CN112245343B - 灵芝发酵牛蒡根的方法、复合发酵牛蒡根的方法及发酵产品和应用 - Google Patents

灵芝发酵牛蒡根的方法、复合发酵牛蒡根的方法及发酵产品和应用 Download PDF

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Abstract

本公开提供了一种灵芝发酵牛蒡根的方法，包括：取牛蒡根和水混合、灭菌处理、冷却后得到发酵底物；牛蒡根和水的质量比为1:5‑1:100；往发酵底物接种白肉灵芝菌进行发酵处理，然后灭菌、分离，得到白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液。还提供一种灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根的方法包括：取牛蒡根和水混合、灭菌处理、冷却后得到第一发酵底物，然后接种灵芝菌进行第一次发酵处理，得到灵芝‑牛蒡根发酵物；对灵芝‑牛蒡根发酵物进行灭菌处理、冷却后得到第二发酵底物，然后接种酵母菌进行第二次发酵处理，灭菌处理，得到灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵产品。该发酵产品具有良好的美白和抗氧化功效，复合发酵产品还具有抗菌消炎作用。

Description

灵芝发酵牛蒡根的方法、复合发酵牛蒡根的方法及发酵产品 和应用
技术领域
本公开属于生物发酵技术领域，具体涉及一种灵芝发酵牛蒡根的方法、复合发酵牛蒡根的方法及发酵产品和应用，该发酵产品具有良好的抗菌消炎作用。
背景技术
牛蒡(Arctium lappa L.)为菊科两年生草本植物，又名白肌人参、蒡翁菜。牛蒡根呈纺锤形，皮部黑褐色，味道微苦而性黏。牛蒡根中不仅含有丰富的蛋白质和低聚糖等糖类活性成分，还具有丰富的牛蒡酸、挥发油、醛类以及多炔类等小分子活性成分。我国《现代中药学大辞典》等国家权威药典将牛蒡根的药理作用概括为三个方面：促进生长作用、抑制肿瘤生长作用以及抗菌和抗真菌作用。
白肉灵芝(Ganoderma leucocontextum)是多孔菌科真菌白肉灵芝的子实体，是中国西南地区灵芝属的一个重要种类，在森林分布中较为广泛，现已经实现人工栽培，具有较高的产量。灵芝中的次级代谢产物高达430多种，主要有灵芝多糖、三萜类化合物、蛋白质等活性成分，具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、降血脂等很高的药用价值和药理作用。目前灵芝已经被广泛应用于医药、营养保健、化妆品等行业。灵芝多糖、灵芝中的萜类化合物以及酚类等活性成分具有抗氧化和清除自由基的作用。灵芝还能够抑制幽门螺杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等多种菌的生长，其中灵芝多糖起着至关重要的作用。
黄酒酵母(Yellow rice wine yeast)是酵母菌大家族中得一员，是重要的发酵素，能分解碳水化合物产生酒精和二氧化碳等。黄酒酵母是从黄酒发酵醪中分离出来的，黄酒的酿造主要微生物是霉菌和酵母，而发酵的关键是酵母的选择。酵母菌在发酵的过程中分泌的酶等物质，可以将多糖类大分子物质分解为小分子物质，更利于人体和皮肤吸收。同时，酵母菌发酵过程中释放的氨基酸、糖类、多肽等物质也具有优越的抗氧化作用。
发酵指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程，在食品工业、生物和化学工业中均有广泛应用。对采用发酵技术提取营养物质已多有报道，但是根据发酵底物和发酵工艺条件的不同，提取效果差别很大。有赖于研究人员继续探索更多发酵底物组合及发酵方法制备出更多、更优功效的产品以，满足消费者需求。
目前，对于牛蒡中的活性成分的发酵提取已有一些研究。比如，以牛蒡为发酵底物，以多孔菌科灵芝为发酵菌株，通过响应面法优化发酵条件，最终以将牛蒡粉碎至6目，按照液固比0.4mL/g、装瓶量为0.2g/mL，进行固体发酵，从而提取灵芝多糖；测定了灵芝多糖的清除DPPH自由基的能力、清除羟自由基的能力以及超氧阴离子的能力(董玉玮,周洁等.灵芝在牛蒡固体培养基中发酵工艺优化及菌丝多糖的体外抗氧化活性[J].食品科学,2019,40(10):149-156.)。再比如，以牛蒡为发酵底物，以嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌三种菌对牛蒡的浸提液进行发酵，通过正交法进行发酵条件优化，最终以牛蒡用量17％，复合菌种的用量为12％，白砂糖添加量13％，进行发酵，得到牛蒡茶味调味醋，再对其进行感官评价(王帅,李慧,贺羽.混合菌株复合调味发酵牛蒡茶味调味醋的研制[J].中国调味品,2019,44(10):116-120.)。
但目前尚未有采用白肉灵芝液体发酵牛蒡根、以及白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根并将其用于化妆品领域的报道。
发明内容
在下文中给出了关于本公开的简要概述，以便提供关于本公开的某些方面的基本理解。应当理解，这个概述并不是关于本公开的穷举性概述。它并不意图确定本公开的关键或重要部分，也不意图限定本公开的范围。其目的仅仅是以简化的形式给出某些概念，以此作为稍后论述的更详细描述的前序。
鉴于现有技术的上述缺陷，本公开的目的是提供一种灵芝发酵牛蒡根的方法、复合发酵牛蒡根的方法及发酵产品和应用，该发酵产品具有良好的美白和抗氧化功效，复合发酵产品还具有抗菌消炎作用。
根据本公开的一个方面，提供了一种灵芝发酵牛蒡根的方法，包括：
取适量牛蒡根和水混合、灭菌处理、冷却后得到发酵底物；所述牛蒡根和水的质量比为1:5-1:100；
往所述发酵底物接种白肉灵芝菌进行发酵处理，然后灭菌、分离，得到白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液。
上述灵芝发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，用于接种的灵芝菌液的浓度为104-109CFU/mL(比如105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL等)，所述灵芝菌液和所述发酵底物的体积比为5％-20％(比如8％、10％、12％、15％、18％等)。
上述灵芝发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述牛蒡根为过筛的牛蒡根干粉，所述筛的目数为20目-50目(比如30目、40目)。
上述灵芝发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵处理的温度为25℃-30℃(比如29℃、28℃、27℃、26℃等)，时间为24-96h(比如30h、40h、50h、60h、70h、80h、90h等)。
上述灵芝发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述发酵处理在恒温震荡培养箱中进行，转速为100r/min-200r/min(比如110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min、160r/min、170r/min、180r/min、190r/min等)。
上述灵芝发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，还包括：对所述白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液进行干燥处理，最终得到白肉灵芝发酵牛蒡根发酵干粉。
上述灵芝发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述干燥处理可以是喷雾干燥、真空冷冻干燥等。
根据本公开的另一个方面，提供了一种复合发酵牛蒡根的方法，包括：
一次发酵步骤：取适量牛蒡根和水混合、灭菌处理、冷却后得到第一发酵底物，然后接种灵芝菌进行第一次发酵处理，得到灵芝-牛蒡根发酵物；
二次发酵步骤：对所述灵芝-牛蒡根发酵物进行灭菌处理、冷却后得到第二发酵底物，然后接种酵母菌进行第二次发酵处理，灭菌处理，得到灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵产品。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述一次发酵步骤中，所述牛蒡根为过筛的牛蒡根干粉，所述筛的目数为20目-50目(比如30目、40目)。牛蒡根和水混合、灭菌处理、冷却后得到第一次发酵处理的培养基，主要靠牛蒡根自带的碳源和氮源进行发酵。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述一次发酵步骤中，牛蒡根和水的质量比为1:5-1:100(比如1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:95等)。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述一次发酵步骤中，制备所述第一发酵底物时所述灭菌处理的温度为110℃-125℃(比如112℃、115℃、118℃、120℃、122℃、124℃等)，时间为10-40min(比如15min、20min、25min、30min、35min等)。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述一次发酵步骤中，制备所述第一发酵底物时所述灭菌处理完成后冷却至30℃以下(比如28℃、25℃、22℃、20℃、15℃等)再接种灵芝菌。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述一次发酵步骤中，所述灵芝菌为白肉灵芝菌。实验发现，利用白肉灵芝菌进行发酵，最终得到的牛蒡发酵液不仅含有牛蒡中的牛蒡多糖等活性成分，还具有白肉灵芝菌在发酵过程中产生的灵芝多糖等活性物质，从而获得更强的抗氧化能力。在本公开的其他实施例中，白肉灵芝菌可以替换成其他多孔菌科灵芝菌。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述一次发酵步骤中，用于接种的灵芝菌液的浓度为104-109CFU/mL(比如105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL等)，灵芝菌液和第一发酵底物的体积比为5％-20％(比如8％、10％、12％、15％、18％等)。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述一次发酵步骤中，所述第一次发酵处理的温度为25℃-30℃(比如29℃、28℃、27℃、26℃等)，时间为24-96h(比如30h、40h、50h、60h、70h、80h、90h等)；发酵时间过长会增加生产成本以及染菌风险。更优选地，所述第一次发酵处理在恒温震荡培养箱中进行，转速为100r/min-200r/min(比如110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min、160r/min、170r/min、180r/min、190r/min等)。
上述灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述二次发酵步骤中，制备所述第二发酵底物时所述灭菌处理温度为105℃-121℃(比如108℃、110℃、112℃、115℃、118℃、120℃、122℃、124℃等)，时间为15-40min(比如18min、20min、25min、30min、35min等)。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述二次发酵步骤中，制备所述第二发酵底物时所述灭菌处理完成后冷却至30℃以下(比如28℃、25℃、22℃、20℃、15℃等)再接种酵母菌。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述二次发酵步骤中，所述酵母菌为黄酒酵母。实验发现，通过利用黄酒酵母进行二次发酵，不仅可以提高牛蒡发酵液中的活性物质含量，还可以降低牛蒡发酵液中大分子活性物质的分子量，有利于皮肤吸收。所述酵母菌还可以用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)替代。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述二次发酵步骤中，用于接种的酵母菌液的浓度为105-1010CFU/mL(比如5×105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL等)，所述酵母菌液和所述第二发酵底物的体积比为5％-20％(比如8％、10％、12％、15％、18％等)。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述二次发酵步骤中，所述第二次发酵处理的温度为20℃-35℃(比如22℃、25℃、28℃、30℃、32℃、34℃等)，时间为24-72h(比如26h、30h、40h、50h、60h、65h、70h等)；更优选地，所述第二次发酵处理在恒温震荡培养箱中进行，转速为100r/min-200r/min(比如110r/min、120r/min、130r/min、140r/min、150r/min、160r/min、170r/min、180r/min、190r/min等)。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述二次发酵步骤中，所述第二次发酵处理完毕后所述灭菌处理温度为105℃-121℃(比如108℃、110℃、112℃、115℃、118℃、120℃、122℃、124℃等)，时间为15-40min(比如18min、20min、25min、30min、35min等)。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述二次发酵步骤中，所述灭菌处理后，还包括分离处理步骤：对所述灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵产品进行分离处理，弃沉淀，取清液，即得到灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵液。灭菌处理一方面防止污染后续的设备，另一方面可以对菌体进行破坏，释放出菌体中的活性成分，将活性成分尽量保留在发酵液中。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述二次发酵步骤中，所述灭菌处理后，冷却至40℃以下(比如38℃、35℃、32℃、28℃、25℃、22℃、20℃、15℃等)再进行分离处理。温度过高，会影响离心机运行，而且高温离心会对产品粘度产生影响。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述分离处理采用离心方法；更优选地，离心转速为2000r/min-10000r/min(比如3000r/min、4000r/min、5000r/min、6000r/min、7000r/min、8000r/min、9000r/min等)，离心时间为5min-30min(比如8min、10min、15min、20min、25min、28min)。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述二次发酵步骤之后，还包括干燥处理步骤，对灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵液进行干燥处理，最终得到灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵干粉。
上述复合发酵牛蒡根的方法中，作为一种优选实施方式，所述干燥处理可以是喷雾干燥、真空冷冻干燥等。
根据本公开的第三方面，还提供了一种采用上述灵芝发酵牛蒡根的方法制备的发酵产品，包括发酵液、发酵干粉等。
根据本公开的第四方面，还提供了一种采用上述复合发酵牛蒡根的方法制备的发酵产品，包括发酵液、发酵干粉等。
根据本公开的第五方面，还提供了上述发酵产品在制备化妆品中的应用；优选地，所述化妆品可以是面膜、精华液、爽肤水、乳液等。
按照本公开的方法制得的灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵液含有多糖、黄酮、蛋白等活性物质，具有抗氧化作用、清除自由基的作用、抗菌的作用以及抑制黑色素生成的美白作用，可以添加到包括但是不限于：面膜、精华液、爽肤水、乳液等化妆品中。
本公开利用白肉灵芝菌对牛蒡根粉进行液体发酵，不仅能够提取出牛蒡中牛蒡多糖等活性物质，还将牛蒡根中的淀粉等物质转化为具有抗氧化等作用的灵芝多糖；再利用黄酒酵母对白肉灵芝牛蒡根发酵液进行第二次发酵，不仅提高了最终牛蒡根发酵液中活性物质的含量，还会降低牛蒡根发酵液中多糖、多肽等大分子物质的分子量。将按照本公开制备的牛蒡根发酵液应用于化妆品中，能够提高化妆品的抗氧化作用，还能提高皮肤的吸收量。
本发明制得的发酵液具有优越的安全性，可以直接作为面膜液或精华液或爽肤水等成品化妆品使用，对皮肤无副作用。
通过以下结合附图对本公开的最佳实施例的详细说明，本公开的这些以及其他优点将更加明显。
附图说明
本公开可以通过参考下文中结合附图所给出的描述而得到更好的理解。所述附图连同下面的详细说明一起包含在本说明书中并且形成本说明书的一部分，而且用来进一步举例说明本公开的优选实施例和解释本公开的原理和优点。其中：
图1为不同样品对B16细胞内黑色素含量影响的结果示意图，其中，A：空白对照，B：33mM熊果苷，C：5％白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液，D：5％白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液；
图2为不同样品对DPPH自由基清除率测试的结果示意图，其中，A：维生素C，B：不同浓度的白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液，C：不同浓度的白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液。
具体实施方式
在下文中将结合附图对本公开的示范性实施例进行描述。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的牛蒡为牛蒡根干品，来自市面销售。
下述实施例中的白肉灵芝G045购自于北京市农林科学院。
下述实施例中的黄酒酵母21392购自于中国食品酿造研究所。
实施例1白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液、白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液的制备
白肉灵芝和黄酒酵母的种子培养基均为常规市售马铃薯培养基。白肉灵芝菌液在28℃恒温震荡培养箱中180r/min培养72h，得到浓度为106CFU/mL的白肉灵芝菌液。黄酒酵母菌液在28℃恒温震荡培养箱中150r/min培养48h，得到浓度为1010CFU/mL的黄酒酵母菌液。
将牛蒡根粉碎至过20目筛，按照1:30的料液比与去离子水混合，置于三角瓶中，摇匀后，放入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间20min。
灭菌完成后即为牛蒡根培养基(即第一发酵底物)，将该培养基置于常温下，冷却至30℃以下。将浓度为106CFU/mL的白肉灵芝菌液，按照10％的比例接入到牛蒡根培养基中，在温度为25℃、转速为180r/min的恒温震荡培养箱中发酵72h。发酵完成后，放入到高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌温度为110℃、灭菌时间30min。
灭菌完成后置于常温下，冷却至30℃以下，其中，一部分进行了分离得到白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液(初步发酵液)进行性能测试；另一部分未进行分离直接作为白肉灵芝牛蒡根发酵液培养基，进行第二次发酵处理，即：将浓度为1010CFU/mL的黄酒酵母菌液，按照5％的比例接入到白肉灵芝牛蒡根发酵液培养基中，在温度为28℃、转速为150r/min的恒温震荡培养箱中发酵48h。发酵完成后，放入到高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌温度为105℃、灭菌时间20min。
灭菌完成后，置于常温，冷却至40℃左右，进行离心，离心转速为8000r/min、离心时间为10min。离心后取上清，上清液即为白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液(复合发酵液)。
实施例2实施例1制得的牛蒡根发酵液作为化妆品中的应用
一、牛蒡根发酵液理化性质分析
对实施例1制备所得的白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液(初步发酵液)进行理化性质分析。其外观为粘稠液体、颜色为黄色至棕色，pH值5.0-7.0，粘度50-1000cP，可溶性固含物含量0.3-4.0％，菌落总数小于50CFU/mL，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以此白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液符合化妆品质量要求。
对实施例1制备所得的白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液(复合发酵液)进行理化性质分析。其外观为粘稠液体、颜色为黄色至棕色，pH值4.5-7.0，粘度50-800cP，可溶性固含物含量1.0-5.7％，菌落总数小于50CFU/mL，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不高于1000CFU/ml，所以此白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液符合化妆品质量要求。
对实施例1中制得的白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液(初步发酵液)和该白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液(复合发酵液)进行成分分析，蛋白质检测方法参照GB5009.5-2010；粗多糖检测方法参照GB/T 5009.8-2008；黄酮检测方法参照GB/T 5009.124-2003；总酚检测方法参照GB/T 8313-2008所得结果如下：
表1实施例1制得的不同阶段牛蒡根发酵液中活性物质含量(mg/mL)
Figure BDA0002705065500000091
Figure BDA0002705065500000101
从表2中可以看出：白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液(初步发酵液)和该白灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液(复合发酵液)中具有多种活性物质，且通过酵母对白灵芝酵母发酵牛蒡根发酵液的二次发酵，最终制得的发酵液中活性物质含量得到了显著的提升。
二、牛蒡根发酵液的安全性检测
人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例1中获得的白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液(初步发酵液)、白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液(复合发酵液)进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。
1、试验对象
选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。
2、试验方法
将液体样品(即实施例1制得的初步发酵液和复合发酵液)0.02mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的样品溶剂，如蒸馏水或橄榄油(本实施例采用蒸馏水)。
试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。
3、试验结果
斑贴试验结果如表2所示，表2中各符号表示的含义如下：“－”＝阴性反应。“±”＝可疑反应；仅有微弱红斑。“+”＝弱阳性反应(红斑反应)；红斑、浸润、水肿、可有丘疹。“++”＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区。“+++”＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。
表2实施例1制得的白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液的斑贴试验结果
Figure BDA0002705065500000111
从表2中可以看出：实施例1得到的白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液(初步发酵液)、白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液(复合发酵液)都未产生可疑反应，说明本发明提供的白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液和白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液都具有安全性，不会给人体带来不良反应。
二、牛蒡根发酵液的分子量大小检测
分子量大小是检验是否能够进行皮肤渗透的重要因素。本发明通过高效液相色谱(HPLC)测定实施例1制备的白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液的分子量大小。具体步骤如下：
1、试验的试剂和溶液的制备
(1)流动相：乙腈：水：三氟乙酸＝300:700:1(v/v/v，体积比)。
(2)样品制备：以流动相为溶剂配制浓度为5mg/mL的样品，再在用微孔膜(0.45μm)过滤后供进样。
(3)标准样品制备：将牛血清蛋白(Mr 67000)、维生素B12(Mr 1335)、氧化型谷胱甘肽(Mr 614)配成混标，每种物质的浓度均为5mg/mL。
2、试验方法
将三种已知分子量的标准品：牛血清白蛋白(Mw 67000)，维生素B12(Mw 1335)和氧化型谷胱甘肽(Mw 614)通过高效液相色谱仪(Waters公司)参照文献“王成忠等.蛋白酶酶解麦胚蛋白及酶解液中多肽分子量分布的研究.粮食加工，2012:37(2)”中的方法进行HPLC分析，绘制分子量对数与洗脱时间的标准曲线。根据凝胶柱渗透层析原理，多肽分子量大的物质先被洗脱出来，洗脱时间与分子量的对数呈线性关系。再按照同样的方法将实施例1中制备的白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液进行HPLC分析，得到相应峰的洗脱时间，将洗脱时间代入标准曲线，即可得到实施例1制备的白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液的分子量大小。
色谱条件：色谱柱：TsK gel 2000 SWXL 300mm×7.8mm；检测波长：UV 280nm；流速：1mL/min；柱温：30℃。
3、试验结果
标准物质的分子量与洗脱时间的如表3所示，根据分子量的对数和洗脱时间做图，得到标准曲线：y＝-2.4698x+17.456，R2＝0.9996。其中y为洗脱时间(min)；x为分子量对数。
表3标准物质的分子量与洗脱时间
Figure BDA0002705065500000121
Figure BDA0002705065500000131
表4不同发酵阶段发酵液分子量与洗脱时间
Figure BDA0002705065500000132
实施例1制备的白肉灵芝牛蒡根发酵液洗脱时间为9.782min，将洗脱时间代入标准曲线：y＝-2.4698x+17.456，计算出峰的分子量为1278Da；白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液洗脱时间为10.933min，将洗脱时间代入标准曲线：y＝-2.4698x+17.456，计算出峰的分子量为438Da。
实验结果表明，通过酵母菌的发酵，显著降低了发酵液中的分子量。一般认为分子量小于500Da左右更易被皮肤吸收，所以白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液中的活性成分更易被皮肤吸收。
三、牛蒡根发酵液的美白功效分析
取对数生长期状态良好的B16细胞计数并接种于T25培养瓶中，置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养过夜；更换培养基，分别加入实施例1中制得的白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液与白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液(均为体积浓度为5％的稀释液)，并以33mM熊果苷为阴性对照组，未作处理的空白样为空白对照组，培养48h后吸弃培养基，使用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤后加入裂解液，刮取细胞并收集于离心管中；80℃水浴30min；振荡混匀，吸取至96孔板于475nm读取吸光度值。黑色素含量变化＝(测定孔OD值-空白对照OD值)/(细胞对照组OD值-空白对照OD值)。
如图1所示为实施例1所制备的白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液和白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液在5％体积浓度下对B16细胞内黑色素含量影响的结果示意图，其中，A：空白对照，B：33mM熊果苷，C：5％白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液，D：5％白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液。实验证明5％体积浓度的白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液和5％体积浓度的白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液作用下相对黑色素含量为分别为69.7％和54.3％，33mM的熊果苷作用下相对黑色素含量为78.3％，以上数据结果表明，实施例1中得到的不同发酵阶段的5％体积浓度发酵液的抑制黑色素生成的能力均大于33mM的熊果苷，说明实施例1中得到的发酵液具有较强的美白作用，并且通过酵母进一步发酵得到的白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液(复合发酵液)的抑制黑色素生成的能力大于仅用白肉灵芝发酵牛蒡根的发酵液(初步发酵液)。
四、牛蒡根发酵液的抗氧化性能检测
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
取不同量的实施例1制备得到的白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液(初步发酵液)和白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液(复合发酵液)溶于去离子水中，制得体积百分浓度为2％、4％、6％、8％、10％的一系列待测液，以维生素C为阳性对照。
DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：
(1)取等体积(3mL)的待测液与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A1管)；
(2)取等体积(3mL)的无水乙醇(待测物溶剂)与2×10-4mol/L的DPPH溶液混匀(A2管)；
(3)取等体积(3mL)的无水乙醇与待测液混匀(A3管)；
(4)反应30min后，在517nm下测A1管、A2管、A3管吸光度值。
清除率计算公式为：清除率(％)＝[(A2+A3)-A1]/A2 (1)
以待测液的体积百分浓度为横坐标，清除率为纵坐标，制作DPPH自由基清除作用曲线，见图2，其中，A：维生素C，B：不同浓度的白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液，C：不同浓度的白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液。
由图2可知，实施例1所得白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液(初步发酵液)的清除DPPH自由基的IC50为6.31％，白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液(复合发酵液)清除DPPH自由基的IC50为5.08％，以上结果表明，实施例1中得到的不同阶段的发酵液均具有很强的抗氧化能力，并且白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液的抗氧化活性高于白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液。
五、白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液的抑菌性能检测
1、实验菌株
痤疮丙酸杆菌菌株CGMCC1.5085：购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
2、培养基
脑心浸液培养基：小牛脑浸粉12.5g/L；牛心浸粉5g/L；磷酸氢二钠2.5g/L；葡萄糖2g/L；氯化钠5g/L；蛋白胨10g；pH值7.4±0.1。购自北奥博星生物技术有限公司。
3、实验方法
分别称量适量营养琼脂加入不同三角瓶中，各加入少量蒸馏水加热溶解，备用；用接种环挑取各试管斜面的菌种分别置于带含无菌水的试管中，用振荡器将试管中的细胞分散，制得菌悬液，浓度为108CFU/mL。用移液器吸取0.5mL菌悬液分别注入不同培养皿中；向各培养皿内注入20mL的熔化状的培养基(约45℃)，将菌液与培养基混合均匀待其冷却；将牛津杯垂直放入培养基，轻轻压入，后向杯内加满测试样品水溶液(约240微升)，盖上培养皿盖子置于37℃厌氧培养箱中，培养24小时，观察牛津杯周围抑菌圈的有无及大小。由于牛津杯所吸附的测试样品慢慢向四周扩散，因此在牛津杯的周围就出现清晰的抑菌圈。抑菌圈的大小代表测试样品抗菌力的高低。抑菌圈直径越大表明防腐体系的防腐效能越强。
4、实验结果
表5白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液对痤疮丙酸杆菌抑制效果
Figure BDA0002705065500000161
通过表5中实验结果可以得出，由实施例1制得的白肉灵芝酵母复合发酵牛蒡根发酵液具有一定的抑菌效果。
综上，在根据本公开的实施例中，本公开提供了如下技术方案，但不限于此：
方案1、一种灵芝发酵牛蒡根的方法，其特征在于，包括：
取适量牛蒡根和水混合、灭菌处理、冷却后得到发酵底物；所述牛蒡根和水的质量比为1:5-1:100；
往所述发酵底物接种白肉灵芝菌进行发酵处理，然后灭菌、分离，得到白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液。
方案2、根据方案1所述的灵芝发酵牛蒡根的方法，其特征在于，用于接种的灵芝菌液的浓度为104-109CFU/mL，所述灵芝菌液和所述发酵底物的体积比为5％-20％。
方案3、根据方案1或2所述的灵芝发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述牛蒡根为过筛的牛蒡根干粉，所述筛的目数为20目-50目。
方案4、根据方案1-3中任一项所述的灵芝发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述发酵处理的温度为25℃-30℃，时间为24-96h。
方案5、根据方案1-4中任一项所述的灵芝发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述发酵处理在恒温震荡培养箱中进行，转速为100r/min-200r/min。
方案6、根据方案1-5中任一项所述的灵芝发酵牛蒡根的方法，其特征在于，对所述白肉灵芝发酵牛蒡根发酵液进行干燥处理，最终得到白肉灵芝发酵牛蒡根发酵干粉；优选地，所述干燥处理采用喷雾干燥或真空冷冻干燥。
方案7、一种复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，包括：
一次发酵步骤：取适量牛蒡根和水混合、灭菌处理、冷却后得到第一发酵底物，然后接种灵芝菌进行第一次发酵处理，得到灵芝-牛蒡根发酵物；
二次发酵步骤：对所述灵芝-牛蒡根发酵物进行灭菌处理、冷却后得到第二发酵底物，然后接种酵母菌进行第二次发酵处理，灭菌处理，得到灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵产品。
方案8、根据方案7所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述一次发酵步骤中，所述牛蒡根为过筛的牛蒡根干粉，所述筛的目数为20目-50目。
方案9、根据方案7或8所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述一次发酵步骤中，牛蒡根和水的质量比为1:5-1:100。
方案10、根据方案7-9中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述一次发酵步骤中，制备所述第一发酵底物时所述灭菌处理的温度为110℃-125℃，时间为10-40min。
方案11、根据方案7-10中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述一次发酵步骤中，制备所述第一发酵底物时所述灭菌处理完成后冷却至30℃以下再接种灵芝菌。
方案12、根据方案7-11中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述一次发酵步骤中，所述灵芝菌为白肉灵芝菌。
方案13、根据方案7-12中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述一次发酵步骤中，用于接种的灵芝菌液的浓度为104-109CFU/mL，所述灵芝菌液和所述第一发酵底物的体积比为5％-20％。
方案14、根据方案7-13中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述一次发酵步骤中，所述第一次发酵处理的温度为25℃-30℃，时间为24-96h。
方案15、根据方案7-14中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述第一次发酵处理在恒温震荡培养箱中进行，转速为100r/min-200r/min。
方案16、根据方案7-15中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，制备所述第二发酵底物时所述灭菌处理温度为105℃-121℃，时间为15-40min。
方案17、根据方案7-16中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，制备所述第二发酵底物时所述灭菌处理完成后冷却至30℃以下再接种酵母菌。
方案18、根据方案7-17中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，所述酵母菌为黄酒酵母或/和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
方案19、根据方案7-18中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，用于接种的酵母菌液的浓度为105-1010CFU/mL，所述酵母菌液和所述第二发酵底物的体积比为5％-20％。
方案20、根据方案7-19中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，所述第二次发酵处理的温度为20℃-35℃，时间为24-72h。
方案21、根据方案7-20中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述第二次发酵处理在恒温震荡培养箱中进行，转速为100r/min-200r/min。
方案22、根据方案7-21中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，所述第二次发酵处理完毕后所述灭菌处理温度为105℃-121℃，时间为15-40min。
方案23、根据方案7-22中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，所述灭菌处理后，还包括分离处理步骤：对所述灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵产品进行分离处理，弃沉淀，取清液，即得到灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵液。
方案24、根据方案23所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，所述灭菌处理后，冷却至40℃以下再进行分离处理。
方案25、根据方案23或24所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述分离处理采用离心方法；离心转速为2000r/min-10000r/min，离心时间为5min-30min。
方案26、根据方案7-25中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤之后，还包括干燥处理步骤，对灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵液进行干燥处理，最终得到灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵干粉。
方案27、根据方案26所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述干燥处理采用喷雾干燥或真空冷冻干燥。
方案28、一种采用根据方案1-6中任一项所述的灵芝发酵牛蒡根的方法制备的发酵产品。
方案29、一种采用根据方案7-27中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法制备的发酵产品。
方案30、方案28或29所述的发酵产品在制备化妆品中的应用。
最后，还需要说明的是，在本公开中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
尽管上面已经通过本公开的具体实施例的描述对本公开进行了披露，但是，应该理解，本领域技术人员可在所附方案的精神和范围内设计对本公开的各种修改、改进或者等同物。这些修改、改进或者等同物也应当被认为包括在本公开所要求保护的范围内。

Claims (16)

1.一种灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，包括：
一次发酵步骤：取适量牛蒡根和水混合、灭菌处理、冷却后得到第一发酵底物，然后接种灵芝菌进行第一次发酵处理，得到灵芝-牛蒡根发酵物；
二次发酵步骤：对所述灵芝-牛蒡根发酵物进行灭菌处理、冷却后得到第二发酵底物，然后接种酵母菌进行第二次发酵处理，灭菌处理，得到灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵产品；
其中，所述一次发酵步骤中，所述牛蒡根为过筛的牛蒡根干粉，所述筛的目数为20目-50目，牛蒡根和水的质量比为1:5-1:100；所述灵芝菌为白肉灵芝菌，用于接种的灵芝菌液的浓度为104-109CFU/mL，所述灵芝菌液和所述第一发酵底物的体积比为5％-20％；所述第一次发酵处理的温度为25℃-30℃，时间为24-96h；
所述二次发酵步骤中，用于接种的酵母菌液的浓度为105-1010CFU/mL，所述酵母菌液和所述第二发酵底物的体积比为5％-20％；所述第二次发酵处理的温度为20℃-35℃，时间为24-72h。
2.根据权利要求1所述的灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述一次发酵步骤中，制备所述第一发酵底物时所述灭菌处理的温度为110℃-125℃，时间为10-40min。
3.根据权利要求1或2所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述一次发酵步骤中，制备所述第一发酵底物时所述灭菌处理完成后冷却至30℃以下再接种灵芝菌。
4.根据权利要求1所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述第一次发酵处理在恒温震荡培养箱中进行，转速为100r/min-200r/min。
5.根据权利要求1所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，制备所述第二发酵底物时所述灭菌处理温度为105℃-121℃，时间为15-40min。
6.根据权利要求1或5所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，制备所述第二发酵底物时所述灭菌处理完成后冷却至30℃以下再接种酵母菌。
7.根据权利要求1所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，所述酵母菌为黄酒酵母或/和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
8.根据权利要求1所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述第二次发酵处理在恒温震荡培养箱中进行，转速为100r/min-200r/min。
9.根据权利要求1所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，所述第二次发酵处理完毕后所述灭菌处理温度为105℃-121℃，时间为15-40min。
10.根据权利要求1、2、4-5、7-9中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，所述灭菌处理后，还包括分离处理步骤：对所述灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵产品进行分离处理，弃沉淀，取清液，即得到灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵液。
11.根据权利要求10所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤中，所述灭菌处理后，冷却至40℃以下再进行分离处理。
12.根据权利要求10所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述分离处理采用离心方法；离心转速为2000r/min-10000r/min，离心时间为5min-30min。
13.根据权利要求10所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述二次发酵步骤之后，还包括干燥处理步骤，对灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵液进行干燥处理，最终得到灵芝酵母双重复合发酵牛蒡根发酵干粉。
14.根据权利要求13所述的复合发酵牛蒡根的方法，其特征在于，所述干燥处理采用喷雾干燥或真空冷冻干燥。
15.一种采用根据权利要求1-14中任一项所述的复合发酵牛蒡根的方法制备的发酵产品。
16.权利要求15所述的发酵产品在制备化妆品中的应用。
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