CN114350731A - 一种谷胱甘肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种谷胱甘肽的制备方法，包括以下步骤：(1)用低温等离子体处理酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液，使得酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44进入亚致死损伤状态，得到一次发酵菌液；(2)将步骤(1)得到的一次发酵菌液置于发酵反应器中储藏发酵，得到二次发酵菌液；(3)对步骤(2)得到的二次发酵菌液进行破碎提纯，得到谷胱甘肽。本发明通过低温等离子体产生的高活性氧对酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44进行直接胁迫，诱导酵母产生抗氧化应激，进入亚致死损伤状态，在此状态下酵母通过自身的生化调控，谷胱甘肽生产速率和产物得率均大大提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性肽的制备方法，特别涉及一种谷胱甘肽的制备方法。
背景技术
谷胱甘肽是一种广泛存在动植物、微生物细胞内的重要的生物活性三肽，具有很强的抗氧化作用。目前市场价格昂贵，主要应用在食品添加剂、美容抗衰、药物临床等方面。
我国谷胱甘肽的工业化生产仍然处于起步阶段。谷胱甘肽目前已有的工业生产方法有化学合成法、萃取法和微生物发酵法等。化学合成法是通过谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸合成谷胱甘肽，但是这种方法得到的谷胱甘肽是光学异构的混合体，而只有L-谷胱甘肽才具有抗氧化活性。化学合成得到的谷胱甘肽混合物分离十分困难，纯度不一，因此其生物效价无法保证；萃取法是从高含量谷胱甘肽的动植物组织中提取的一种方法，原料来源广泛，主要从鼠血、鼠肝、麦芽和酵母中提取。萃取法生产谷胱甘肽所使用的溶剂可以是水、有机酸溶液和烯醇等，但提取工艺复杂，产率和纯度均不高；微生物发酵法是目前谷胱甘肽工业化应用最为广泛的一类方法，是通过选育或构建谷胱甘肽合成能力强的基因工程菌和胞内本身谷胱甘肽含量高的微生物来发酵生产目标代谢产物，但是微生物发酵法通常有一个问题是转化效率低。
现有技术中主要围绕原材料和工艺流程两方面来优化增产谷胱甘肽，如通过表达枯草芽孢杆菌的谷胱甘肽合成酶基因来生产谷胱甘肽。虽然在谷胱甘肽产率上有较大提高，但是此种方法涉及分批补料来使枯草芽孢杆菌持续发酵，每次补料时添加的半胱氨酸的毒害作用均会使细菌菌体在一定程度上发生裂解。因此谷胱甘肽产率深受影响且生物安全性仍需商榷。再如通过选育新型菌种、优化培养基组成、发酵条件及提纯方法综合研发一种提高谷胱甘肽得率与纯化效果，虽然所获谷胱甘肽安全性得以保证，但是谷胱甘肽增产较低，且生产过程中控制工艺条件过多，产率随机性较高。因此，亟待开发一种更加绿色、高效、低廉且工艺简单的谷胱甘肽工业化生产工艺，解决现存产物安全性与得率无法兼得问题，实现谷胱甘肽工业生产的高效化。
发明内容
为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种谷胱甘肽的制备方法，通过低温等离子体产生的高活性氧对酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44进行直接胁迫，诱导酵母产生抗氧化应激，后进入亚致死损伤状态，在此状态下酵母通过自身的生化调控，使得谷胱甘肽生产速率和产物得率均大大提高。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种谷胱甘肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)用低温等离子体处理酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液，使得酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44进入亚致死损伤状态，得到一次发酵菌液；
(2)将步骤(1)得到的一次发酵菌液置于发酵反应器中储藏发酵，得到二次发酵菌液；
(3)对步骤(2)得到的二次发酵菌液进行破碎提纯，得到谷胱甘肽。
优选的，所述一次发酵菌液中，处于亚致死损伤状态的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44的数量占S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44总活菌数的60％～70％。
优选的，所述低温等离子体的工作电压为40～60kV，处理时间为3～7min。
优选的，所述低温等离子体的气源为无菌空气。
优选的，步骤(2)所述二次发酵菌液中，处于亚致死损伤状态的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44的数量占酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC2.44总活菌数的70％～75％。
优选的，步骤(2)所述储藏发酵，具体为：在24～30℃下发酵18～24h。
优选的，步骤(3)所述谷胱甘肽纯度为97％以上。
优选的，所述谷胱甘肽的产量为每升发酵菌液得到16.0g以上的谷胱甘肽。
优选的，步骤(3)所述破碎提纯，具体为：
a.采用酸热抽提法对二次发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC2.44破壁；
b.采用过滤膜过滤除去经a步骤破碎处理后的发酵菌液中的杂质；
c.结晶干燥浓缩液，可得最终纯度为97％谷胱甘肽成品。
优选的，步骤(1)所述酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液的制备过程如下：
接种酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44，接种量为2％～10％，发酵温度为24～28℃，发酵时间为10～24h。
本发明的原理为：
低温等离子体技术是一种低温、低价、无毒且操作简单的非热物理加工技术，本发明通过电解气体(如无菌空气)能够产生大量氧化活性物质(·OH、1O2、·O2-、H2O2等)，而这些氧化活性物质均能对酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44造成胁迫；在低温等离子体的氧化胁迫诱导形成的亚致死损伤状态下，酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44会通过调节代谢产生大量的抗氧化性物质——谷胱甘肽来进行抗性抵御。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明通过低温等离子体产生的高活性氧对酵母进行直接胁迫，诱导酵母产生抗氧化应激，后进入亚致死损伤状态。在此状态下酵母通过自身的生化调控，谷胱甘肽生产速率和产物得率均大大提高。
(2)本发明的低温等离子体产生的高活性氧干净清洁且具有时效性，终产物中不会残留大量活性氧，不会带入杂质或其他毒害物质，因此产物生物安全性能够得到保证；此外，低温等离子体所需原料廉价且来源广泛，大大降低了生产成本。
(3)本发明操作工艺大大简化，相比于目前谷胱甘肽工业生产方法，无需进行分子层面的精细操作或者工艺参数优化的繁琐操作，节约了成本和时间，有利于大规模生产。
(4)本发明的低温等离子体产生的等离子体对酵母细胞壁表面的蚀刻作用，既有利于酵母受到氧化胁迫进入亚致死损伤状态，又有利于后续谷胱甘肽的提纯工艺—酵母细胞壁的破碎，提高了整体工艺生产的效率。
附图说明
图1为本发明的实施例的谷胱甘肽的制备流程。
图2为本发明的实施例的一次发酵菌液及二次发酵菌液中的酿酒酵母S.cerevisiae L5267的亚致死损伤状态比例柱状图。
图3为本发明的实施例通过低温等离子体胁迫诱导发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44进入亚致死损伤状态后生产谷胱甘肽产量柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44购于广东省微生物菌种保藏中心。
本实施例的谷胱甘肽的制备流程如图1所示。
首先制备酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液：进补15L发酵菌液于30L发酵罐中，随后接种酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44，接种量为10％，发酵温度为25℃，发酵时间为18h。
用低温等离子体(工作电压40kV，气源为无菌空气)处理酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液3min，处理后发酵菌液中酿酒酵母进入亚致死损伤状态比例为62.3％，此菌液记为一次发酵菌液。随后，将一次发酵菌液置于发酵反应器中继续储藏发酵18h，发酵温度为25℃，此发酵菌液中酿酒酵母进入亚致死损伤状态比例为65.7％，此得到菌液记为二次发酵菌液。最后，将得到的二次发酵菌液进行工业化破碎提纯。本工艺使用酸热抽提法对二次发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44破壁，随后将破壁发酵菌液进行膜过滤除去发酵菌液中的杂蛋白、菌渣等杂质，最后对所得浓缩液结晶干燥，得到纯度为97％以上的谷胱甘肽的产量为21.2g/L(即每升发酵菌液得到的谷胱甘肽质量)。
本实施例中的一次发酵菌液及二次发酵菌液中的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44的亚致死损伤状态比例(即处于亚致死损伤状态的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44的数量占酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44总活菌数的百分比)见图2。
为了说明本发明的效果，进行以下对比实验：
将本实施例制备的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液不经低温等离子体处理直接置于发酵反应器中储藏发酵18h，发酵温度为25℃，其发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44的亚致死损伤状态比例为15.8％，见图2(图2中对照组发酵菌液)。最后，将得到的发酵菌液进行工业化破碎提纯，得到谷胱甘肽产量为16.4g/L。
结果表明，与未经低温等离子体处理的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC2.44发酵菌液相比，经过低温等离子高氧化胁迫(40kV，3min)诱导形成高亚致死损伤比例的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液在二次发酵之后发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44生产谷胱甘肽产率提高了29.3％。
与未经低温等离子体处理的酿酒酵母发酵菌液相比，经低温等离子体处理并经后续二次发酵谷胱甘肽产率提高方式计算方法如下：
注：ma：指未经低温等离子体处理发酵菌液中谷胱甘肽产量，g/L；
mb：指经低温等离子体处理并二次发酵菌液中谷胱甘肽产量，g/L。
实施例2
本实施例的酿酒酵母S.cerevisiae L5267购于S.cerevisiaeHansenGDMCC2.44购于广东省微生物菌种保藏中心。
首先制备酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液：进补15L发酵菌液于30L发酵罐中，随后接种酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44，接种量为8％，发酵温度为28℃，发酵时间为20h。
用低温等离子体(工作电压50kV，气源为无菌空气)处理酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液5min，处理后发酵菌液中酿酒酵母进入亚致死损伤状态比例为66.4％，此菌液记为一次发酵菌液。随后，将一次发酵菌液置于发酵反应器中继续储藏发酵20h，发酵温度为28℃，此发酵菌液中酿酒酵母进入亚致死损伤状态比例为73.4％，此得到菌液记为二次发酵菌液。最后，将得到的二次发酵菌液进行工业化破碎提纯。本工艺使用酸热抽提法对发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44破壁，将破壁发酵菌液进行膜过滤除去发酵菌液中的杂蛋白、菌渣等杂质，最后对所得浓缩液结晶干燥，得到谷胱甘肽纯度为97％以上的谷胱甘肽23.9g/L。
本实施例中的一次发酵菌液及二次发酵菌液中的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44的亚致死损伤状态比例见图2。
将本实施例制备的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液不经低温等离子体处理直接置于发酵反应器中储藏发酵20h，发酵温度为28℃，其发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44的亚致死损伤状态比例为13.8％，见图2(如图2中对照组发酵菌液)。最后，将得到的发酵菌液进行工业化破碎提纯，得到谷胱甘肽产量为17.1g/L。
结果表明，与未经低温等离子体处理的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC2.44发酵菌液相比，经过低温等离子高氧化胁迫(50kV，5min)诱导形成高亚致死损伤比例的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液在二次发酵之后发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44生产谷胱甘肽产率提高了39.8％。
实施例3
本实施例的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44购于广东省微生物菌种保藏中心。
首先制备酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液：进补15L发酵菌液于30L发酵罐中，随后接种酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44，接种量为6％，发酵温度为26℃，发酵时间为24h。
用低温等离子体(工作电压60kV，气源为无菌空气)处理酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液7min，处理后发酵菌液中酿酒酵母进入亚致死损伤状态比例为65.3％，此菌液记为一次发酵菌液。随后，将一次发酵菌液置于发酵反应器中继续储藏发酵24h，发酵温度为26℃，此发酵菌液中酿酒酵母进入亚致死损伤状态比例为70.1％，此得到菌液记为二次发酵菌液。最后，将得到的二次发酵菌液进行工业化破碎提纯。本工艺使用酸热抽提法对发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44破壁，将破壁发酵菌液进行膜过滤除去发酵菌液中的杂蛋白、菌渣等杂质，最后对所得浓缩液结晶干燥，得到谷胱甘肽纯度为97％以上的谷胱甘肽20.5g/L。
本实施例中的一次发酵菌液及二次发酵菌液中的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44的亚致死损伤状态比例见图2。
将本实施例制备的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液不经低温等离子体处理直接置于发酵反应器中储藏发酵24h，发酵温度为26℃，其发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44的亚致死损伤状态比例为14.7％，见图2(如图2中对照组发酵菌液)。最后，将得到的发酵菌液进行工业化破碎提纯，得到谷胱甘肽产量为16.0g/L。
结果表明，与未经低温等离子体处理的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC2.44发酵菌液相比，经过低温等离子高氧化胁迫(60kV，7min)诱导形成高亚致死损伤比例的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液在二次发酵之后发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44生产谷胱甘肽产率提高了28.1％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用低温等离子体处理酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液，使得酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44进入亚致死损伤状态，得到一次发酵菌液；
(2)将步骤(1)得到的一次发酵菌液置于发酵反应器中储藏发酵，得到二次发酵菌液；
(3)对步骤(2)得到的二次发酵菌液进行破碎提纯，得到谷胱甘肽。
2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，所述一次发酵菌液中，处于亚致死损伤状态的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44的数量占S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44总活菌数的60％～70％。
3.根据权利要求1或2所述的谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，所述低温等离子体的工作电压为40～60kV，处理时间为3～7min。
4.根据权利要求3所述的谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，所述低温等离子体的气源为无菌空气。
5.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述二次发酵菌液中，处于亚致死损伤状态的酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44的数量占酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44总活菌数的70％～75％。
6.根据权利要求1或5所述的谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述储藏发酵，具体为：在24～30℃下发酵18～24h。
7.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述谷胱甘肽纯度为97％以上。
8.根据权利要求7所述的谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，所述谷胱甘肽的产量为每升发酵菌液得到16.0g以上的谷胱甘肽。
9.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述破碎提纯，具体为：
a.采用酸热抽提法对二次发酵菌液中酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44破壁；
b.采用过滤膜过滤除去经a步骤破碎处理后的发酵菌液中的杂质，得到浓缩液；
c.结晶干燥浓缩液，得到谷胱甘肽。
10.根据权利要求1所述的谷胱甘肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44发酵菌液的制备过程如下：
接种酿酒酵母S.cerevisiaeHansenGDMCC 2.44，接种量为2％～10％，发酵温度为24～28℃，发酵时间为10～24h。
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