CN115572738A - 一种具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液及其制备方法和应用，涉及微生物发酵技术领域。本发明所述铁皮石斛发酵液的制备方法包括如下步骤：(1)将铁皮石斛粉、碳源、氮源、水混合均匀，得到发酵培养基；(2)将红曲霉种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵，发酵温度为24～32℃，发酵时间为24～72h，得到发酵产物；(3)对所述发酵产物进行灭菌、过滤处理，得到所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液。本发明通过选用红曲霉菌对铁皮石斛进行发酵，对发酵条件进行筛选，显著提升了铁皮石斛发酵液的抗炎、舒缓和修护功效，适合应用于护肤领域中。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液及其制备方法和应用。
背景技术
铁皮石斛为兰科石斛属多年生附生草本植物，是传统名贵药材，为九大仙草之首。其主要活性成分为多糖、黄酮、多酚、石斛碱、氨基酸及其衍生物等。铁皮石斛所含的有效成分多且彼此有协同效应，一般的提取方法很难兼顾不同性质的活性物质同时被提取。研究发现，铁皮石斛经过微生物发酵后生物活性增强，微生物在生长过程中会合成各种对人体有益的酶，而产生的酶系能够破坏药材的细胞壁，促进活性物质的释放，同时，微生物发酵还可以促进大分子物质如铁皮石斛多糖的适当降解，更有利于皮肤吸收。
现有技术通常选用混菌发酵铁皮石斛，得到的产品的护肤功效多以抗氧化、美白为主，未探究发酵条件对铁皮石斛发酵液的其他护肤功效。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液及其制备方法和应用，所述铁皮石斛发酵液的制备方法简单，适于工业化生产。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：
一种具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将铁皮石斛粉、碳源、氮源、水混合均匀，得到发酵培养基；
(2)将红曲霉种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵，发酵温度为24～32℃，发酵时间为24～72h，得到发酵产物；
(3)对所述发酵产物进行灭菌、过滤处理，得到所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液。
本发明选用红曲霉菌对铁皮石斛进行发酵，红曲霉在生长代谢过程中产生多种复合酶，包括纤维素酶，半纤维素酶，果胶酶等。通过酶的作用可以将铁皮石斛的细胞壁温和裂解，使功效物质成分得以游离释放，有助于提升铁皮石斛发酵液的抗炎、舒缓和修护功效。此外，本发明通过对发酵条件进行筛选，进一步提升了所述铁皮石斛发酵液的抗炎、舒缓和修护功效。
优选地，步骤(1)中，所述铁皮石斛粉由铁皮石斛茎制备而成，所述铁皮石斛粉可以通过80目筛；所述铁皮石斛粉、碳源、氮源、水混合均匀后还可以进行灭菌处理，得到所述发酵培养基。铁皮石斛茎具有相对更好的抗肿瘤、抗氧化、提高人体免疫力、治疗胃肠道疾病的作用，对其粒径进行上述筛选可以提高铁皮石斛发酵液中功效成分的含量，改善铁皮石斛发酵液的抗炎、舒缓和修护性能以及稳定性。
优选地，步骤(1)中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果葡糖浆、麦芽糖中的至少一种；所述氮源为蛋白胨、硫酸铵、玉米浆中的至少一种；所述碳源在所述发酵培养基中的质量浓度为1％～5％；所述氮源在所述发酵培养基中的质量浓度为0.05％～1％；所述铁皮石斛粉在所述发酵培养基中的质量浓度为0.3％～1.5％，优选为0.5％～1％。进一步优选地，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为蛋白胨和玉米浆的复配物；进一步优选地，所述复配物中蛋白胨与玉米浆的质量比为3:1，所述蛋白胨为大豆蛋白胨；所述碳源在所述发酵培养基中的质量浓度为3％，所述氮源在所述发酵培养基中的质量浓度为0.1％，所述铁皮石斛粉在所述发酵培养基中的质量浓度为0.5％。葡萄糖和蛋白胨、玉米浆可协同提升红曲霉菌的发酵效果，对发酵培养基的成分作上述优选可以保证制备出的铁皮石斛发酵液具有良好的抑制炎症因子NO、TNFα生成的能力以及舒缓和修护皮肤的能力。
优选地，步骤(2)中，所述红曲霉种子液的接种量为0.5％～2％，所述红曲霉种子液的浓度为107～109cfu/mL。
优选地，所述红曲霉种子液由红曲霉菌在PDB液体培养基中活化、扩培所得。
进一步优选地，所述红曲霉种子液的制备方法为：
活化：用接种环挑取红曲霉菌落至PDB液体培养基中，在20～32℃的条件下活化2～6天，得到活化的红曲霉菌悬液；
扩培：以1％～5％的接种量将所述活化的红曲霉菌悬液接种至PDB液体培养基中，在20～32℃的条件下培养2～6天，得到所述红曲霉种子液。
以PDB液体培养基活化、扩培得到的红曲霉种子液对铁皮石斛进行发酵处理，制得的铁皮石斛发酵液的抗炎、舒缓和修护功效相比于其他培养基更优。
此外，本发明还公开了一种铁皮石斛发酵液，所述铁皮石斛发酵液由上述方法制备而成，具有良好的抗炎、舒缓和修护性能。
同时，本发明还公开了所述铁皮石斛发酵液在护肤产品中的应用。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明选用红曲霉发酵铁皮石斛，并对发酵工艺进行优化，得到了具有良好的抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液，并且所述铁皮石斛发酵液的稳定性较好，保存期限较长。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例和对比例所用的菌种、PDB液体培养基和MRS液体培养基的信息如下：
红曲霉菌：
GDMCC 3.77，广东省微生物菌种保藏中心；
GDMCC 3.73，广东省微生物菌种保藏中心；
GDMCC 3.240，广东省微生物菌种保藏中心；
米曲霉菌：
BNCC338380，商城北纳创联生物科技有限公司；
植物乳杆菌：
GDMCC 1.140，广东省微生物菌种保藏中心。
PDB液体培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，蒸馏水补足至1000mL。马铃薯去皮切块煮沸半小时，用纱布过滤，加入蔗糖，融化后补足水至1000mL，121℃灭菌30min，得到PDB液体培养基。
MRS液体培养基(以制备1L的MRS液体培养基为例)：10g蛋白陈、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1ml吐温80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰、蒸馏水加至1L，混合均匀，110℃至130℃灭菌20min至30min，得到MRS液体培养基。
实施例1
本发明所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液的一种实施例，本实施例所述铁皮石斛发酵液的制备方法如下：
(1)将干燥的铁皮石斛茎用粉碎机打碎，过80目的筛，得到铁皮石斛粉；
(2)将铁皮石斛粉、葡萄糖、大豆蛋白胨、玉米浆和水混合均匀，在115℃保温30min进行灭菌处理，得到发酵培养基；所述铁皮石斛粉占发酵培养基的质量分数为0.5％，所述葡萄糖占所述发酵培养基的质量分数为3％，所述大豆蛋白胨和玉米浆的混合物占所述发酵培养基的质量分数为0.1％，所述大豆蛋白胨和玉米浆的质量比为3:1；
(3)用接种环挑取红曲霉菌(GDMCC 3.77)接种于100mL PDB液体培养基中，在28℃条件下活化72h，得到活化的红曲霉菌悬液；将活化的红曲霉菌悬液以3％的接种量接种于PDB液体培养基中，在28℃的条件下培养72h，得到红曲霉种子液，红曲霉种子液的浓度约为108cfu/mL；
(4)将红曲霉种子液以1％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵，发酵过程中通入无菌空气，搅拌桨的转速为130r/min，发酵温度为28℃，发酵时间为48h；发酵完成后在85℃灭菌30min，用硅藻土过滤器过滤，得到所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液。
实施例2～11
本发明所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液的实施例，实施例2～11的制备方法与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中铁皮石斛粉的质量分数或葡萄糖的质量分数或步骤(3)中的发酵温度不同，具体如表1所示。
表1
实施例12～19
本发明所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液的实施例，实施例12～19与实施例1的区别仅在于，发酵培养基中碳源的种类、氮源的种类或红曲霉菌的种类不同，具体如表2所示。
表2
实施例20
本发明所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液的一种实施例，本实施例所述铁皮石斛发酵液的制备方法如下：
(1)将干燥的铁皮石斛茎用粉碎机打碎，过80目的筛，得到铁皮石斛粉；
(2)将铁皮石斛粉、蔗糖、大豆蛋白胨和水混合均匀，在121℃保温15min进行灭菌处理，得到发酵培养基；所述铁皮石斛粉占发酵培养基的质量分数为0.8％，所述蔗糖占所述发酵培养基的质量分数为0.8％，所述大豆蛋白胨占所述发酵培养基的质量分数为0.3％；
(3)用接种环挑取红曲霉菌(GDMCC 3.77)接种于100mL PDB液体培养基中，在30℃条件下活化80h，得到活化的红曲霉菌悬液；将活化的红曲霉菌悬液以2％的接种量接种于PDB液体培养基中，在30℃的条件下培养85h，得到红曲霉种子液，红曲霉种子液的浓度约为109cfu/mL；
(4)将红曲霉种子液以2％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵，发酵过程中通入无菌空气，搅拌桨的转速为120r/min，发酵温度为29℃，发酵时间为50h；发酵完成后在90℃灭菌20min，用硅藻土过滤器过滤，得到所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液。
实施例21
本发明所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液的一种实施例，本实施例所述铁皮石斛发酵液的制备方法如下：
(1)将干燥的铁皮石斛茎用粉碎机打碎，过80目的筛，得到铁皮石斛粉；
(2)将铁皮石斛粉、果葡糖浆、胰蛋白胨和水混合均匀，在118℃保温28min进行灭菌处理，得到发酵培养基；所述铁皮石斛粉占发酵培养基的质量分数为0.4％，所述果葡糖浆占所述发酵培养基的质量分数为4％，所述胰蛋白胨占所述发酵培养基的质量分数为0.08％；
(3)用接种环挑取红曲霉菌(GDMCC 3.77)接种于100mL PDB液体培养基中，在25℃条件下活化52h，得到活化的红曲霉菌悬液；将活化的红曲霉菌悬液以3％的接种量接种于PDB液体培养基中，在25℃的条件下培养52h，得到红曲霉种子液，红曲霉种子液的浓度约为107cfu/mL；
(4)将红曲霉种子液以1.5％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵，发酵过程中通入无菌空气，搅拌桨的转速为150r/min，发酵温度为31℃，发酵时间为40h；发酵完成后在100℃灭菌15min，用硅藻土过滤器过滤，得到所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液。
实施例22
本发明所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液的一种实施例，本实施例所述铁皮石斛发酵液的制备方法如下：
(1)将干燥的铁皮石斛茎用粉碎机打碎，过80目的筛，得到铁皮石斛粉；
(2)将铁皮石斛粉、葡萄糖、硫酸铵和水混合均匀，在115℃保温30min进行灭菌处理，得到发酵培养基；所述铁皮石斛粉占发酵培养基的质量分数为1.2％，所述葡萄糖占所述发酵培养基的质量分数为2％，所述硫酸铵占所述发酵培养基的质量分数为0.3％；
(3)用接种环挑取红曲霉菌(GDMCC 3.77)接种于100mL PDB液体培养基中，在28℃条件下活化72h，得到活化的红曲霉菌悬液；将活化的红曲霉菌悬液以3％的接种量接种于PDB液体培养基中，在28℃的条件下培养72h，得到红曲霉种子液，红曲霉种子液的浓度约为108cfu/mL；
(4)将红曲霉种子液以1％的接种量接种至发酵培养基中进行发酵，发酵过程中通入无菌空气，搅拌桨的转速为150r/min，发酵温度为29℃，发酵时间为55h；发酵完成后在105℃灭菌20min，用硅藻土过滤器过滤，得到所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液。
对比例1
一种铁皮石斛提取液，所述铁皮石斛提取液的制备方法如下：
(1)将干燥的铁皮石斛茎用破碎机进行破碎，过80目筛，得到铁皮石斛粉；
(2)将1g铁皮石斛粉加入199g蒸馏水中，在90℃水浴锅中提取24h，得到铁皮石斛提取粗液；
(3)以布氏漏斗抽滤装置对铁皮石斛提取粗液进行过滤，然后以硅藻土过滤器过滤除去杂质，得到铁皮石斛提取液。
对比例2
一种铁皮石斛发酵液，所述铁皮石斛发酵液的制备方法如下：
(1)将干燥的铁皮石斛茎用粉碎机打碎，过80目的筛，得到铁皮石斛粉；
(2)将1g铁皮石斛粉加入199g蒸馏水中，在90℃水浴锅中提取24h，离心，得到上清液；
(3)将实施例1所述红曲霉种子液加入上清液中进行发酵，发酵过程中通入无菌空气，红曲霉种子液的接种量为上清液质量的1.5％，搅拌桨的转速为150r/min，发酵温度为31℃，发酵时间为40h，发酵完成后将发酵液在100℃灭菌15min，用硅藻土过滤器过滤，得到所述铁皮石斛发酵液。
对比例3
一种铁皮石斛发酵液，所述铁皮石斛发酵液与实施例1的区别仅在于，以米曲霉菌代替红曲霉菌进行发酵。
对比例4
一种铁皮石斛发酵液，所述铁皮石斛发酵液与实施例1的区别仅在于，以植物乳杆菌代替红曲霉菌，以MRS液体培养基代替PDB液体培养基。
对比例5
一种铁皮石斛发酵液，所述铁皮石斛发酵液与实施例1的区别仅在于，以植物乳杆菌代替红曲霉菌。
对比例6
一种铁皮石斛发酵液，所述铁皮石斛发酵液与实施例1的区别仅在于，以MRS液体培养基代替PDB液体培养基。
对比例7
一种铁皮石斛发酵液，所述铁皮石斛发酵液与实施例1的区别仅在于，以金钗石斛茎代替铁皮石斛茎。
对比例8
一种铁皮石斛发酵液，所述铁皮石斛发酵液与实施例1的区别仅在于，以霍山石斛茎代替铁皮石斛茎。
效果验证
1、稳定性测试
将实施例和对比例装于无色透明的PE样品瓶中(每个样品重复3次)，将样品瓶密封并分别放置于0℃、4℃、25℃、45℃、55℃的环境下，分别于第0周、第1周、第2周、第3周、第4周、第5周、第6周、第8周、第12周测定铁皮石斛发酵液的颜色、气味、分层情况，测试结果如表3～32所示。
表3
表4
表5
表6
表7
表8
表9
表10
表11
表12
表13
表14
表15
表16
表17
表18
表19
表20
表21
表22
表23
表24
表25
表26
表27
表28
表29
表30
表31
表32
由上述测试结果可知，发酵原料在发酵培养基中的质量分数会对铁皮石斛发酵液的稳定性产生较大的影响，当发酵原料铁皮石斛粉在发酵培养基中的含量为0.3％～1％时保存12周后仍然具有良好的稳定性，当铁皮石斛粉的添加量过多，在保存8周、甚至4周后铁皮石斛发酵液中会出现絮状物，稳定性较差。此外，发酵菌种也会影响铁皮石斛发酵液的稳定性，当发酵菌种为米曲霉菌时，铁皮石斛发酵液的稳定性较差，在45℃及55℃保存8周后会出现少量絮状物。
2、总糖含量的检测
检测方法：
A.原理：
铁皮石斛的多糖在硫酸的作用下，先水解成单糖，并脱水生成糖醛衍生物，与苯酚生成橙黄色溶液，并在488nm处有最大吸收，吸收值与糖含量呈线性关系。
B.实验步骤：
标准曲线绘制：准确称取一定量的葡萄糖置于105℃烘箱中，烘干至恒重，得到葡萄糖标准品。精密称取10.3mg葡萄糖标准品，加水溶解定容至10mL，制成浓度为1.03mg/mL的标准溶液，备用。从浓度为1.03mg/mL的标准溶液中用移液管分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL的容量瓶中，加水定容至刻度，分别得到浓度为0.0206、0.0412、0.0618、0.0824、0.0103mg/mL的系列标准葡萄糖溶液。
分别用移液管吸取上述系列标准葡萄糖溶液2mL，置于具塞试管中，以2mL的蒸馏水作为空白对照，均加入5％苯酚溶液1mL，摇匀，缓慢滴加5mL浓硫酸，旋上盖子，摇匀，置于沸水浴中煮沸20min左右，取出迅速冷却至室温，在488nm处测定各浓度葡萄糖的吸光度A。以各管标准葡萄糖的吸光度A作为纵坐标，各管标准葡萄糖的浓度作为横坐标，绘制标准曲线。
样品含量测定：吸取2.0mL样品液(实施例1～22，对比例1～8的提取液或发酵液，稀释成质量分数为0.1％的溶液，即稀释1000倍)，按上述步骤测定OD值，并代入标准曲线计算样品中的总糖含量。测试结果如表33所示。
表33
由表33可知，实施例1～22所述铁皮石斛发酵液中总糖含量明显高于对比例。对比例1为铁皮石斛水提液，功效成分的提取率较低，总糖含量明显低于本发明所述铁皮石斛发酵液。对比例2的发酵原料为铁皮石斛水提后的上清液，所得产物中总糖含量也很低。对比例3所述铁皮石斛发酵液的发酵菌种为米曲霉菌，其发酵效果明显不如红曲霉菌，总糖含量约为实施例1的40％。对比例4～6的发酵菌种和/或使用的培养基与实施例1不同，功效成分的含量很低。由对比例3～6的测试结果可知，发酵菌种及菌种的活化、扩培用培养基不同都会对铁皮石斛中功效成分的释放产生较大的影响，本发明通过实验发现，当选用红曲霉菌对铁皮石斛进行发酵，并选用PDB液体培养基对红曲霉菌进行活化、扩培，得到的产物中功效成分的含量最多。对比例7～8分别选用了金钗石斛茎和霍山石斛茎作为发酵原料，其制备的发酵液中总糖含量比铁皮石斛发酵液少。
此外，对比实施例1～5的测试结果可以发现，随着发酵培养基中铁皮石斛粉含量的增加，总糖含量逐渐增加，但当铁皮石斛粉的质量分数增加到0.5％后，总糖含量的增长程度随着的铁皮石斛粉质量分数的增加变缓。对比实施例1、实施例6～8的测试结果可以发现，碳源的含量会对发酵结果产生较大的影响，碳源的质量分数为3％时，发酵液中总糖含量最高。对比实施例1、实施例9～11的测试结果可以发现，实施例1和实施例10的总糖含量相对较高，该结果表明，发酵温度优选为28～30℃。对比实施例1、实施例12～17的测试结果可以发现，发酵培养基中碳源优选葡萄糖，氮源优选蛋白胨和玉米浆的复配物，二者可协同提升发酵培养液中功效成分的含量；优选地，当蛋白胨和玉米浆的质量比为3:1、蛋白胨为大豆蛋白胨时，发酵液中总糖含量更高。对比实施例1、实施例18～19的测试结果可以发现，当红曲霉菌为GDMCC 3.77时，发酵效果更好，更有利于铁皮石斛中功效成分的释放。
3、抗炎、舒缓测试：NO含量测定
通过Griess法测定细胞产生NO含量(NO是炎症介质之一，容易引发机体的炎症反应)。
实验试剂：高糖DMEM、胎牛血清、脂多糖LPS(索莱宝)、NO含量试剂盒(碧云天)
实验材料：细胞系：小鼠Raw264.7细胞；培养液：含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基；培养条件：37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养。
实验步骤：
细胞培养：将细胞接种于48孔细胞培养板，每孔细胞数为1×105个，培养24h。
暴露：弃去孔中原培养液，样品组各孔加不同浓度的样品溶液。样品组分别加入实施例1～22和对比例1～8所述提取液或发酵液(给药浓度依次为1％、3％)的水溶液，所述水溶液中还含有10ng/mL的LPS；LPS组为LPS浓度为10ng/mL的水溶液；空白对照组中加入同等量的培养液，培养24小时。
NO含量测试：吸取培养基，离心取上清液，测试上清液中NO的含量。NO的含量越低，说明抗炎、舒缓效果越好。上清液中NO相对含量的测试结果如表34所示。
表34
由表34可知，在铁皮石斛发酵液的浓度为1％、3％的情况下，实施例1～22均表现出较好的抑制炎症因子NO生成的能力。对比实施例1～5的测试结果可以发现，实施例3～5的抑制炎症因子NO生成的能力较高，表明随着铁皮石斛粉含量的增加，发酵液的抗炎、舒缓效果越好，但当铁皮石斛粉的质量分数达到1.5％后，抗炎效果的提升幅度减缓。对比实施例1和实施例9～11的测试结果可以发现，发酵温度优选为28～30℃。对比实施例1和实施例12～17的测试结果可以发现，发酵培养基中碳源、氮源的种类会对发酵液的抗炎、舒缓效果产生极大的影响，当碳源为葡萄糖、氮源为蛋白胨和玉米浆的复配物时，抗炎、舒缓效果最佳。对比实施例1和实施例18～19的测试结果可以发现，红曲霉菌优选为GDMCC 3.77。
4、抗炎、舒缓测试：TNFα含量测定
(1)实验原理：巨噬细胞是免疫效应细胞，具有多种免疫调节功能，因此常被作为一种理想的模型来评价一些生物活性物质的免疫调节性能。当机体中存在过量的细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)时，会诱导巨噬细胞释放TNFα、NO、ILs等炎症介质，进而引发机体的炎症反应。其中，TNFα可以促进T细胞产生各种炎症因子促进炎症反应，是重要的炎症因子之一。通过LPS体外刺激巨噬细胞建立炎症模型，研究化妆品原料的抗炎功效，是研究炎症因子的经典细胞模型。
TNFα含量的测定采用酶联免疫方法(ELISA)，具体原理为：TNFα与包被在酶标板上的TNFα抗体特异性结合后，与带有底物标记的抗TNFα抗体结合，底物被酶催化后，生成有色产物，TNFα含量与有色产物颜色的深浅呈正相关。用酶标仪450nm波长下测定光密度值(OD)，计算TNFα含量。
(2)试验材料
细胞系：小鼠巨噬细胞Raw 264.7；
培养液：含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。
(3)试验步骤
细胞培养：将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔细胞数为3×104个，培养24h。
暴露：弃去孔中原培养液，样品组各孔加不同浓度的样品溶液、阳性对照。其中，样品组分别加入实施例1～19和对比例1～8所述发酵液或提取液的水溶液(给药浓度依次为1％、3％)，样品溶液中还含有10ng/mL的LPS；阳性对照组为地塞米松浓度为10μM、LPS浓度为10ng/mL的水溶液(地塞米松可以减缓LPS对细胞的刺激，减少TNFα的含量)；LPS组为LPS浓度为10ng/mL的水溶液；空白对照组中加入同等量的培养液，培养24小时。
ELISA测试：吸取培养基，离心取上清液，测试上清液中TNFα的含量。TNFα的含量越低，说明抗炎、舒缓效果越好。上清液中TNFα相对含量的测试结果如表35所示。
表35
由表35可知，实施例1～22的浓度为1％时，TNFα的相对含量均低于80％，浓度为3％时，TNFα的相对含量均低于41％，具有良好的抑制炎症因子TNFα生成的能力。
对比实施例1～5的测试结果可以发现，实施例3～5的抑制炎症因子TNFα生成的能力较高，表明随着铁皮石斛粉含量的增加，抑制能力越强。对比实施例1和实施例9～11的测试可以发现，发酵温度优选为28～30℃。对比实施例1和实施例12～17的测试结果可以发现，发酵培养基中碳源为葡萄糖、氮源为蛋白胨和玉米浆的复配物时，制备的发酵液的抗炎、舒缓性能最优。对比实施例1和实施例18～19的测试结果可以发现，红曲霉菌优选为GDMCC 3.77。
5、舒缓、修护测试：人体功效测试-乳酸刺痛试验(lactic acid tingling test，LAST)
测试对象：18～45岁、敏感肌皮肤的志愿者320名(每一样品10个人使用)。
测试步骤：
(1)建模
在志愿者两侧鼻唇沟处分别贴敷乳酸贴片(10wt％乳酸溶液浸润的凝胶面膜布)，当志愿者感受到的刺激分值到达≥1.5分时，去除贴片。其中，评分标准为：0-没有痛感，1-轻度刺痛，2-中度刺痛，3-重度刺痛，刺痛感觉位于轻度刺痛与中度刺痛之间时，评分为1.5分。
(2)测试仪器：皮肤水分流失测试探头Tewameter TM300，Courage&Khazaka，德国；皮肤血红素测试探头Mexameter MX18，Courage&Khazaka，德国。
(3)产品应用
以贴敷乳酸贴片的区域为测试区域(其中一区域为空白对照)，在测试区域涂抹0.1g浓度为5wt％实施例1～22和对比例1～8所述铁皮石斛发酵液和铁皮石斛提取液。涂样品1h后测试志愿者的皮肤经皮水分流失值TEWL和皮肤血红素EI。数据记为初始值、1h。皮肤经皮水分流失值越高、皮肤血红素值越高，表示皮肤屏障受损越明显，皮肤越敏感。皮肤经皮水分流失值降低，说明皮肤屏障得到修复；皮肤血红素值降低，说明皮肤泛红情况得到改善。
皮肤经皮水分流失变化率＝(使用1h后皮肤经皮水分流失值-使用前皮肤经皮水分流失值)/使用前皮肤经皮水分流失值×100％；
皮肤血红素变化率＝(使用1h后皮肤血红素值-使用前皮肤血红素值)/使用前皮肤血红素值×100％。
皮肤经皮水分流失值测试结果如表36所示，皮肤血红素值测试结果如表37所示。
表36
表37
由表36和表37可知，在使用铁皮石斛发酵液的1h后，实施例1～22的皮肤经皮水分流失值和皮肤血红素值均降低，说明实施例1～22均表现出较好的舒缓和修护的能力。对比实施例1～5的测试结果可以发现，实施例3～5的皮肤经皮水分流失变化率和皮肤血红素变化率更大，表明随着铁皮石斛粉含量的增加，发酵液的舒缓、修护效果越好，但当铁皮石斛粉的质量分数达到1.5％后，舒缓、修护效果的提升幅度减缓。对比实施例1和实施例9～11的测试结果可以发现，发酵温度优选为28～30℃。对比实施例1和实施例12～17的测试结果可以发现，发酵培养基中碳源、氮源的种类会对发酵液的舒缓、修护效果产生极大的影响，当碳源为葡萄糖、氮源为蛋白胨和玉米浆的复配物时，舒缓、修护效果最佳。对比实施例1和实施例18～19的测试结果可以发现，红曲霉菌优选为GDMCC3.77。
由上述测试结果可知，以本发明所述方法制备出的铁皮石斛发酵液具有良好的抗炎性能，适合应用于护肤产品中。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但并不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将铁皮石斛粉、碳源、氮源、水混合均匀，得到发酵培养基；
(2)将红曲霉种子液接种至所述发酵培养基中进行发酵，发酵温度为24～32℃，发酵时间为24～72h，得到发酵产物；
(3)对所述发酵产物进行灭菌、过滤处理，得到所述具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述铁皮石斛粉由铁皮石斛茎制备而成；所述铁皮石斛粉、碳源、氮源、水混合均匀后进行灭菌处理，得到所述发酵培养基。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果葡糖浆、麦芽糖中的至少一种；所述氮源为蛋白胨、硫酸铵、玉米浆中的至少一种；所述碳源在所述发酵培养基中的质量浓度为1％～5％；所述氮源在所述发酵培养基中的质量浓度为0.05％～1％；所述发酵原料在所述发酵培养基中的质量浓度为0.3％～1.5％。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为蛋白胨和玉米浆的复配物；所述碳源在所述发酵培养基中的质量浓度为3％，所述氮源在所述发酵培养基中的质量浓度为0.1％，所述铁皮石斛粉在所述发酵培养基中的质量浓度为0.5％。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述复配物中蛋白胨和玉米浆的质量比为3:1，所述蛋白胨为大豆蛋白胨。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述红曲霉种子液的接种量为0.5％～2％，所述红曲霉种子液的浓度为107～109cfu/mL。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵温度为28～30℃，发酵时间为42～72h。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述红曲霉种子液由红曲霉菌在PDB液体培养基中活化、扩培所得；所述活化方法为：用接种环挑取红曲霉菌落至PDB液体培养基中，在20～32℃的条件下活化2～6天，得到活化的红曲霉菌悬液；所述扩培方法为：以1％～5％的接种量将所述活化的红曲霉菌悬液接种至PDB液体培养基中，在20～32℃的条件下培养2～6天，得到所述红曲霉种子液。
9.一种具有抗炎、舒缓和修护功效的铁皮石斛发酵液，其特征在于，由如权利要求1～8任一项所述方法制备而成。
10.一种如权利要求9所述铁皮石斛发酵液在护肤产品中的应用。
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