CN113842347A - 具有抗衰老和美白活性的墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶解后发酵物的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及具有抗衰老和美白活性的墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶解后发酵物的组合物。本发明对适合于墨红玫瑰发酵的菌种进行了筛选，发现墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶解后发酵物增加酪氨酸酶活性抑制率具有协同作用，获得了具有抗衰老和美白活性的组合物及产品。

Description

具有抗衰老和美白活性的墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶 解后发酵物的组合物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及具有抗衰老和美白活性的墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶解后发酵物的组合物。
背景技术
墨红玫瑰(Rose chinensis Jacq“Crimsin Glory”H.T.,)属于蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)的落叶灌木。原产地是中国，栽培历史悠久，墨红玫瑰除了具有观赏和文化价值以外，还具有食用和药用功能。作为药食同源的中药材，新鲜玫瑰花或者干花泡茶饮用，具有清热解毒、润肠通便、调经活血、促进代谢等独特功能，玫瑰花还应用于临床药品和部分保健品中。墨红玫瑰提取物在化妆品中的主要作用是抗氧化、美白祛斑以及促进皮肤渗透，能消除自由基，同时有很强的渗透力，帮助其他营养成分被皮肤吸收；有一定的酪氨酸酶抑制作用，可辅助美白。由于其气味清香，在化妆品中常用于香精香料的配制。
玫瑰花活性物质繁多，含有维生素、蛋白质、氨基酸、挥发油、色素、多酚、黄酮和微量元素等。目前，对墨红玫瑰中有效成分的提取主要是醇回流提取技术、超声波提取技术以及用解吸-热提两步法等物理和化学提取手段，但容易导致活性成分丧失活性。
因此，利用微生物发酵技术对活性成分进行提取，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了具有抗衰老和美白活性的墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶解后发酵物的组合物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了组合物，包括墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶解后发酵物；
所述墨红玫瑰酶解后发酵物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取酶与墨红玫瑰干粉混合后，酶解，离心收集上清，制得墨红玫瑰酶解物；
步骤2：发酵菌种的选择；所述发酵菌种包括乳酸菌和酵母菌；
步骤3：发酵菌种的活化；
酵母菌：将菌种接种于YPD培养基中，于30℃恒温培养36-48h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×107CFU/mL以上；
乳酸菌：将菌种接种于MRS培养基中，于35℃恒温培养24h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×108CFU/mL以上；
步骤4：墨红玫瑰酶解后发酵：
取所述墨红玫瑰酶解物接入活化后的乳酸菌，混匀，置于37℃的培养箱中，发酵7d后，接种酵母菌，发酵7d后，离心，收集上清，得到所述墨红玫瑰酶解后发酵物；所述墨红玫瑰灵芝发酵物的制备方法包括：
步骤1：取灵芝菌种在MEA培养基中活化，获得活化后的灵芝；
步骤2：取墨红玫瑰干花灭菌后，接入步骤1所述活化后的灵芝，培养、醇提，获得所述墨红玫瑰灵芝发酵物。
在本发明的一些具体实施方案中，所述墨红玫瑰酶解后发酵物的制备方法，步骤1中所述酶包括果胶酶和纤维素酶，所述果胶酶和所述纤维素酶的重量比为1:1；所述果胶酶的酶活包括：2500U/mL；所述纤维素酶的酶活包括：3000U/mL。
在本发明的一些具体实施方案中，所述墨红玫瑰酶解后发酵物的制备方法，步骤2中，
乳酸菌包括：植物乳杆菌(保藏编号为CCTCC No：M20191045的植物乳杆菌Picp-2；
酵母菌包括：保藏编号为CCTCC No：M20191046的单胞酿酒酵母菌ZLG-6。
在本发明的一些具体实施方案中，所述墨红玫瑰酶解后发酵物的制备方法，步骤3中，所述发酵菌种的活化具体为：
酵母菌：将菌种接种于YPD培养基中，于30℃恒温培养36～48h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×107CFU/mL以上；
乳酸菌：将菌种接种于MRS培养基中，于35℃恒温培养24h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×108CFU/mL以上。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4中，
墨红玫瑰酶解后发酵具体包括：取所述墨红玫瑰酶解物按接种量5％(v/v)的比例接入活化后的乳酸菌，混匀，置于37℃的培养箱中，发酵7d后，按照1％(v/v)比例接种酵母菌，发酵7天后，9 000r/min离心15min，收集上清，得到所述墨红玫瑰酶解后发酵物。在本发明的一些具体实施方案中，所述墨红玫瑰灵芝发酵物的制备方法的步骤1中所述MEA培养基包括麦芽提取物1.2％，琼脂2％，葡萄糖1％，余量为蒸馏水；所述活化的温度为25～28℃，所述活化的时间为5～7d。
在本发明的一些具体实施方案中，所述墨红玫瑰灵芝发酵物的制备方法的步骤2中，以g/mL计，所述墨红玫瑰干花与所述活化后的灵芝的重量体积比为(2～5):10；所述灭菌为121℃灭菌4～6h；
所述墨红玫瑰灵芝发酵物的制备方法的步骤2中，所述培养的温度为25～28℃，所述培养的时间为7～14d。
在本发明的一些具体实施方案中，所述墨红玫瑰灵芝发酵物的制备方法的步骤2中，所述醇提采用乙醇，培养后的墨红玫瑰与乙醇的重量比为1:(20～30)；乙醇浓度为60～90％，所述醇提的温度为70～90℃，所述醇提的时间为3～5h。。
在本发明的一些具体实施方案中，以g/mL计，所述墨红玫瑰灵芝发酵物和所述墨红玫瑰酶解后发酵物的重量体积比为1:(0.5～1)。
基于上述研究，本发明还提供了所述的组合物在制备抗衰老和/或美白的产品中的应用。
在本发明中，抗衰老和/或美白的产品不局限于化妆品、保健品或药物。凡是可接受的产品形式，均在本发明的保护范围之内。
本发明对适合于墨红玫瑰发酵的菌种进行了筛选，墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶解后发酵物的在增加酪氨酸酶活性抑制率这块的协同作用，获得了具有抗衰老和美白活性的组合物及产品。
具体实施方式
本发明公开了具有抗衰老和美白活性的墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶解后发酵物的组合物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的具有抗衰老和美白活性的墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶解后发酵物的组合物中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例墨红玫瑰灵芝发酵物
灵芝菌种活化
灵芝菌种来自中国普通微生物菌株保藏中心(CGMCC 5.1817)，28℃条件下将灵芝菌种在MEA(麦芽提取物1.2％，琼脂2％，葡萄糖1％)培养基中培养7天进行菌种活化。
墨红玫瑰灵芝发酵物的制备
取6g墨红玫瑰干花装于9*9cm的平皿中，121℃灭菌4小时后接入已经活化好的灵芝，接种量为10毫升，于28℃培养7-14天。培养后的墨红玫瑰与乙醇的重量比为1:20；乙醇浓度为60％，所述醇提的温度为70℃，所述醇提的时间为3h。
墨红玫瑰酶解后发酵物的制备
(1)、墨红玫瑰酶解
粗酶液体(果胶酶和纤维素酶1:1；果胶酶酶活：2500U/mL；纤维素酶酶活：3000U/mL)：墨红玫瑰干粉＝20:1的比例，50℃提取3小时，9 000r/min离心15min，取上清用于指标检测。
(2)、墨红玫瑰酶解后发酵物的制备
发酵菌种选择与活化
a)发酵菌种选择
乳酸菌：植物乳杆菌(保藏编号为CCTCC No：M20191045的植物乳杆菌Picp-2
酵母菌：保藏编号为CCTCC No：M20191046的单胞酿酒酵母菌ZLG-6
b)发酵菌种活化
酵母菌：将菌种接种于YPD培养基中，于30℃恒温培养36-48h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×107CFU/mL以上。
乳酸菌：将菌种接种于MRS培养基中，于35℃恒温培养24h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×108CFU/mL以上。
c)墨红玫瑰酶解后发酵
墨红玫瑰酶解物分装在250mL的蓝盖试剂瓶中(200mL/瓶)，灭菌后(115℃，30min)准备发酵。首先按接种量5％(v/v)的比例接入活化好的乳酸菌菌种，混匀，置于37℃的培养箱中，发酵7d后按照1％(v/v)比例接种酵母菌，发酵7天后，9 000r/min离心15min得到玫瑰花发酵物用于指标检测。
4.墨红玫瑰酶解后发酵物与墨红玫瑰灵芝发酵物不同比例混合
(1)100％墨红玫瑰灵芝发酵物；(2)100％墨红玫瑰酶解后发酵物；
(3)墨红玫瑰酶解后发酵物：墨红玫瑰灵芝发酵物＝1:1；
(4)墨红玫瑰酶解后发酵物：墨红玫瑰灵芝发酵物＝1:0.5；
(5)墨红玫瑰酶解后发酵物：墨红玫瑰灵芝发酵物＝0.5:1。
结果例1指标检测
(1)DPPH自由基清除能力的测定：
实验组加入1ml样液+1ml0.2mmol/L的DPPH。对照组加入1ml无水乙醇+1ml样液。空白组加入1ml无水乙醇+1ml0.2mmol/L的DPPH，混匀室温(25℃)下静置30min。517nm下，吸取300ul，测定实验组吸光度，记为Ai。测定对照组吸光度，记为Aj。记空白组为A0。每个样品测3次平行。
DPPH清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％
(2)超氧阴离子自由基清除能力测定：
在10mL试管中加入5.7mL Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH＝8.2)，加入0.2mL样品进行混合之后放置在25℃保温箱中，10min后取出，再加0.1mL(10mmol/L)邻苯三酚溶液(已预热)，快速混匀后用多功能酶标仪测定320nm波长1min内吸光值的增加值(Aj)，线性范围内算出每1min吸光度的增加值，另取如上试剂，用等体积水替代样品，测定在320nm波长下，1min内吸光度的增加值(Ai)。
超氧阴根离子自由基清除率(％)＝(Ai-Aj)/Ai×100％
(3)羟基自由基(·OH)清除能力测定：
羟基自由基(·OH)清除测试方法参照Fenton反应方法，在试管中依次加入硫酸亚铁溶液(6mmol/L)、过氧化氢溶液(6mmol/L)、样品各2mL后静放置10min，之后再加入2mL水杨酸溶液(6mmol/L)，静放30min后在510nm处测定吸光度A0，用蒸馏水代替样品溶液同样处理，测定吸光值Ax。羟基自由基(·OH)清除率(％)＝(1-A0/Ax)×100％
(4)ABTS清除力的测定：
0.2mL 7.4mmoL/L ABTS与0.2mL 2.6mmoL/L K2S2O8混合，在室温条件黑暗处反应12h，反应完成后用95％乙醇(pH＝7.4磷酸盐缓冲液，95％乙醇或甲醇)稀释40-50倍，使得混合液在734nm光度下吸收值处于0.68-0.72(工作液)。
将不同处理发酵样品稀释后，分别吸取0.2mL，加入0.8mL稀释后的工作液，混合均匀后静置反应6min，迅速测定734nm波长处的吸光值A0。用95％乙醇代替样品溶液同样处理，测定吸光值Ax。每个样品测3次平行。
ABTS自由基清除率(％)＝1-A0/Ax×100％
(5)酪氨酸酶活性抑制率
表1
Figure BDA0003321770910000061
用微量移液器分别按上表的体积准确吸取酪氨酸酶、PBS及样品的反应液分别置于4个10mlPE管中(每个样品都需要实验组1和实验组2，对照组可以与多个实验组形成对照)混匀，37恒温水浴10min，然后在四组中全部加入1ml的L-酪氨酸,37℃反应10min，快速置于冰水中冷却。用酶标仪在475nm处测定其吸光度。
酪氨酸酶活性抑制率＝1-(AT4-AT3)/(AT2-AT1)×100％
AT1:对照组1在475m处测得的吸光度
AT2:对照组2在475m处测得的吸光度
AT3:实验组1在475m处测得的吸光度
AT4:实验组2在475m处测得的吸光度
(6)总还原力检测
移取1ml样品于10mlEP管中，随即快速加入2.5ml(0.2ml/L)的PBS溶液和2.5ml1％的铁氰化钾溶液，混匀后于50℃水浴锅中保温20min，取出后，加入2.5ml 10％的三氯乙酸溶液，加入三氯乙酸后若产生沉淀，则室温下3500r/min离心10min，吸取2.5ml的上清液，加入2.5ml蒸馏水；若加入三氯乙酸后无沉淀产生，吸取2.5ml溶液后加入2.5ml蒸馏水。加入0.5ml0.1％的三氯化铁溶液，混匀后反应10min。对照组用等量蒸馏水代替样液，其他操作不变。结果:在700nm光度下测定吸光值，实验组与对照组的吸光度大小与还原力成正比。
结果例2
实验结果如表2所示：
表2
Figure BDA0003321770910000071
Figure BDA0003321770910000081
注：不同小写字母表示差异显著(p<0.01)
结果表明：墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶解后发酵物的组合物在增加酪氨酸酶活性抑制率具有协同作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.组合物，其特征在于，包括墨红玫瑰灵芝发酵物和墨红玫瑰酶解后发酵物；
所述墨红玫瑰酶解后发酵物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取酶与墨红玫瑰干粉混合后，酶解，离心收集上清，制得墨红玫瑰酶解物；
步骤2：发酵菌种的选择；所述发酵菌种包括乳酸菌和酵母菌；
步骤3：发酵菌种的活化；
酵母菌：将菌种接种于YPD培养基中，于30℃恒温培养36-48h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×107CFU/mL以上；
乳酸菌：将菌种接种于MRS培养基中，于35℃恒温培养24h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×108CFU/mL以上；
步骤4：墨红玫瑰酶解后发酵：
取所述墨红玫瑰酶解物接入活化后的乳酸菌，混匀，置于37℃的培养箱中，发酵7d后，接种酵母菌，发酵7d后，离心，收集上清，得到所述墨红玫瑰酶解后发酵物；
所述墨红玫瑰灵芝发酵物的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：取灵芝菌种在MEA培养基中活化，获得活化后的灵芝；
步骤2：取墨红玫瑰干花灭菌后，接入步骤1所述活化后的灵芝，培养、醇提，获得所述墨红玫瑰灵芝发酵物。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述墨红玫瑰酶解后发酵物的制备方法，步骤1中所述酶包括果胶酶和纤维素酶，所述果胶酶和所述纤维素酶的重量比为1:1；所述果胶酶的酶活包括：2500U/mL；所述纤维素酶的酶活包括：3000U/mL。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述墨红玫瑰酶解后发酵物的制备方法，步骤2中，
乳酸菌包括：植物乳杆菌(保藏编号为CCTCC No：M 20191045的植物乳杆菌Picp-2；
酵母菌包括：保藏编号为CCTCC No：M 20191046的单胞酿酒酵母菌ZLG-6。
4.如权利要求1至3任一项所述的组合物，其特征在于，所述墨红玫瑰酶解后发酵物的制备方法，步骤3中，所述发酵菌种的活化具体为：
酵母菌：将菌种接种于YPD培养基中，于30℃恒温培养36～48h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×107CFU/mL以上；
乳酸菌：将菌种接种于MRS培养基中，于35℃恒温培养24h，连续传代3次，使菌种充分活化至活菌数在1.0×108CFU/mL以上。
5.如权利要求1至4任一项所述的组合物，其特征在于，步骤4中，
墨红玫瑰酶解后发酵具体包括：取所述墨红玫瑰酶解物按接种量5％(v/v)的比例接入活化后的乳酸菌，混匀，置于37℃的培养箱中，发酵7d后，按照1％(v/v)比例接种酵母菌，发酵7天后，9 000r/min离心15min，收集上清，得到所述墨红玫瑰酶解后发酵物。
6.如权利要求2至5任一项所述的组合物，其特征在于，所述墨红玫瑰灵芝发酵物的制备方法的步骤1中所述MEA培养基包括麦芽提取物1.2％，琼脂2％，葡萄糖1％，余量为蒸馏水；所述活化的温度为28℃，所述活化的时间为7d。
7.如权利要求2至6任一项所述的组合物，其特征在于，所述墨红玫瑰灵芝发酵物的制备方法的步骤2中，以g/mL计，所述墨红玫瑰干花与所述活化后的灵芝的重量体积比为6:10；所述灭菌为121℃灭菌4h；
所述墨红玫瑰灵芝发酵物的制备方法的步骤2中，所述培养的温度为28℃，所述培养的时间为7～14d。
8.如权利要求2至7任一项所述的组合物，其特征在于，所述墨红玫瑰灵芝发酵物的制备方法的步骤2中，所述醇提采用乙醇，培养后的墨红玫瑰与乙醇的重量比为1:(20～30)；乙醇浓度为60～90％，所述醇提的温度为70～90℃，所述醇提的时间为3～5h。
9.如权利要求2至8任一项所述的组合物，其特征在于，所述墨红玫瑰灵芝发酵物和所述墨红玫瑰酶解后发酵物的体积比为(0.5～1)：(0.5～1)。
10.如权利要求2至9任一项所述的组合物在制备抗衰老和/或美白的产品中的应用。
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