CN107043797A - 一种酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了工业微生物发酵领域中一种酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺，该酿酒酵母生产谷胱甘肽发酵工艺为利用改良O‑media发酵培养基，发酵16 h时以1.5 g/L/h和0.4 g/L/h恒定速度流加糖蜜和玉米浆，在细胞密度达到一定程度后，向发酵液中添加一定量KMnO4缓释颗粒和柠檬酸钠等，发酵120 h时，发酵液中细胞湿重达到121.4 g/L，GSH积累量达到5.78 g/L，本发明通过O‑media发酵培养基改良、糖蜜和玉米浆流加，提高发酵液细胞密度；通过氧化刺激物KMnO4缓释颗粒添加，维持对酵母细胞氧化胁迫同时缓解其对酵母生长的影响；通过能量辅助物质柠檬酸钠添加，改善胞内ATP水平，最终显著改善谷胱甘肽积累量，降低生产成本。

Description

一种酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺
技术领域
本发明涉及工业微生物发酵领域，具体为一种酿酒酵母生产谷胱甘肽发酵工艺。
背景技术
谷胱甘肽（GSH），广泛存在于真核、原核生物细胞内的一种三肽抗氧化剂，由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成。由于活性巯基的存在，它可维持细胞氧化还原电位和防止活性氧（ROS）对细胞的损伤作用。另外，还可保护细胞免受紫外线、重金属以及多种外源性物质侵扰。因此，临床上常用于抗辐射、肿瘤、氧化和衰老等预防与治疗，被广泛应用于医药、保健品、食品和化妆品等领域。
GSH可以通过提取法、化学法、酶法和发酵法等途径获取, 以酶法和发酵法为主。酶促法主要是由L-谷氨酸，L-半胱氨酸、甘氨酸和ATP在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，GSHⅠ）和谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSHⅡ）催化下合成，而酶和ATP价格都很昂贵，限制了酶促合成GSH的生产应用；发酵法则是发酵液中添加L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸等前体氨基酸，利用酵母等微生物的野生型或基因工程菌将其转化成GSH，与其他方法相比具有成本低、简便易控和易放大等优点，且可直接利用微生物自身产生的ATP。因此，发酵法成为目前最重要的GSH生产方法。
发酵法生产GSH研究多集中在前体氨基酸添加、表面活性剂使用、乙醇浓度控制、葡萄糖流加等发酵条件和工艺优化。葡萄糖流加能够显著提高发酵液中细胞密度，但发酵后期，氮源和生长因子等因素限制生物量积累。通过氧化刺激对啤酒酵母发酵产谷胱甘肽影响研究发现，向发酵液中添加KMnO4或H2O2，在一定程度上可改善谷胱甘肽产量，但瞬间氧化剂的大量添加，不仅会抑制菌体生长，而且会消耗胞内谷胱甘肽用于保护细胞，进而使得谷胱甘肽产量迅速下降。另外，酵母胞内ATP水平也是限制GSH积累的因素之一。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽工艺，利用改良O-media培养基、流加糖蜜和玉米浆进行酿酒酵母补料分批发酵，添加氧化刺激物KMnO4缓释颗粒，维持对酵母细胞氧化胁迫同时缓解其对酵母生长的影响，添加能量辅助物质柠檬酸钠，改善胞内ATP水平，最终获得谷胱甘肽，本发明是这样实现的：
一种酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺，具体步骤如下：
A）从-80℃的冻存甘油管中挑取酿酒酵母（保藏号CGMCC NO. 2842，该菌种已由中国专利“一株高产腺苷蛋氨酸的菌种”，专利号“ZL200910028186.0”公开），于YPD斜面培养基上划线接菌，置于30℃恒温培养箱中倒置培养20 h；然后转接至50 mLYPD液体培养基中，于30℃，200 rpm振荡培养20 h，获得酵母菌种培养物，备用；
B）将酵母菌种培养物按体积比5%的接菌量转接到10 L发酵罐中进行发酵，发酵培养基为改良O-media发酵培养基，培养温度30℃，初始pH 6.0，溶解氧浓度为30%；
C）自步骤B）发酵开始起算，发酵16 h后，以恒定速度流向发酵罐中流加糖蜜（1.5 g/L/h）和玉米浆（0.4 g/L/h），流加72 h（即自发酵时起算，第16h开始流加，第88h时停止加入糖蜜和玉米浆）,同时保持发酵液pH5.0；
待发酵液中酿酒酵母细胞湿重达80 g/L时，加入高锰酸钾缓释颗粒，以高锰酸钾缓释颗粒中高锰酸钾计算，缓释颗粒的添加量为0.15 g/L，同时向发酵液中加入终浓度为4-8g/L的柠檬酸钠；
发酵120 h后，发酵液中细胞湿重达到121.4 g/L，GSH积累量达到5.78 g/L，结束发酵；
所述改良O-media发酵培养基：向蒸馏水中加入终浓度分别为50 g/L的葡萄糖、10 g/L的蛋白胨、5 g/L的酵母浸粉、4 g/L的磷酸二氢钾、2 g/L的磷酸氢二钾、1.5 g/L的硫酸镁、3 g/L的L-蛋氨酸、1.5 g/L的L-谷氨酸、1.2 g/L的L-半胱氨酸和1.5 g/L的甘氨酸，调节pH6.0， 115℃灭菌30 min；
YPD液体培养基：向蒸馏水中加入终浓度为20 g/L的葡萄糖、10 g/L的酵母浸粉和10g/L的蛋白胨，自然pH，115℃灭菌30 min，即得；
YPD斜面培养基：向YPD液体培养基中加入2%（质量百分数）琼脂，分装与试管中，凝固成斜面，即得。
进一步，本发明所述酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺中，步骤C）中分别以1.5g/L/h和0.4 g/L/h的速率向发酵罐中流加糖蜜和玉米浆。
进一步，本发明所述酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺中，步骤C）中保持发酵液pH 5.0，是指利用氨水保持发酵液pH 5.0。
进一步，本发明所述酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺中，步骤C）中加入柠檬酸钠的终浓度为6 g/L。
进一步，本发明所述酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺中，步骤C）所述高锰酸钾缓释颗粒是这样获得的：向双蒸水加入终浓度为10-30 g/L的KMnO4、15-30 g/L的硬脂酸、8-20 g/L的聚乙二醇及10-20 g/L的琼脂粉，配置成混合液；115℃灭菌30 min，无菌条件下将混合液用医用注射器滴入无菌的冰浴二甲基硅油中，制成粒径2.5-3 mm的颗粒，用无菌纸吸去颗粒表面的二甲基硅油，即获得所述高锰酸钾缓释颗粒。
进一步，本发明所述酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺中，步骤C）所述高锰酸钾缓释颗粒是这样获得的：向双蒸水加入终浓度为15 g/L的高锰酸钾、20 g/L的硬脂酸、20g/L的聚乙二醇及15 g/L的琼脂粉，配制成混合液；115℃灭菌30 min，无菌条件下将混合液用医用注射器滴入无菌的冰浴二甲基硅油中，制成粒径3 mm左右的颗粒，用无菌纸吸去颗粒表面的二甲基硅油，即获得所述高锰酸钾缓释颗粒。
本发明提供的高锰酸钾缓释颗粒是以硬脂酸、聚乙二醇和琼脂粉为包覆材料，使得高锰酸钾在添加到发酵液中后0-40 h间缓慢释放，起到有效维持长时间氧化刺激且缓解对酵母生长的影响，进而促进GSH的积累。
与现有技术相比，本发明通过O-media发酵培养基改良、糖蜜和玉米浆流加，提高发酵液细胞密度；以硬脂酸、聚乙二醇和琼脂粉为包覆材料，使得高锰酸钾在添加到发酵液中后0-40 h间缓慢释放，将该KMnO4缓释颗粒添加发酵液中，起到有效维持长时间氧化刺激同时缓解其对酵母生长的影响，进而促进GSH的积累；通过能量辅助物质柠檬酸钠添加，改善胞内ATP水平，最终显著改善谷胱甘肽积累量，降低生产成本。
附图说明
图1为本发明工艺流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例发酵工艺流程图（附图1），对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中涉及的培养基：
改良O-media发酵培养基：向蒸馏水中加入终浓度分别为50 g/L的葡萄糖、10 g/L的蛋白胨、5 g/L的酵母浸粉、4 g/L的磷酸二氢钾、2 g/L的磷酸氢二钾、1.5 g/L的硫酸镁、3g/L的L-蛋氨酸、1.5 g/L的L-谷氨酸、1.2 g/L的L-半胱氨酸和1.5 g/L的甘氨酸，调节pH 6.0，115℃灭菌30 min；
YPD液体培养基：向蒸馏水中加入终浓度为20 g/L的葡萄糖、10 g/L的酵母浸粉和10g/L的蛋白胨，自然pH，115℃灭菌30 min；
YPD斜面培养基：向YPD液体培养基中加入2%（质量百分数）琼脂，分装与试管中，凝固成斜面，即得；
传统O-media培养基：向蒸馏水中分别加入终浓度依次为50g/L的葡萄糖、10g/L的蛋白胨、5g/L的酵母浸粉，4g/L的磷酸二氢钾、2g/L的磷酸氢二钾、1.5g/L的硫酸镁、3g/L的L-蛋氨酸，用磷酸调pH 6.0，115℃灭菌30 min。
实施例中高锰酸钾缓释颗粒制备方法：向双蒸水中加入终浓度分别为20 g/L的硬脂酸、20 g/L的聚乙二醇、15 g/L的琼脂粉及15 g/L的KMnO4，搅拌均匀，115℃灭菌30 min，无菌条件下将混合液用注射器滴入无菌的冰浴二甲基硅油中，制成粒径3 mm的颗粒，用无菌纸吸去颗粒表面的二甲基硅油，即获得高锰酸钾缓释颗粒。
实施例中使用的酿酒酵母的保藏号为CGMCC NO.2842（该菌种已由中国专利“一株高产腺苷蛋氨酸的菌种”，专利号“ZL200910028186.0”公开）。
实施例中酵母菌种培养物是这样获得的：将酿酒酵母接种于YPD斜面培养基中，30℃倒置培养20 h；然后转接至YPD液体培养基中，30℃，200 rpm振荡培养20 h，即获得酵母菌种培养物，备用。
实施例中涉及的原料：
糖蜜购自苏州富邦化工科技有限公司；
玉米浆购自Aladdin公司。
实施例1 利用O-media培养基分批发酵实验
本实施例采用传统培养方法：
首先将酵母菌种培养物按照体积比5%接种到装有传统O-media培养基的发酵罐（10 L）中进行发酵。
发酵条件：培养温度30℃，初始pH 6.0，溶解氧浓度为30%；
自发酵时起算，发酵120 h时，检测发酵液中酿酒酵母细胞湿重达到45.9 g/L，GSH积累量达到0.47 g/L。
GSH测定方法：色谱条件：GSH测定采用HPLC法，高效液相色谱仪（岛津LC10A），反相C18 色谱柱(Hanbon Sci. & Tech)。磷酸盐缓冲溶液与甲醇以体积比9:1混合作为流动相,流量1 mL/min, 检测波长210 nm。样品制备与测定：取待测样品溶液3.0 mL,于-20℃冰柜冷冻过夜,第二天沸水浴冻融10 min,取出,以5000 rpm转速离心2 min, 取上清液作为HPLC待测样品(根据实际浓度可适当稀释)。（具体参见“发酵液中谷胱甘肽含量测定方法的比较.理化检验-化学分册”，陈龙等，2010,46: 8.）
实施例2 利用改良O-media培养基分批发酵试验
在实施例1基础上，将发酵罐中传统O-media培养基换成改良O-media培养基，其他发酵条件与实施例1相同。
发酵120 h时，检测发酵液中酿酒酵母细胞湿重达到41.5 g/L，GSH积累量达到0.83 g/L。
实施例3 糖蜜补料分批实验
对实施例2的发酵过程实时监测发酵液中的碳源浓度，发现当发酵进行16 h，葡萄糖消耗殆尽时，因此本实施例在实施例2实验的基础上，在发酵开始后16h，向发酵液中以恒定速度流加糖蜜，流加时间为72 h（即发酵开始后88h，停止流加），其他发酵条件同实施例2。
实验分三组，糖蜜的流加量分别为0.5 g/L/h、1.5 g/L/h和2.0 g/L/h，依次编号1-3，发酵进行120 h后，检测发酵液中酿酒酵母细胞湿重和GSH积累量，结果如表1所示：
表1 糖蜜补料分批实验结果
序号 细胞湿重（g/L） GSH积累量（g/L）
1 93.4 2.34
2 101.7 2.92
3 89.1 2.45
由表1可见，与0.5 g/L/h或2.0 g/L/h的糖蜜流加速度相比，1.5 g/L/h的糖蜜流加速度显著改善发酵液中生物量和GSH积累。
实施例4 玉米浆补料分批实验
在实施例3实验2（即糖蜜的流加量为1.5 g/L/h）基础上，进行玉米浆补料分批实验，在发酵开始后16 h，向发酵液中以恒定速度流加玉米浆，流加时间72 h即发酵开始后88 h，停止流加，即与糖蜜同时流加，同时停止），同时以氨水控制发酵液pH 5.0，其他发酵条件同实施例3.
实验分三组，玉米浆的流加量分别为0.2 g/L/h、0.4 g/L/h和0.6 g/L/h，依次编号1-3，待发酵进行120h后，检测发酵液中酿酒酵母细胞湿重和GSH积累量，结果如表2所示：
表2 玉米浆补料分批实验结果
序号 细胞湿重（g/L） GSH积累量（g/L）
1 119.8 3.27
2 128.4 3.57
3 115.1 3.42
由表2可见，与0.2 g/L/h和0.6 g/L/h的玉米浆流加速度相比，0.4 g/L/h的玉米浆流加速度显著改善发酵液中生物量和GSH积累。
实施例5 高锰酸钾补料实验
在实施例4实验2（即糖蜜流加量为 1.5 g/L/h，玉米浆流加量为0.4 g/L/h）基础上，在发酵液中酿酒酵母细胞湿重达80 g/L时，向发酵液中一次性添加终浓度为0.1 g/L和0.15g/L的高锰酸钾（非缓释颗粒），其他发酵条件同实施例4。
待发酵进行120 h时，检测发酵液中细胞湿重分别达到104.7 g/L和98.3 g/L，GSH积累量分别达到3.85 g/L和3.23 g/L。
可见，向发酵液中添加低浓度KMnO4（如0.1 g/L），可改善谷胱甘肽产量，但KMnO4浓度过高（如0.15 g/L），不仅会抑制菌体生长，而且会消耗胞内谷胱甘肽用于保护细胞，进而使得谷胱甘肽产量迅速下降。
实施例6 高锰酸钾缓释颗粒补料实验
在实施例4实验2（即糖蜜的流加量为1.5 g/L/h，玉米浆的流加量为0.4 g/L/h）的基础上，在细胞湿重达80 g/L时，向发酵液中一次性添加高锰酸钾缓释颗粒（添加量以高锰酸钾计，添加量为0.15 g/L），其他发酵条件同实施例4。
待发酵进行120 h时，检测发酵液中细胞湿重达到115.7 g/L，GSH积累量达到4.92 g/L。
实施例7 柠檬酸钠补料实验：
在实施例6基础上，在细胞密度达到80 g/L时，向发酵液中一次性添加柠檬酸钠，实验分三组进行，所添加的柠檬酸钠终浓度分为为4 g/L、6 g/L和8 g/L，依次编号1-3，其他发酵条件同实施例6。
待发酵进行120 h时，检测发酵液中酿酒酵母细胞湿重和GSH积累量，结果如表3所示：
表3 高锰酸钾缓释颗粒补料分批实验结果
序号 细胞湿重（g/L） GSH积累量（g/L）
1 122.3 5.48
2 121.4 5.78
3 114.7 5.21
由表3可见，柠檬酸钠是作为一种能量辅助物质添加到发酵液中。柠檬酸钠添加量为终浓度6 g/L时，显著改善发酵液中GSH积累量。
在具体的实施过程中，高锰酸钾的缓释颗粒还可以通过如下方法制备：
向双蒸水加入终浓度为10-30 g/L的高锰酸钾、15-30 g/L的硬脂酸、8-20 g/L的聚乙二醇及10-20 g/L的琼脂粉，配制成混合液；115℃灭菌30 min，无菌条件下将混合液用医用注射器滴入无菌的冰浴二甲基硅油中，获得粒径2.5-3mm的颗粒，用无菌纸吸去颗粒表面的二甲基硅油，获得高锰酸钾缓释颗粒。在上述混合液阐明的各原料范围内，均可获得本发明所述高锰酸钾缓释颗粒，实现发明之目的。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，如本实施例使用保藏号为CGMCC NO. 2842的酿酒酵母进行发酵生产，具体实施过程中也可以使用其他株系的酿酒酵母，这些修改和替换均属于本发明技术方案所保护的范围。

Claims (6)

1.一种酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺，其特征在于，具体步骤如下：
A）将酿酒酵母接种于YPD斜面培养基中，30℃倒置培养20 h；然后转接至YPD液体培养基中，30℃振荡培养20 h，获得酵母菌种培养物；
B）将酵母菌种培养物按体积比5%的接菌量转接到发酵罐中进行发酵，发酵培养基为改良O-media发酵培养基，培养温度30℃，初始pH 6.0，溶解氧浓度为30%；
C）发酵16h后，分别以1.0-2.0 g/L/h和0.2-0.6 g/L/h的速率向发酵罐中流加糖蜜和玉米浆，流加72 h，同时保持发酵液pH 5.0；
待发酵液中酿酒酵母细胞湿重达80 g/L时，加入高锰酸钾缓释颗粒以及终浓度为4-8g/L的柠檬酸钠；
以高锰酸钾计，所述高锰酸钾缓释颗粒的添加量为0.15 g/L；
发酵120 h后，结束发酵；
所述改良O-media发酵培养基：向蒸馏水中加入终浓度分别为50 g/L的葡萄糖、10 g/L的蛋白胨、5 g/L的酵母浸粉、4 g/L的磷酸二氢钾、2 g/L的磷酸氢二钾、1.5 g/L的硫酸镁、3 g/L的L-蛋氨酸、1.5 g/L的L-谷氨酸、1.2 g/L的L-半胱氨酸和1.5 g/L的甘氨酸，调节pH6.0，115℃灭菌30 min。
2.根据权利要求1所述酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺，其特征在于，步骤C）中，分别以1.5 g/L/h和0.4 g/L/h的速率向发酵罐中流加糖蜜和玉米浆。
3.根据权利要求2所述酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺，其特征在于，步骤C）中，加入终浓度为6 g/L的柠檬酸钠。
4.根据权利要求2所述酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺，其特征在于，步骤C）中保持发酵液pH 5.0，是指利用氨水保持发酵液pH 5.0。
5.根据权利要求1-4所述酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺，其特征在于，步骤C）所述高锰酸钾缓释颗粒是这样获得的：向双蒸水加入终浓度为10-30 g/L的高锰酸钾、15-30 g/L的硬脂酸、8-20 g/L的聚乙二醇及10-20 g/L的琼脂粉，配制成混合液；115℃灭菌30 min，无菌条件下将混合液用医用注射器滴入无菌的冰浴二甲基硅油中，用无菌纸吸去颗粒表面的二甲基硅油，即获得所述高锰酸钾缓释颗粒。
6.如权利要求5所述酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽的工艺，其特征在于，步骤C）所述高锰酸钾缓释颗粒是这样获得的：向双蒸水加入终浓度为15 g/L的高锰酸钾、20 g/L的硬脂酸、20 g/L的聚乙二醇及15 g/L的琼脂粉，配制成混合液；115℃灭菌30 min，无菌条件下将混合液用医用注射器滴入无菌的冰浴二甲基硅油中，用无菌纸吸去颗粒表面的二甲基硅油，即获得所述高锰酸钾缓释颗粒。
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