CN111053711A - 一种灵芝益生菌复合发酵产物、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种灵芝益生菌复合发酵产物、制备方法及其应用，所述灵芝益生菌复合发酵产物包括灵芝发酵上清液、益生菌发酵液和功效营养成分，所述制备方法是先将灵芝菌丝体发酵、离心后取上清液与功效营养成分混合，然后将益生菌发酵液加入其中进行发酵，最后发酵产物经灭活或离心制得本发明所述的复合发酵产物，所述发酵产物中含有丰富的多糖、多肽以及有机酸等营养成分，容易被肌肤充分吸收，且含有的微量元素等成分，可促进受伤肌肤的修复和恢复，对皮肤有良好的保养效果。本发明所述复合发酵产物不仅有益肌肤健康，而且不受酶和化学品等污染，整个发酵体系条件温和、操作简单且成本可控，有利于实现大规模生产。

Description

一种灵芝益生菌复合发酵产物、制备方法及其应用
【技术领域】
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种灵芝益生菌复合发酵产物、制备方法及其应用。
【背景技术】
灵芝(Ganoderma lucidum)属担子菌纲，多孔菌目，多孔菌科，灵芝属，是一种在民间及临床应用广泛且具有极高药用价值的名贵药用真菌。灵芝具有广泛的药理活性，灵芝含有丰富的微量元素、氨基酸及多种功效成分，研究证实，灵芝含有银、铝、硼、钙、铜、铁、钾、钠、镁、锰、铅、锌锗等元素，还含有17种氨基酸。灵芝含有的有效成分为: 有机锗(含量800-2000ppm，是人参的4-5倍)、麦角甾醇、溶菌酶和酸性蛋白酶、高分子多糖、多基肽、腺嘌呤核苷、尿嘧啶、尿苷、灵芝酮、醛、香豆精、三萜类化合物等，具有调节神经系统、心血管系统、呼吸系统的作用；对蛋白质、核酸的合成具有增效作用；且能促进细胞的分裂繁殖，刺激人体非特异抗性、免疫特异反应性，以及抑制肿瘤生理活性化合物产生，强化人体免疫系统，提高对疾病抵抗力的功能。
爱美之心人皆有之，化妆品从诞生之日起，随着化学物质类化妆品长期使用所显现出的弊端和危害，人们更加关注健康、安全的化妆品原料。因此，寻找、开发安全、健康、无刺激、有效的化妆品原料对化妆品行业的发展，具有重大的意义。
随着对灵芝的深入研究，证实灵芝具有非常好的抗氧化、促排毒的作用，对肌肤的保养和维护具有良好的作用；因此，越来越多的人研究将灵芝用于化妆品的开发，目前已有将灵芝用于化妆品的报道，但是现有的灵芝作为化妆品应用时其抗氧化和美白效果不明显，而且制备成本很高。
【发明内容】
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于，提供一种生产成本低、营养成分丰富的灵芝益生菌复合发酵产物，并提供所述发酵产物的制备方法及其作为护肤品的应用。
为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：
一种灵芝益生菌复合发酵产物，所述复合发酵产物是以灵芝发酵上清液为主要培养基，添加功效营养成分后接种益生菌进行二次发酵的产物，其中灵芝发酵上清液的添加质量为总发酵体系的80％～92％，益生菌发酵液的添加质量为总发酵体系的2％～4％，功效营养成分的添加质量为总发酵体系的6％，发酵体系不足100％时，加水补至100％。
优选地，所述发酵体系中灵芝发酵上清液的添加质量为总发酵体系的92％，益生菌发酵液的添加质量为总发酵体系的2％，功效营养成分的添加质量为总发酵体系的6％。
优选地，所述复合发酵产物包括复合发酵产物上清液或复合发酵灭活产物。
优选地，所述益生菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus) PBIL3-003；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0015已于2014年1月16 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2014029；所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)PBIL2-003已于2018年4月 16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018208；所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)PBIL3-003已于2018年4 月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为 CCTCC NO：M 2018206；此三株菌可在此发酵体系中稳定增长，并促进发酵体系中营养成分的富集和释放。
优选地，所述植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003的添加质量比为：(2～3):(1～1.5):1，在此比例范围内混合发酵菌株活性最高。
优选地，所述功效营养成分及其添加比例为：所述功效营养成分的主要成分及其添加比例为：低聚果糖2％、葡萄糖1.8％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、醋酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.045％、硫酸锰0.05％、碳酸钙0.005％。
本发明还提供了一种灵芝益生菌复合发酵产物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)制备益生菌发酵液：将上述益生菌各菌种分别经培养活化、一级种子培养制得一级种子液，然后对一级种子液进行发酵培养，得益生菌发酵液；
(2)灵芝菌丝体的液体发酵培养：将灵芝菌丝体接种至液体培养基中培养，培养结束后离心、取上清获得灵芝菌丝体发酵上清液；
(3)向步骤(2)制得的灵芝菌丝体发酵滤液中加入功效营养成分，121℃灭菌20min后，按比例加入步骤(1)制得的益生菌发酵液，进行发酵培养，得灵芝益生菌复合发酵混合物；
(4)将步骤(3)制得的复合发酵混合物进行离心得复合发酵产物上清液；
(5)将步骤(3)中制得的复合发酵混合物进行灭活得复合发酵灭活产物。
优选地，步骤(1)中益生菌的培养活化培养基为改良的M6培养基，成分为：酪蛋白胨10g，牛肉浸粉10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，乳糖0.5g，吐温-80 1g，1.5％琼脂2g，纯净水1L；一级种子培养基以及发酵培养基为不加琼脂的改良M6培养基；所述培养基的制备条件为：pH6.5，121℃灭菌20min。
优选地，益生菌的培养活化条件为：37℃条件下，斜面静置培养22～26h；挑菌接种获得一级种子液，种子液按2％的接种量接种进行益生菌发酵液的制备；一级种子液及益生菌发酵液的培养条件均为为：37℃条件下，静置培养22-24h。
优选地，步骤(2)中所述液体培养基的主要成分为2％土豆全粉，2％葡萄糖，0.3％磷酸二氢钾，0.15％硫酸镁，6mg\L维生素B1。
优选地，步骤(2)中所述灵芝菌丝体液体发酵的培养条件为：28℃，160r/min，震荡培养5-7天。
优选地，步骤(2)中所述离心条件为：5000r/min，离心半径6～12cm，离心时间为15～30min。
优选地，步骤(3)中所述发酵培养的条件为：37℃条件下，静置培养12-24h。
优选地，步骤(4)中所述离心条件为：5000～10000r/min，离心15～20min。
优选地，步骤(5)中所述灭活条件为：温度121℃，灭活时间15-20min。
本发明还提供了一种所述发酵产物作为化妆品的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的灵芝益生菌复合发酵产物含有丰富的灵芝多糖、小分子氨基酸及多种小肽类成分，灵芝多糖可提高机体抗氧化能力，清除肌肤产生的自由基，预防因自由基氧化损伤引起的肌肤老化，色素沉积问题；小分子氨基酸及小肽类成分可促使肌肤快速吸收，补充肌肤所需的营养成分，保持肌肤弹性，减少皱纹及暗纹的产生；
(2)本发明提供的灵芝益生菌复合发酵产物还含有大量的维生素类以及磷脂、有机酸类成分，不仅可以维持皮肤益生菌菌群的动态平衡，构建保护皮肤免受化学或物理损伤的生物天然屏障，而且，其中含有的多种维生素、磷脂类成分可补充肌肤所需营养，提高皮肤抵抗外界及内在损伤的能力，维持肌肤的光滑、弹性；
(3)本发明提供的灵芝益生菌复合发酵产物，其制备过程中所用原料均为食品级成分，无外源酶类或激素的添加，利用微生物代谢产生的有效成分进行产品的开发，安全、无刺激，能更好呵护娇弱肌肤；
(4)本发明提供的灵芝益生菌复合发酵产物，利用真菌和益生菌的益生功能，通过复合双重发酵的方式进行生物化处理，充分富集功效成分，处理方式柔和，工艺操作简单，容易实现规模化生产；
(5)本发明所述灵芝益生菌复合发酵产物利用灵芝菌丝体进行发酵大大降低了生产成本，提高了发酵产率。
保藏说明：
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0015已于2014年1月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2014029；
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)PBIL2-003已于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2018208；
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)PBIL3-003已于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2018206。
【附图说明】
图1是本发明所述发酵产物DPPH清除率的检测结果示意图；
图2是本发明所述发酵产物羟自由基清除率的检测结果示意图；
图3是本发明所述发酵产物体外酪氨酸酶活性抑制效果的检测结果示意图；
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的限制，应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1初步筛选
发酵产物中含有丰富的营养成分，本试验主要针对植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003在不同添加比例下对发酵产物中的营养成分的影响，确定植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003 的最优比。
1、试验方法
首先，按照如下步骤制备灵芝益生菌复合发酵产物(包括复合发酵产物上清液和复合发酵灭活产物)
(1)制备乳杆菌培养基(培养活化培养基、一级种子培养基和发酵培养基)：所述培养活化培养基为改良的M6培养基：酪蛋白胨10g，牛肉浸粉10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，乳糖0.5g，吐温-80 1g，1.5％琼脂2g，纯净水1L，所述培养基的制备条件为：pH6.5，121℃灭菌20min；所述一级种子培养基和发酵培养基为不加琼脂的改良M6培养基；
(2)将植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003分别置于步骤(1)制得的培养活化培养基中于37℃条件下，静置培养22-26h得活化培养物，并于活化培养物中挑取菌落接种于一级种子培养基中，37℃条件下，静置培养22-24h，制得一级种子液，种子液按照2％的接种量接种至发酵培养基中置于37℃条件下，静置培养22-24h得益生菌发酵液；
(3)将灵芝菌丝体接种至液体培养基中置于28℃，160r/min，震荡培养5-7天，培养结束后置于离心机中离心，离心条件为5000r/min，离心半径8cm，离心时间为20min，离心结束后取上清即得灵芝菌丝体发酵上清液；其中，所述液体培养基的主要成分为：2％土豆全粉，2％葡萄糖，0.3％磷酸二氢钾，0.15％硫酸镁，6mg\L维生素B1；
(4)取步骤(3)制得的灵芝菌丝体发酵上清液，并向其中加入功效营养成分，121℃灭菌20min后，加入步骤(2)制得的益生菌发酵液，37℃条件下，静置培养22-24h，得复合发酵混合物；
(5)取步骤(4)制得的复合发酵混合物进行离心，离心条件为：5000r/min，离心15min，取上清液，得发酵产物上清液；
(6)取步骤(4)中制得的复合发酵混合物置于121℃条件下，灭活15-20min得复合发酵灭活产物。
其中，步骤(3)中灵芝菌丝体发酵上清液的添加质量为总发酵体系的92％，功效营养成分的添加质量为总发酵体系的6％，益生菌发酵液的添加质量为总发酵体系的2％。
然后，分别参照标准GB/T 5009.8、GB 5009.5、GB/T 5009.124测定植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003在不同添加比例下(表1 中T1～T9)制得的发酵产物中多糖、多肽以及黄酮三种营养成分的含量，确定优选的添加比例。
2、试验结果如表1所示：
表1发酵产物上清液及灭活发酵产物中各营养成分检测结果
Figure RE-GDA0002407391130000051
Figure RE-GDA0002407391130000061
注：表中试验分组T1～T9中不同比例指的是按照实施例1中的方法在其他条件保持不变的情况下，植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003 的比值。
由表1中检测结果可知，植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003按照(2～3):(1～1.5):1的比例添加进行发酵处理后，发酵产物中各营养成分的含量均高于其他比例条件下制备的产物，由此确定植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003的优选比为(2～3):(1～1.5):1。
实施例2
一种灵芝益生菌复合发酵产物的制备方法，所述制备方法同实施例1，区别在于：步骤(2)中植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003的添加质量比为2:1.5:1；
步骤(3)中灵芝菌丝体发酵上清液的添加质量为总发酵体系的80％，功效营养成分的添加质量为总发酵体系的6％，益生菌发酵液的添加质量为总发酵体系的2％，其余为水。
实施例3
一种灵芝益生菌复合发酵产物的制备方法，所述制备方法同实施例1，区别在于：步骤(2)中植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003的添加质量比为2:1:1；
步骤(3)中灵芝菌丝体发酵上清液的添加质量为总发酵体系的85％，功效营养成分的添加质量为总发酵体系的6％，益生菌发酵液的添加质量为总发酵体系的3％，其余为水。
实施例4
一种灵芝益生菌复合发酵产物的制备方法，所述制备方法同实施例1，区别在于：步骤(2)中植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003的添加质量比为3:1.5:1；
步骤(3)中灵芝菌丝体发酵上清液的添加质量为总发酵体系的90％，功效营养成分的添加质量为总发酵体系的6％，益生菌发酵液的添加质量为总发酵体系的3.5％，其余为水。
实施例5
一种灵芝益生菌复合发酵产物的制备方法，所述制备方法同实施例1，区别在于：步骤(2)中植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003的添加质量比为3:1:1；
步骤(3)中灵芝菌丝体发酵上清液的添加质量为总发酵体系的90％，功效营养成分的添加质量为总发酵体系的6％，益生菌发酵液的添加质量为总发酵体系的4％。
对比例1
将灵芝菌丝体接种至液体培养基中置于28℃震荡培养5-7天，培养结束后置于离心机中离心，离心条件为5000r/min，离心半径8cm，离心时间为20min，离心结束后取上清即得灵芝菌丝体发酵上清液；其中，所述液体培养基的主要成分为：2％土豆全粉，2％葡萄糖，0.3％磷酸二氢钾，0.15％硫酸镁，6mg\L维生素B1。
对比例2
一种灵芝益生菌复合发酵产物上清液的制备方法，所述方法同实施例2，区别在于，步骤(3)中灵芝菌丝体发酵上清液的添加质量为总发酵体系的70％，功效营养成分的添加质量为总发酵体系的6％，益生菌发酵液的添加质量为总发酵体系的2％，其余为水。
对比例3
一种灵芝益生菌复合发酵产物上清液的制备方法，所述方法同实施例2，区别在于，步骤(3)中灵芝菌丝体发酵上清液的添加质量为总发酵体系的93％，功效营养成分的添加质量为总发酵体系的6％，益生菌发酵液的添加质量为总发酵体系的1％。
试验例1
在植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003的优选比范围内，测定灵芝发酵上清液在不同添加比例下，复合发酵产物中的营养成分。
1、试验方法
分别参照标准按照GB/T 5009.8、GB 5009.5、GB/T 5009.124测定实施例2～5和对比例1～3制备的发酵产物中多糖、多肽以及黄酮三种营养成分的含量。
2、试验结果如表2所示：
表2发酵产物中各营养成分检测结果
Figure RE-GDA0002407391130000081
由表2中检测结果可知，灵芝发酵上清液在80％～92％的添加比例下，制得的发酵产物中营养成分含量最高，且差异不大；当灵芝发酵上清液的添加比例在80％～92％范围外，营养成分明显降低，由此确定植灵芝发酵上清液的最佳添加范围为80％～92％。
试验例2发酵产物的安全性测定
人体斑贴试验是检测化妆品对肌肤有无刺激性的有效方法，本试验采用人体斑贴试验对发酵产物进行肌肤的刺激性检测，确定发酵产物的使用安全性。
1、试验对象：
选择18～50岁符合试验要求的志愿者作为受试对象。
2、试验方法：
分别取0.03ml实施例1～5制得的复合发酵产物滴加在滤纸片上，并将该滤纸片置于斑试器内，并设置空白对照，将加有受试物的斑试器用无刺激胶带贴敷于受试者的背部和前臂内侧，一侧为空白对照区，一侧为试验区，用手掌轻压使之均匀的贴敷于皮肤上，持续 24h、48h。试验时间结束后，去除受试物斑试器后30min，待压痕消失后观察皮肤反应，并根据表3贴斑试验皮肤不良反应分级标准进行刺激性评价。
表3斑贴试验皮肤不良反应分级标准
皮肤不良反应 分级
无反应 0
淡红斑 1
红斑、浸润、丘疹 2
红斑、水肿、丘疹、水疱 3
红斑、水肿、大疱 4
根据《化妆品卫生规范2007》，人体斑贴试验判断标准为：30例受试者中出现1级皮肤不良反应的人数多于5例，或二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例三级或三级以上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不良反应。
1、结果分析，试验结果见表4
表4人体斑贴试验反应结果
Figure RE-GDA0002407391130000091
Figure RE-GDA0002407391130000101
经人体斑贴试验证明：受试者对受试物无不良反应，该发酵产物用于人体是安全的、不会对皮肤产生刺激性。
试验例3：发酵产物的抗氧化能力测定-DPPH清除率
众所周知，所述发酵产物中营养成分越高，其对DPPH的抑制率越高，所以在此仅对实施例2以及对比例1制备的发酵产物在添加比例为20％，40％，60％，80％，100％条件下对DPPH的清除能力进行测定。
1、试验方法：
向1mLDPPH甲醇溶液(0.2mmol/L)中加入1mL受试样本，室温下置黑暗环境中反应30min，在517nm波长处测吸光度，并根据公式(1)计算DPPH清除率。
DPPH清除率(％)＝[1—A1/A0]×100％ (1)
式中，A1为DPPH甲醇溶液+受试样本的吸光度；A0为DPPH甲醇溶液+去离子水的吸光度。
试验结果如图1所示，由图1可知：不同添加比例条件下，实施例2和对比例1制备的发酵产物对DPPH均有较好的清除能力，且随着添加比例的增加，抗氧化性能越强；而且由图1可知实施例2制备的发酵产物清除率显著高于对比例1，且呈现出良好的稳定性；由此证实，灵芝发酵上清液经益生菌发酵后，具有很好的抗氧化性能，而且在本发明保护范围内制备的发酵产物的抗氧化性能更高。
试验例4：发酵产物的抗氧化能力测定-羟自由基清除率
众所周知，所述发酵产物中营养成分越高，其对DPPH的抑制率越高，所以在此对选择实施例2以及对比例1制备的发酵产物在添加比例为20％，40％，60％，80％，100％条件下对羟自由基的清除能力进行测定。
1、试验方法：
向1mL PBS(pH7.4)中加入1ml邻菲啰啉，1mL FeSO4(2.5mmol/L)；1ml H2O2(20mmol/L)，再加入0.5mL受试样本，37℃反应1.5h后，在536nm波长处测吸光度，并根据公式(2)计算羟自由基清除率。
羟自由基清除率(％)＝[(A4—A3)/(A2-A3)]×100％ (2)
式中，A2为PBS+邻菲啰啉+FeSO4的吸光度；A3为PBS+邻菲啰啉+FeSO4+H2O2的吸光度；A4为PBS+邻菲啰啉+FeSO4+H2O2+受试样本的吸光度。
2、试验结果分析
试验结果如图2所示，由图2可知，不同添加比例条件下，实施例2制备的发酵产物对羟自由基均具有较好的清除能力，实施例2制备的发酵产物对羟自由基的清除效果显著高于对比例1，说明灵芝发酵上清液经益生菌发酵后，对羟自由基的清除能力显著提升，具有很好的抗氧化性能，进一步说明本发明制备的发酵产物对氧化损伤引起的皮肤问题具有很好的改善作用，可以应用到化妆品中起到抗氧化的作用。
试验例5：体外酪氨酸酶活性抑制试验
酪氨酸酶是黑素生成的关键酶，它控制着黑素的形成过程，其活性程度对色素的沉积起主要作用；目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用，故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。维生素C作为优秀的抗氧化原料，对酪氨酸酶活性抑制显著，可有效防止黑色素的产生，为验证本发明是否对美白有作用，以维生素C为阳性对照，进行酪氨酸酶的体外活性抑制试验。
1、试验方法：
众所周知，所述发酵产物中营养成分越高，其对酪氨酸酶的抑制率越高，所以在此仅测定实施例2以及对比例1制备的发酵产物对酪氨酸酶的抑制率，并以维生素C为阳性对照。
采用酪氨酸酶多巴速率氧化法进行测定：对于每个处理分别取4根试管，编号分别为 5、6、7、8，按照表5在相应的试管中加入各物质，首先加入PBS(pH＝6.8，25mmol/L)，再加入待测液和酪氨酸酶，放入37℃水浴中保温10min后加入0.98g/L的L-多巴溶液，立即放入分光光度计中每隔30s测定溶液在475nm处的吸光度值；并按照公式(3)计算实施例2、4和对比例1制备的发酵产物在不同添加比例下对酪氨酸酶的抑制率：
酪氨酸酶活性抑制率＝(A5-A6)-(A7-A8)/(A5-A6)*100％ (3)
其中，A5为5号试管反应3min时测得的吸光度值；
A6为5号试管反应3min时测得的吸光度值；
A7为7号试管反应3min时测得的吸光度值；
A8为8号试管反应3min时测得的吸光度值。
表5各试管中物质的加入量
Figure RE-GDA0002407391130000121
2、结果分析：
由图3可知，本申请实施例2制备的发酵产物(灭活发酵产物和)对酪氨酸酶的抑制率与维生素C相当，具有较好的抑制酪氨酸酶的能力，对比例1制备的发酵产物对酪氨酸酶的抑制能力明显偏弱，说明灵芝发酵上清液经益生菌发酵后，对酪氨酸酶的抑制能力显著提升，进一步说明本发明制备的发酵产物可应用到化妆品中，起到美白的作用。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种灵芝益生菌复合发酵产物，其特征在于，所述复合发酵产物是指以灵芝发酵上清液为主要培养基，添加功效营养成分后接种益生菌进行二次发酵的产物，其中灵芝发酵上清液的添加质量为总发酵体系的80％～92％，功效营养成分的添加质量为总发酵体系的6％，益生菌发酵液的添加质量为总发酵体系的2％～4％，其余为水。
2.根据权利要求1所述的一种灵芝益生菌复合发酵产物，其特征在于，所述灵芝益生菌复合发酵产物包括复合发酵产物上清液或复合发酵灭活产物。
3.根据权利要求2所述的一种灵芝益生菌复合发酵产物，其特征在于，所述益生菌包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)PBIL3-003；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)BLCC2-0015已于2014年1月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2014029；所述嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)PBIL2-003已于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018208；所述鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)PBIL3-003已于2018年4月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2018206。
4.根据权利要求3所述的一种灵芝益生菌复合发酵产物，其特征在于，所述植物乳杆菌BLCC2-0015、嗜酸乳杆菌PBIL2-003和鼠李糖乳杆菌PBIL3-003的添加质量比为：(2～3):(1～1.5):1。
5.根据权利要求1所述的一种灵芝益生菌复合发酵产物，其特征在于，所述功效营养成分的主要成分及其添加比例为低聚果糖2％、葡萄糖1.8％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、醋酸钠0.5％、磷酸氢二钾0.1％、硫酸镁0.045％、硫酸锰0.05％、碳酸钙0.005％。
6.权利要求1～5任一项所述的灵芝益生菌复合发酵产物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)制备益生菌发酵液：将上述益生菌各菌种经培养活化、一级种子培养，制得一级种子液，再进行发酵培养，得益生菌发酵液；
(2)灵芝菌丝体的液体发酵培养：将灵芝菌丝体接种至液体培养基中培养，培养结束后离心、取上清获得灵芝菌丝体发酵上清液；
(3)向步骤(2)制得的灵芝菌丝体发酵上清液中加入功效营养成分，121℃灭菌20min后，按添加比例加入步骤(1)制得的益生菌发酵液，进行发酵培养，得灵芝益生菌复合发酵混合物；
(4)将步骤(3)制得的复合发酵混合物进行离心得复合发酵产物上清液；
(5)将步骤(3)中制得的复合发酵混合物进行灭活得复合发酵灭活产物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中益生菌的活化培养基为改良的M6培养基，成分为：酪蛋白胨10g，牛肉浸粉10g，酵母粉5g，葡萄糖20g，乳糖0.5g，吐温-80 1g，1.5％琼脂2g，纯净水1L；一级种子培养基以及发酵培养基为不加琼脂的改良M6培养基；益生菌的培养活化条件为：37℃条件下，斜面静置培养22～26h；挑菌接种获得一级种子液，种子液按2％的接种量接种进行益生菌发酵液的制备；一级种子液及益生菌发酵液的培养条件均为：37℃条件下，静置培养22-24h。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述液体培养基的成分为2％土豆全粉，2％葡萄糖，0.3％磷酸二氢钾，0.15％硫酸镁，6mg\L维生素B1；灵芝菌丝体液体发酵的培养条件为：28℃，160r/min，震荡培养5-7天；所述离心条件为：5000r/min，离心半径6～12cm，离心时间为15～30min。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵培养的条件为：37℃条件下，静置培养12-24h。
10.权利要求1所述灵芝益生菌复合发酵产物在制备化妆品中的应用。
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