CN103205401A - 一种基于低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法 - Google Patents
一种基于低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明利用大气压低温等离子体发生装置制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，属于低温等离子体技术应用领域，其特征在于，依次含有以下步骤：培养酵母细胞、选择大气压低温等离子体发生装置的种类并设定工作参数，用大气压低温等离子体处理所述酵母细胞悬液，提取经过等离子体处理的酵母细胞的活性物质。本发明具有高效、方便改变酵母细胞内酶活性的优点。可作为日用品添加剂，起抗紫外、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用；本发明由于采取微生物发酵生产，不受环境和自然资源的影响，易实现工业化、自动化，工艺方法的生产成本低、简便、稳定、易调控、成功率高；本发明适合多种规模的企业投资。
Description
技术领域
本发明利用大气压低温等离子体发生装置制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，属于低温等离子体技术应用领域。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母或者出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，在传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，也是制作培养基中常用成分酵母提取物的主要原料，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酵母是单细胞微生物，却有着真核细胞的基本结构和功能。酵母由细胞壁、细胞膜、细胞核和细胞质组成。其中蛋白质含量为40％-60％，其蛋白质水解产物包括人体必需的八种氨基酸。除蛋白质外，细胞中还含有丰富的酶系、矿物质、脂肪、糖类、多磷酸、多种B族维生素和维生素D，并且具有许多经济价值很高的生理活性物质和生化试剂，如辅酶A、辅酶Q、细胞色素C、凝血质、麦角固醇、谷耽甘肤和核酸等。通过菌种选育，使酵母富含某种目的产物，大量培养细胞，再从酵母细胞出发，提取有重要经济价值的生物产品，成为酵母利用的重要分支。
活酵母细胞衍生物(Live Yeast Cell Derivative，即LYCD)是酵母活细胞对有控制伤害反应的产物，这样的伤害刺激细胞产生一些能够增加细胞呼吸且促进修复作用的未知因子，LYCD。传统的LYCD可以从经紫外照射培养后酵母细胞中提取。即将酿酒酵母置于286nm的紫外辐射之下，经可控制伤害培养，诱导酵母细胞产生。也可把亚致死剂量的过氧化氢加入到酵母细胞中，用同样的提取过程制备LYCD。LYCD是一种十分复杂的低分子量物质，由氨基酸、单糖和双糖以及酵母特有的痕量维生素和矿物质组成。而传统方法难以实现LYCD的大量生产，并且其制备方法繁琐、费时、费力、对人体有毒害作用。本发明采用了一种物理技术——大气压低温等离子体具有易操作、加工速度快、处理效果好、环境污染小、节能等优点，可以很好的解决传统方法的弊端。
大气压低温等离子体是指在大气压(常压)条件下产生的整体温度较低的等离子体。大气压低温等离子体成分复杂，它是气体在强电场作用下电离而产生一种高度电离的气体云，由电子、多种离子、原子、分子、活性自由基及臭氧03、紫外UV等组成。根据温度和内部的热力学平衡性，可以将等离子体分为高温(热力学平衡态)和低温(热力学非平衡态)等离子体。高温等离子体是指离子与电子温度相同，整体处于热力学平衡状态，体系温度很高(5000——20000K)的等离子体。低温等离子体是指离子温度(300-500K)远远低于电子温度(10000K)的等离子体，这时系统处于热力学非平衡态，表观温度低，因此称为低温等离子体。目前，低压低温等离子体已经在工业领域有了很多成熟的应用，改变了一些行业的生产模式。近年来，大气压强条件下产生低温等离子体技术的实现，使等离子体在杀菌、凝血、抑制肿瘤、治疗皮肤病等生物医学领域的研究取得不少成果。
本发明利用大气压低温等离子体发生装置制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，属于低温等离子体技术应用领域。该法具有高效、方便增加酵母细胞内活性物质的优点。其制备产物可作为日用品添加剂，起抗紫外、抗氧化、抗老化、保鲜、杀菌、消炎等作用；并且本发明由于采取微生物发酵生产，不受环境和自然资源影响，易实现工业化、自动化；本发明工艺方法的生产成本低，工艺简便、稳定、易调控、成功率高；本发明适合多种规模的企业投资。
发明内容
为了克服传统利用紫外和过氧化氢诱导产生酵母活性提取物方法的不足，本发明提供了一种基于低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法。本发明利用低剂量的低温等离子体处理酵母细胞悬液，再经破除细胞壁、破除细胞膜提取酵母的活性物质。所采用的低温等离子体可高效诱导产生大量的高活性抗氧化、抗紫外物质，并且其操作工艺具有易操作、加工速度快、处理效果好、环境污染小、节能等优点。
为实现上述目的本发明采用的技术方案如下：
一种基于低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于，依次按以下步骤进行：
1.1酿酒酵母菌株的选择和培养
所用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为Saccharomyces cerevisiae4741MAT a野生型，及其超氧化物歧化酶1(SOD1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)的过表达突变株p-Sod1，p-Sod2。
具体培养方法如下：
1.1.1酵母培养基YAPD的配制
YPAD(YEPD+adenine)的成分为：10g酵母提取物(Yeast extract)，20g蛋白胨(Peptone)，120mg腺嘌呤(Adenine)，20g琼脂粉(固体培养基时使用)，加ddH2O定容至1L。灭菌后加50ml已灭菌的40％葡萄糖。
1.1.2斜面酵母细胞培养
将保藏的酵母菌株接种于YPAD斜面培养基，于30℃恒温、培养36-48小时，得到一级菌种；
1.1.3酵母细胞悬液的制备
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；液体摇瓶培养基：10g酵母提取物(Yeast extract)，20g蛋白胨(Peptone)，120mg腺嘌呤(Adenine)，50ml已灭菌的40％葡萄糖，蒸馏水定容至1L；在大于100ml三角瓶中加入30～50％三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度30℃，转速100～200rpm，过夜培养，即得到酵母细胞悬液；
1.1.4酵母细胞悬液的活化
将过夜培养的酵母细胞悬液以1∶100的比例接种于YPAD液体培养基中，在大于100ml的三角瓶中培养1-2小时，温度30℃，转速200rpm，使其OD值在0.8-1.0，即得到活化的酵母细胞悬液。
1.2低温等离子体处理酵母细胞悬液
将低温等离子体的喷嘴没入装有5ml酵母细胞悬液的50ml的离心管的液面以下，通入工作气体，然后打开放电装置，放电处理1-5分钟让装置产生的等离子体与水接触，进而对溶液中的酵母细胞进行作用。
1.3酵母细胞活性物质的提取
将经过等离子体处理后的酵母细胞悬液离心收集，然后破除细胞壁，破除细胞膜，离心取上清即为酵母细胞的活性物质，置于-70℃保存。
1.4酵母细胞提取物活性的检测
将经过等离子体处理过的酵母细胞的活性提取物，利用GSH和GSSG检测试剂盒、过氧化氢酶检测试剂盒、CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒(WST法)检测酵母活性提取物中抗氧化物的活性。
所述的一种基于低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于：步骤1.2中，所述的工作气体选自氩气、氦气、空气中的一种或氦气/氩气与氧气两种气体以任意比例的混合气体。
所述的一种基于低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于：步骤1.2中，所述的等离子体为非平衡等离子体或低温等离子体；所述放电形式选自辉光放电、电晕放电、介质阻挡放电、射频放电、滑动电弧放电、射流放电中的一种。
所述的一种基于低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于：步骤1.3中，所述的酵母细胞的破除细胞壁的方法选自碱破壁法、外加葡聚糖酶法、表面活性剂处理法、酸碱处理法、外加蛋白酶破壁法、盐法破壁、高压均浆法、超声波法气、微波加热法挤压式破壁法、冻融法、有机溶剂法中的一种。
本发明采用低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，利用低剂量的低温等离子体处理酵母细胞悬液，再经破除细胞壁、破除细胞膜提取酵母的活性物质。其中，物理变化包括：高能低温等离子体中的紫外辐射诱导胞内产生大量的抗紫外活性物质；化学反应包括：等离子体的活性粒子在酵母细胞内形成了大量活性氧自由基，诱导其胞内产生大量的抗氧化活性物质。本发明由于采取微生物发酵生产，不受环境和自然资源影响，易实现工业化、自动化，工艺生产成本低、简便、稳定、易调控、成功率高。并且本发明具有高效、方便以及不会引发活性物质变性的优点，可以达到提高抗氧化物酶活性的效果。
附图说明
图1为本发明经过低温等离子体处理野生型酿酒酵母细胞后，其提取物中超氧化物歧化酶SOD与过氧化氢酶CAT的酶活。
具体实施方式
实现本发明方法的步骤如下：
1.酵母细胞悬液的准备
利用YPAD酵母培养基，培养获得酿酒酵母4741野生型以及p-Sod1、p-Sod2胞内过表达重要抗氧化酶超氧化物歧化酶1、超氧化物歧化酶2的酵母细胞悬液。
2.选择低温等离子体发生器的种类并设定工作参数
本发明使用的大气压低温等离子体发生器为采用大气压辉光放电低温等离子体发生器。根据需要大气压冷等离子体发生器也可以采用电晕放电、介质阻挡放电、射频放电、滑动电弧放电、射流放电中的一种代替。需要产生大气压辉光放电低温等离子体时，放电气体可以采用氩气、氦气、空气中的一种或氦气/氩气与氧气两种气体以任何比例混合形成的混合气的一种，气流量为3-5slpm(标准升每分钟)，外加电压有效值为400-600V，电流为30mA。
3.低温等离子体处理酵母细胞悬液
将低温等离子体的喷嘴没入装有5ml酵母细胞悬液的50ml的离心管的液面以下，通入工作气体，然后打开放电装置，放电处理1-5分钟让装置产生的等离子体与水接触，进而对溶液中的酵母细胞进行作用。
4.经过低温等离子体处理后酵母细胞活性物质的提取
将经过等离子体处理后的酵母细胞悬液离心收集，然后破除细胞壁，破除细胞膜，离心取上清即为酵母细胞的活性物质，置于-70℃保存。
5.经过低温等离子体处理后酵母细胞提取物的活性检测
根据活性物质的特性使用对应的方法测量经过等离子体处理后活性物质的浓度以及活性处理后待检测酵母活性提取物需在4℃环境中保存。
以下结合大气压辉光放电低温等离子体发生器处理野生型酿酒酵母细胞4741的实验过程详细叙述本发明的具体实施方法。
实施例1：
1.前一天晚上，挑取野生型酿酒酵母细胞4741MAT a的保存菌液0.5ml-1ml，分别于约10ml，YPAD培养基(glucose2％，含或不含G418100ug/ml)中过夜培养，使之后检测的OD达到1.5左右。
2.按测得的OD值，用新鲜培养基稀释菌液，稀释比例为(菌液∶新鲜培养基＝0.2∶(OD-O.2))，再放入摇床中培养一个小时。此时菌液OD值将为1.0左右，为对数生长期。
3.取50ml离心管，向每个离心管加入4ml水。1个小时后，OD为0.5左右时，每个菌株取3ml菌液，装入5ml离心管中离心，1000rpm，5min。取出离心管，弃上清，用3ml水重悬菌体，混匀后分别加入3个50ml离心管中，形成1ml菌液-----5ml水的体系。
4.取出菌液准备低温等离子体作用。等离子体装置工作参数：气源为He+O2(2％volume)，气体流速为2slm，工作电流和电压分别为30mA和560V。将50ml离心管插到等离子体笔下方，笔头没入液面，开始计时。处理时间分别为0min，lmin，2min，3min，4min，5min。
5.1000rpm，5min离心收集酵母细胞。利用坡壁酶Lyticase置于温箱30℃孵育60min后，4000rpm，5min收集破壁后的酵母细胞。
6.将上述细胞用手指把细胞用力弹散。加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清即为经过低温等离子体诱导的酵母活性提取物。
7.对大气压低温等离子体发生器处理后的酵母提取物的活性进行检测，检测方法如下：
(1)酶量的测定(蛋白浓度的测定)
BCA法，配制不同浓度梯度的标准蛋白溶液，然后绘制标准蛋白曲线。根据标准蛋白曲线求得酵母活性提取物的蛋白浓度。
(2)GSH和GSSG含量的测定
通过谷胱甘肽还原酶把GSSG还原成GSH，而GSH可以和生色底物DTNB反应产生黄色的TNB和GSSG。适当配制反应体系，前后两个反应合并起来后，总谷胱甘肽(GSSG+GSH)就相当于一个颜色产生的限速因素，总谷胱甘肽的量就决定了黄色的TNB形成量。从而通过测定A412就可以计算出总谷胱甘肽的量。用适当试剂先清除样品中的GSH，然后利用上述反应原理就可以测定出GSSG的含量。用总谷胱甘肽(GSSG+GSH)的量扣除GSSG的含量，就可以计算出GSH的含量。利用标准物质求出标准曲线，然后求得酵母活性提取物中的GSH与GSSG的含量。
(3)过氧化氢酶CAT活性检测
在过氧化氢相对比较充足的情况下，过氧化氢酶可以催化过氧化氢产生水和氧气。残余的过氧化氢在过氧化物酶(Peroxidase)的催化下可以氧化生色底物，产生红色的产物(N-(4-antipyryl)-3-chloro-5-sulfonate-pbenzoquinonemonoimine)，最大吸收波长为520nm。用过氧化氢标准品，制作标准曲线，这样就可以计算出样品中的过氧化氢酶在单位时间单位体积内催化了多少量的过氧化氢转变为水和氧气，从而可以求得酵母活性提取物中过氧化氢酶的酶活力。
(4)CuZn/Mn-SOD活性检测
WST-12-(4-Iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2，4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium，monosodiumsalt。参考下图，WST-1可以和黄嘌呤氧化酶催化产生的超氧化物阴离子反应产生水溶性的甲臜染料(formazan dye)，该反应步骤可以被SOD所抑制。通过对WST-1产物的比色分析即可求得酵母活性提取物中SOD的酶活力。
经等离子体处理后的酵母活性提取物中的抗氧化物成分超氧化物歧化酶SOD(图1A)与过氧化氢酶CAT(图1B)的酶活性随着等离子体处理时间的增加显著提高。说明本发明所采用的低温等离子体技术可以高效诱导胞内抗氧化物质的产生。
以上所述，仅是本发明实施例之一，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是根据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均乃属于本发明技术方案的范围内。
Claims (4)
1.一种基于低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于，依次按以下步骤进行：
1.1酿酒酵母菌株的选择和培养
所用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为Saccharomyces cerevisiae4741MAT a野生型，及其超氧化物歧化酶1(SOD1)和超氧化物歧化酶2(SOD2)的过表达突变株p-Sod1，p-Sod2。
具体培养方法如下：
1.1.1酵母培养基YAPD的配制
YPAD(YEPD+adenine)的成分为：10g酵母提取物(Yeast extract)，20g蛋白胨(Peptone)，120mg腺嘌呤(Adenine)，20g琼脂粉(固体培养基时使用)，加ddH2O定容至1L。灭菌后加50ml已灭菌的40％葡萄糖。
1.1.2斜面酵母细胞培养
将保藏的酵母菌株接种于YPAD斜面培养基，于30℃恒温、培养36-48小时，得到一级菌种；
1.1.3酵母细胞悬液的制备
将一级菌种接种至液体摇瓶培养基培养；液体摇瓶培养基：10g酵母提取物(Yeast extract)，20g蛋白胨(Peptone)，120mg腺嘌呤(Adenine)，50ml已灭菌的40％葡萄糖，蒸馏水定容至1L；在大于100ml三角瓶中加入30～50％三角瓶体积的液体培养基，每个三角瓶接种1～3支斜面菌种，接种后置于全温振荡培养箱，温度30℃、转速100～200rpm，过夜培养，即得到酵母细胞悬液；
1.1.4酵母细胞悬液的活化
将过夜培养的酵母细胞悬液以1∶100的比列接种于YPAD液体培养基中，在大于100ml的三角瓶中培养1-2小时，温度30℃、转速200rpm，使其OD值在0.8-1.0，即得到活化的酵母细胞悬液。
1.2低温等离子体处理酵母细胞悬液
将低温等离子体的喷嘴没入装有5ml酵母细胞悬液的50ml的离心管的液面以下，通入工作气体，然后打开放电装置，放电处理1-5分钟让装置产生的等离子体与水接触，进而对溶液中的酵母细胞进行作用。
1.3酵母细胞活性物质的提取
将经过等离子体处理后的酵母细胞悬液离心收集，然后破除细胞壁，破除细胞膜，离心取上消即为酵母细胞的活性物质，置于-70℃保存。
1.4酵母细胞提取物活性的检测
将经过等离子体处理过的酵母细胞的活性提取物，利用GSH和GSSG检测试剂盒、过氧化氢酶检测试剂盒、CuZn/Mn-SOD活性检测试剂盒(WST法)检测酵母活性提取物中抗氧化物的活性。
2.根据权利要求1所述的一种基于低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于：步骤1.2中，所述的工作气体选自氩气、氦气、空气中的一种或氦气/氩气与氧气两种气体以任意比例的混合气体。
3.根据权利要求1所述的一种基于低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于：步骤1.2中，所述的等离子体为非平衡等离子体或低温等离子体；所述放电形式选自辉光放电、电晕放电、介质阻挡放电、射频放电、滑动电弧放电、射流放电中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种基于低温等离子体制备抗氧化、抗紫外的酵母活性提取物的方法，其特征在于：步骤1.3中，所述的酵母细胞的破除细胞壁的方法选自碱破壁法、外加葡聚糖酶法、表面活性剂处理法、酸碱处理法、外加蛋白酶破壁法、盐法破壁、高压均浆法、超声波法气、微波加热法挤压式破壁法、冻融法、有机溶剂法中的一种。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130717 |