537A

CN101429537A - 酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法

Info

Publication number: CN101429537A
Application number: CNA2008102338360A
Authority: CN
Inventors: 贾子龙; 段彬; 曲国臣; 王选性
Original assignee: ZEACEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: ZEACEN BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2008-12-14
Filing date: 2008-12-14
Publication date: 2009-05-13

Abstract

本发明提供了一种酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，以酿酒酵母为培养菌株，经过扩大培养，在过程控制中实时对发酵尾气进行检测分析，超前预测酵母细胞的代谢情况，为补料提供更及时、更准确的指导，给出了更有利于积累谷胱甘肽的工艺技术参数。同时本发明发现在适量添加前体氨基酸的同时，降低发酵温度和流加补料的速率可以明显提高酵母中GSH的含量，此方法在发酵的后段可以节省流加补料的用量，降低生产成本。最终GSH含量可达1800mg/L以上。

Description

酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法

技术领域本发明涉及谷胱甘肽的高密度发酵生产法，属于生物技术领域。

背景技术谷胱甘肽(GSH)，即γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，是由三个氨基酸组成的小肽，通常所说的谷胱甘肽是指还原型谷胱甘肽，其在生物体内起重要作用。谷胱甘肽是细胞内存在的最丰富的小分子硫醇类化合物，是保护酶和其他蛋白质的硫氢基的一种抗氧化剂，是细胞内非蛋白硫氢基团的主要组成部分，参与细胞内的氧化还原反应，是某些酶的辅酶，并对一些巯基酶有激活作用。越来越多的临床科学实验显示，人体内的谷胱甘肽增加后，对消化系统、呼吸系统和新陈代谢等等都有帮助。美国著名的医学专家古特曼博士这样预测：“谷胱甘肽很快就会像胆固醇一样，成为人们衡量健康的指标之一！”。由于谷胱甘肽在细胞内的重要作用，谷胱甘肽在医药领域中的广泛应用早已得到公认，其在食品添加剂、运动营养学、保健品和化妆品上的应用也越来越广泛。

谷胱甘肽的生产方法主要有萃取法、化学合成法、酶转化法和发酵法。自1938年发表的GSH制备的最早专利以来，国内外学者围绕GSH的生产开展了大量的研究。概括来说，萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从含有GSH的动植物组织中进行GSH的分离提取，由于原料不易获得且GSH的含量极低，因此该法的实际应用价值不大。化学合成法生产GSH，即将L一谷氨酸、L一半胱氨酸和甘氨酸缩合成GSH。该法较早用于GSH生产，但操作过程复杂、耗时且得到的GSH是左旋体和右旋体的混合物，分离十分困难，造成产品纯度不高，且生物效价很难保持一致。GSH的酶法合成是利用GSH合成酶系，在三磷酸腺苷(ATP)的存在下将三种组成氨基酸催化形成GSH。该法首先需要获得GSH合成的相关酶系，其次需要加入价格昂贵的前体氨基酸和ATP，目前还处于实验室研究阶段(国家专利申请号03113418.1)。综合比较，发酵法生产GSH最具竞争力，是当前世界上主要的生产方法，并且由于避免了昂贵的ATP消耗，比较经济实用(詹谷宇等.药学学报，1990；25(7).494-499)。由于微生物容易培养，因此该法将具有极大的应用潜力。国外谷胱甘肽的主要产地在口本，应用的是微生物发酵法生产谷胱甘肽(詹谷宇等，酵母菌生物合成谷胱甘肽，药学学报，1990；25(7))国内谷胱甘肽的研究起步较晚，现在主要还是在一些研究院校内，处于研究阶段，没有形成一定的生产规模(李寅，陈坚等.氨基酸和酵母膏对谷胱甘肽发酵的影响，中国医药工业杂志，1998；29(12)：537—542.)。饶志明等(饶志明等.产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究.食品与发酵工业，2007，33(5)：1-3)研究利用重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)x-33(pGAPZA-gsh1)生产谷胱甘肽其产量只有97.9mg/L，此法利用摇瓶在试验室进行且产量过低，在实际生产中无意义。董一群等(董一群等.补料方式对酵母菌生产谷胱甘肽的影响.工业微生物，2003，33(1)：19-21)研究了分批发酵及恒速流加、指数流加和恒pH流加补料方法。其结果为分批补料中GSH含量323.39mg/L；恒速流加中GSH含量为638.2mg/L；指数流加中GSH含量为678.9mg/L；而恒pH流加补料中GSH含量为977.8mg/L。该试验中明显GSH含量较高且采用恒pH流加补料其工艺过程易于控制有利于生产，但是其发酵周期为60小时，同时GSH含量没有显著提高。王峥，谭天伟等(王峥，谭天伟等.谷胱甘肽发酵过程中的乙醇控制.生物加工过程，2004，5(2)：64-67)研究在酿酒酵母谷胱甘肽发酵中，比较了乙醇控制在一定浓度和逐步下降两种乙醇控制方式对谷胱甘肽合成的影响，其结果为后者较好。该研究中GSH含量较高达到1620mg/L，而此法只有当乙醇形成后并达到一定的检测浓度时才可以进行控制，虽有一定的指导意义但很有限。在国家专利(专利申请号200510023119.1)“谷胱甘肽的生产方法”中指出将带有谷胱甘肽合成酶A和酶B的两种表达重组基因的基因工程大肠杆菌经大规模培养和大规模分离纯化技术，获得酶A和酶B，并将它们分别用合适的材料固定。该方法中存在以下几个不利因素：(1)基因工程菌因其稳定性差不适合规模生产；(2)大肠杆菌的培养周期较长，在工业化生产中容易染菌并延长了生产周期；(3)酶A和酶B的分离纯化也存在难度；(4)用合适的材料固定也使得生产工艺复杂化。国家专利(申请号03113418.1)“一种提高产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽产量的方法”中指出采用产朊假丝酵母(Candidautilis)WSH02-08为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在摇瓶培养或发酵罐培养，在发酵液中添加L-半胱氨酸，添加时间0-20小时，添加浓度6-10mmol/L。该方法所得最后产量为400mg/L-520mg/L。该方法虽然时间短工艺简单，但最后目标产量却较低，仍很难用于生产。国家专利(申请号200510059998.3)“酵母发酵联产麦角固醇和谷胱甘肽的方法”中利用同一种酵母发酵菌种发酵同时生产两种代谢产物-麦角固醇和谷胱甘肽。该方法在生产谷胱甘肽的情况下又得到了麦角固醇，做到了产业链的良好延伸，谷胱甘肽产量930mg/L-1561mg/L，但从GSH的产量来看结果仍不理想，并且乙醇含量的控制仍然存在滞后的问题。

发明内容本发明的目的在于提供一种工艺设计更合理、且能够提高谷胱甘肽产量的酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，包括以下步骤：

a.将斜面酿酒酵母菌种接入摇瓶种子培养基中，在28～32℃温度条件下，震荡培养10～15小时，震荡频率为100～300rpm；

b.将震荡培养的种子培养液按发酵培养基体积的10％接入发酵培养基，在温度为28～32℃、初始搅拌转速为50～150rpm、通风比为0.5～1.5VVM条件下培养6～12小时，当溶解氧低于20％～30％时，提高搅拌转速50～100rpm，使溶解氧保持在20％～30％以上；

c.按发酵培养基体积的10％接入步骤b中的种子培养液，在温度为28～32℃、初始搅拌转速为50～150rpm，之后每过2～4h增加50～150rpm直到升至500rpm，初始通气量为0.5～1VVM，当转速升至500rpm2～4h后增加至1.5～2VVM，在此条件下培养10～14h后，开始按2～6g/l.h均速加入流加培养基，流加培养基的灭菌参数为：100～110℃，10～20分钟；

当呼吸商RQ值大于0.85时，要仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速率至原流加补料速率的10％～80％，当RQ小于等于0.85时，每过1～2小时流速增加10％～50％，同时再以尿素或氨水控制发酵液的pH值在4.5～5.5之间，至28～36h向发酵液中分别添加2～6mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同时开始降温1～6℃，且同时降低流加培养基补料速度的10％～50％，经过36～48h发酵停止发酵，此时酵母的生物量干重达到98～128g/L，GSH总量稳定在1800mg/L～2470mg/L。

上述步骤a中的摇瓶种子培养基，其配方为：葡萄糖20～50g/l；酵母粉3～10g/l；(NH₄)₂HPO₄ 1～6g/l；MgSO₄·7H₂O 0.5～1.5g/l；K₂HPO₄ 0.5～2g/l；KH₂PO₄0.5～2g/l。

上述步骤b中的发酵培养基，其配方为：葡萄糖40～70g/l；酵母粉10～30g/l；麦芽汁40～80g/l；(NH₄)₂HPO₄ 5～16g/l；糖蜜20～50g/l；MgSO₄·7H₂O2～6g/l；玉米浆10～30g/l；K₂HPO₄ 0.5～2g/l；KH₂PO₄ 0.5～2g/l；ZnSO₄ 5～15mg/l；FeSO₄ 5～15mg/l；MnSO₄ 5～15mg/l；CuSO₄ 5～15mg/l。

上述步骤c中的流加培养基，其配方为：葡萄糖500～700g/l，酵母粉5～20g/l，麦芽汁40～80g/l，玉米浆3～10g/l。

本发明提供的上述酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，对培养基的配方进行了优化，在过程控制当中实时对发酵尾气进行检测分析，更超前的预测酵母细胞的代谢情况，为补料提供了更及时、更准确的指导，给出了更有利于积累谷胱甘肽的工艺技术参数。同时本发明发现在适量添加前体氨基酸的同时，降低发酵温度和流加补料的速率可以明显提高酵母中GSH的含量，此方法在发酵的后段可以节省流加补料的用量，降低生产成本。最终GSH含量可达1800mg/L以上。

具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，实施例中的酿酒酵母是以从中国工业微生物菌种保藏管理中心购买的1253热带假丝酵母为培养菌株。

实施例1

a.将摇瓶种子培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，接入斜面酿酒???酵母菌种，在28℃温度条件下，震荡培养15小时，震荡频率为100rpm，其中：摇瓶种子培养基配方为：葡萄糖50g/l；酵母粉10g/l；(NH₄)₂HPO₄ 3g/l；MgSO₄·7H₂O 1g/l；K₂HPO₄ 0.5g/l；KH₂PO₄ 0.5g/l；

b.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，将震荡培养的种子培养液按发酵培养基体积的10％接入，在温度为28℃、初始搅拌转速为100rpm、通风比为1VVM条件下培养12小时，当溶解氧低于20％时提高搅拌转速50rpm使溶解氧保持在20％以上。其中：发酵培养基配方为：葡萄糖70g/l；酵母粉10g/l；麦芽汁80g/l；(NH₄)₂HPO₄10g/l；糖蜜20g/l；MgSO₄·7H₂O4g/l；玉米浆20g/l；K₂HPO₄1g/l；KH₂PO₄ 1g/l；ZnSO₄ 10mg/l；FeSO₄ 5mg/l；MnSO₄ 5mg/l；CuSO₄ 5mg/l；

c.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，按发酵培养基体积的10％接入步骤b中的种子培养液，在温度为28℃、初始搅拌转速为100rpm，之后每过2h增加50rpm直到升至500rpm，初始通气量为1VVM，当转速升至500rpm2h后增加至2VVM，在此条件下培养14h后，开始按2g/l.h均速加入流加培养基。流加培养基的配方为：葡萄糖700g/l，酵母粉20g/l，麦芽汁80g/l，玉米浆10g/l。流加培养基的灭菌参数为：100℃，20分钟.

当呼吸商RQ值大于0.85时，要仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速率至原流加补料速率的80％。当RQ小于等于0.85时，每过1小时流速增加10％。同时再以尿素控制发酵液的pH值为4.5，至36h向发酵液中分别添加4mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同时开始降温1℃，且同时降低流加培养基补料速度的10％，至48h停止发酵，此时酵母的生物量为108g/L(干重)，GSH总量为2470mg/L。

实施例2

a.将摇瓶种子培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，接入斜面酿酒酵母菌种，在32℃温度条件下，震荡培养10小时，震荡频率为300rpm，其中：摇瓶种子培养基配方为：葡萄糖40g/l；酵母粉5g/l；(NH₄)₂HPO₄ 1g/l；MgSO₄·7H₂O 0.5g/l；K₂HPO₄2g/l；KH₂PO₄ 2g/l；

b.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，将震荡培养的种子培养液按发酵培养基体积的10％接入，在温度为32℃、初始搅拌转速为150rpm、通风比为0.5VVM条件下培养6小时，当溶解氧低于25％时提高搅拌转速150rpm使溶解氧保持在25％以上。其中：发酵培养基配方为：葡萄糖60g/l；酵母粉30g/l；麦芽汁40g/l；(NH₄)₂HPO₄5g/l；糖蜜40g/l；MgSO₄·7H₂O 2g/l；玉米浆10g/l；K₂HPO₄0.5g/l；KH₂PO₄ 0.5g/l；ZnSO₄ 5mg/l；FeSO₄ 10mg/l；MnSO₄ 15mg/l；CuSO₄ 15mg/l；

c.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，按发酵培养基体积的10％接入步骤b中的种子培养液，在温度为32℃、初始搅拌转速为150rpm，之后每过4h增加150rpm直到升至500rpm，初始通气量为0.5VVM，当转速升至500rpm4h后增加至1.5VVM，在此条件下培养10h后，开始按6g/l.h均速加入流加培养基。流加培养基的配方为：葡萄糖600g/l，酵母粉10g/l，麦芽汁60g/l，玉米浆5g/l。流加培养基的灭菌参数为：110℃，10分钟.

当呼吸商RQ值大于0.85时，仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速率至原流加补料速率的10％。当RQ小于等于0.85时，每过2小时流加补料速率增加50％。同时再以氨水控制发酵液的pH值为5.5，至28h向发酵液中分别添加6mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同时开始降温6℃，且同时降低流加培养基补料速度的50％，至36h停止发酵，此时酵母的生物量可达到98g/L(干重)，GSH总量为1895mg/L。

实施例3

a.将摇瓶种子培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，接入斜面酿酒酵母菌种，在30℃温度条件下，震荡培养12小时，震荡频率为150rpm，其中：摇瓶种子培养基配方为：葡萄糖20g/l；酵母粉3g/l；(NH₄)₂HPO₄ 6g/l；MgSO₄·7H₂O 1.5g/l；K₂HPO₄ 1g/l；KH₂PO₄ 1g/l；

b.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，将震荡培养的种子培养液按发酵培养基体积的10％接入，在温度为30℃、初始搅拌转速为50rpm、通风比为1.5VVM条件下培养8小时，当溶解氧低于30％时提高搅拌转速100rpm使溶解氧保持在30％以上。其中：发酵培养基配方为：葡萄糖40g/l；酵母粉20g/l；麦芽汁60g/l；(NH₄)₂HPO₄16g/l；糖蜜50g/l；MgSO₄·7H₂O6g/l；玉米浆30g/l；K₂HPO₄2g/l；KH₂PO₄ 2g/l；ZnSO₄ 15mg/l；FeSO₄ 15mg/l；MnSO₄10mg/l；CuSO₄ 10mg/l；

c.将发酵培养基在121℃灭菌30分钟，自然冷却至室温后，按发酵培养基体积的10％接入步骤b中的种子培养液，在温度为30℃、初始搅拌转速为50rpm，之后每过3h增加100rpm直到升至500rpm，初始通气量为0.8VVM，当转速升至500rpm 3h后增加至1.8VVM，在此条件下培养12h后，开始按4g/l.h均速加入流加培养基。流加培养基的配方为：葡萄糖500g/l，酵母粉5g/l，麦芽汁40g/l，玉米浆3g/l。流加培养基的灭菌参数为：105℃，15分钟.

当呼吸商RQ值大于0.85时，要仅以RQ为补料依据，立即降低流加补料速率至原流加补料速率的30％。当RQ小于等于0.85时，每过1.5小时流速增加30％。同时再以氨水控制发酵液的pH值为5.0，至30h向发酵液中分别添加2mmol/L的甘氨酸、L-谷氨酸和L-半胱氨酸，并同时开始降温3℃，且同时降低流加培养基补料速度的20％，至42h停止发酵，此时酵母的生物量为128g/L(干重)，GSH总量为2080mg/L。

对比实施例1

将实施例1流加培养基配方中的麦芽汁、酵母粉和玉米浆去掉，只以700g/L的葡萄糖配制补料，其它条件不变。这样导致补料以后，培养基中的营养成分逐渐单一化，不利于细胞的生长和GSH的积累，最终下罐结果为：生物量50g/L(细胞干重)，GSH含量452mg/L。

对比实施例2

在实施例2中，28h添加氨基酸后，同时降温6℃，现将降温6℃改为升温2℃，其它条件不变。由于环境温度的改变，使GSH的积累受到了严重影响，最终下罐结果为：生物量80g/L(细胞干重)，GSH含量352mg/L。

对比实施例3

在实施例3中添加氨基酸为2mmol/L，现将添加量升高为12mmol/L.改变氨基酸添加量后的最终下罐结果为：生物量75g/L(细胞干重)，GSH含量630mg/L。

对比实施例4

在实施例3中发酵至30h时，将流加补料的速率降低了20％，现将流加补料的速率升高20％，其它条件不变。最终下罐结果为：生物量65g/L(细胞干重)，GSH含量430mg/L。

Claims

1.一种酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法的步骤a中所述的摇瓶种子培养基，其配方为：葡萄糖20～50g/l；酵母粉3～10g/l；(NH₄)₂HPO₄ 1～6g/l；MgSO₄·7H₂O0.5～1.5g/l；K₂HPO₄0.5～2g/l；KH₂PO₄ 0.5～2g/l。

3.根据权利要求1所述的酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法的步骤b中所述的发酵培养基，其配方为：葡萄糖40～70g/l；酵母粉10～30g/l；麦芽汁40～80g/l；(NH₄)₂HPO₄ 5～16g/l；糖蜜20～50g/l；MgSO₄·7H₂O 2～6g/l；玉米浆10～30g/l；K₂HPO₄0.5～2g/l；KH₂PO₄0.5～2g/l；ZnSO₄ 5～15mg/l；FeSO₄ 5～15mg/l；MnSO₄ 5～15mg/l；CuSO₄ 5～15mg/l。

4.根据权利要求1所述的酿酒酵母高密度发酵生产还原性谷胱甘肽的方法，其特征在于该方法的步骤c中所述的流加培养基，其配方为：葡萄糖500～700g/l，酵母粉5～20g/l，麦芽汁40～80g/l，玉米浆3～10g/l。