CN112094784B - 一株能够抑制HaCaT细胞异常增殖的副干酪乳杆菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株能够抑制HaCaT细胞异常增殖的副干酪乳杆菌，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明提供了一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CCFM1147，此副干酪乳杆菌CCFM1147能够缓解银屑病，具体体现在：抑制银屑病样皮质形成细胞的过度增殖；抑制银屑病样皮质形成细胞中NF‑kB信号通路的激活；降低银屑病样皮质形成细胞中促炎因子IL‑6的水平；降低银屑病样皮质形成细胞中促炎因子IL‑8的水平，可见，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CCFM1147在制备预防和/或治疗银屑病的产品(如日化用品或药品等)中具有巨大的应用前景。

Description

一株能够抑制HaCaT细胞异常增殖的副干酪乳杆菌
技术领域
本发明涉及一株能够抑制HaCaT细胞异常增殖的副干酪乳杆菌，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，是一种遗传、环境、免疫等共同介导的疾病，其发病机制尚未完全明确，目前认为，银屑病是在遗传易感基因和环境因素影响下，角质形成细胞与免疫系统(尤其是T细胞)共同介导的自身免疫性疾病。全球超过1.25亿人患有银屑病，并且，银屑病的患病率逐年有所上升，世界卫生组织2016年发布的银屑病全球患病率为0.09～11.43％。虽然银屑病可在任意年龄阶段发病，但在18～39岁或50～69岁之间的发病率最高。银屑病不会危及生命，严重影响身体健康，但因为其在皮肤上层会出现很多大小不一的丘疹和红斑，并且表面还会覆盖着银白色鳞屑，且多产生于头皮、手脚伸侧易被他人看见的部位，影响社交生活，也给患者的心理带来了极大的压力。
根据银屑病严重程度不同要进行差异化治疗，选择不同的药物和治疗手段，医学界将皮损治疗病程分为进行期、静止期、退行期三个阶段。目前，治疗银屑病的中西医药物很多，也尝试了很多不同的治疗方法，但都不能完全根治，只能缓解发生症状和降低复发几率，且各种治疗手段均有对应的缺点，包括周期长、积累毒性、价格昂贵等。因此，对于银屑病治疗的研究一直是一个热点，一种效果显著且毒副作用少、广被大众接受的治疗方式暂缺。
乳酸菌是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的统称。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性，至少包含18个属，共200多种。除极少数外，其绝大部分都是人体内必不可少的、且具有重要生理功能的菌群，广泛存在于人体的肠道中。乳酸菌具有许多有益的作用，许多研究表明乳酸菌对机体屏障功能、黏膜免疫系统、新陈代谢和全身免疫都有有益的作用。近年来，人们试图用乳酸菌干预肠道从而缓解银屑病，并取得一定进展。在此基础上，Rather等(2018)发现沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)proBio-65中分离的乙醇提取物(SEL001)外涂于咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮肤具有缓解作用，从而揭示了乳酸菌发酵液中可能存在缓解银屑病病症的有效成分。
因此，或许可从乳酸菌入手，通过构建银屑病样病理模型，寻找能够有效缓解银屑病病情的乳酸菌，以找到治疗银屑病的新药物或新方法，以克服现有治疗药物以及治疗方法不良反应明显等的缺陷。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株可缓解银屑病的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
[技术方案]
为解决上述问题，本发明提供了一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CCFM1147，所述副干酪乳杆菌CCFM1147保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61161，保藏日期为2020年08月21日，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述副干酪乳杆菌CCFM1147来源于江苏无锡地区的人体粪便样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌CCFM1147。
所述副干酪乳杆菌CCFM1147的微生物形态学特征为：细胞呈轻微不规则、圆形末端的弯曲杆菌，非运动性、不产芽孢。
本发明还提供了上述副干酪乳杆菌或上述副干酪乳杆菌发酵而得的发酵上清液在制备预防和/或治疗银屑病的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述药品为涂抹型药品。
在本发明的一种实施方式中，所述涂抹型药品含有上述副干酪乳杆菌和附加剂；或者，所述涂抹型药品含有上述副干酪乳杆菌发酵而得的发酵上清液和附加剂；或者，所述涂抹型药品含有上述副干酪乳杆菌、上述副干酪乳杆菌发酵而得的发酵上清液和附加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含软膏剂、防腐剂和/或抗氧化剂。
在本发明的一种实施方式中，所述软膏剂包含单甘脂、硬脂酸、十八醇、丙三醇、白凡士林和/或尼帕金乙酯。
在本发明的一种实施方式中，所述防腐剂包含苯甲酸和/或乙醇。
在本发明的一种实施方式中，所述抗氧化剂为亚硫酸钠。
在本发明的一种实施方式中，所述涂抹型药品的剂型为膏剂、膜剂或凝胶剂。
本发明还提供了一种产品，其特征在于，所述产品含有上述副干酪乳杆菌和/或上述副干酪乳杆菌发酵而得的发酵上清液。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，所述产品包含日化用品或药品。
在本发明的一种实施方式中，所述日化用品为护肤品或洗护用品。
在本发明的一种实施方式中，所述日化用品含有上述副干酪乳杆菌和附加剂；或者，所述日化用品含有上述副干酪乳杆菌发酵而得的发酵上清液和附加剂；或者，所述日化用品含有上述副干酪乳杆菌、上述副干酪乳杆菌发酵而得的发酵上清液和附加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含保湿剂、润肤剂和/或乳化剂。
本发明的一种实施方式中，所述保湿剂为甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、山梨醇和/或乙醇。
本发明的一种实施方式中，所述润肤剂为辛酸/癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸异丙酯、异壬酸异壬酯、棕榈酸乙基己酯和/或乙二醇二硬脂酸酯。
本发明的一种实施方式中，所述乳化剂为椰油基葡糖苷、聚甘油-2二聚羟基硬脂酸酯和/或聚山梨醇酯-60。
在本发明的一种实施方式中，所述药品为涂抹型药品。
在本发明的一种实施方式中，所述涂抹型药品含有上述副干酪乳杆菌和附加剂；或者，所述涂抹型药品含有上述副干酪乳杆菌发酵而得的发酵上清液和附加剂；或者，所述涂抹型药品含有上述副干酪乳杆菌、上述副干酪乳杆菌发酵而得的发酵上清液和附加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述附加剂包含软膏剂、防腐剂和/或抗氧化剂。
在本发明的一种实施方式中，所述软膏剂包含单甘脂、硬脂酸、十八醇、丙三醇、白凡士林和/或尼帕金乙酯。
在本发明的一种实施方式中，所述防腐剂包含苯甲酸和/或乙醇。
在本发明的一种实施方式中，所述抗氧化剂为亚硫酸钠。
在本发明的一种实施方式中，所述涂抹型药品的剂型为膏剂、膜剂或凝胶剂。
有益效果：
本发明提供了一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CCFM1147，此副干酪乳杆菌CCFM1147能够缓解银屑病，具体体现在：
(1)抑制银屑病样皮质形成细胞的过度增殖；
(2)抑制银屑病样皮质形成细胞中NF-kB信号通路的激活；
(3)降低银屑病样皮质形成细胞中促炎因子IL-6的水平；
(4)降低银屑病样皮质形成细胞中促炎因子IL-8的水平，
可见，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CCFM1147在制备预防和/或治疗银屑病的产品(如日化用品或药品等)中具有巨大的应用前景。
生物材料保藏
一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CCFM1147，分类学命名为Lactobacillus paracasei，已于2020年08月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61161，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：不同组别抑制银屑病样皮质形成细胞增殖的效果对比。
图2：不同组别抑制银屑病样皮质形成细胞NF-kB信号通路的效果对比。
图3：不同组别降低银屑病样皮质形成细胞中IL-6水平的效果对比。
图4：不同组别降低银屑病样皮质形成细胞中IL-8水平的效果对比。
具体实施方式
皮肤覆盖于人体表面，是人体最大的器官之一。皮肤由表皮和真皮两部分组成，其中表皮的关键功能是在生物体和外界之间形成屏障，对人体有重要的保护作用。皮肤角质形成细胞(keratinocytes,KCs)是表皮的主要组成部分，而人永生化角质形成细胞(HaCaT细胞)属于成人表皮细胞自发转化而来的细胞系，它与人体正常的角质形成细胞有相同的增殖、分化特性和遗传稳定性，常被用于生物医学领域，作为体外研究的细胞系，比如皮肤修复愈合、防晒和抗衰老等研究。并且，角质形成细胞异常增殖是银屑病的典型病理特征之一。因此，下述实施例中使用经TNF-α处理的HaCaT细胞作为银屑病细胞模型(银屑病样皮质形成细胞)进行细胞实验。
下述实例中涉及的人永生化皮质形成细胞购自中国典型培养物保藏中心；下述实例中涉及的DMEM培养基购自赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司；下述实例中涉及的胎牛血清(FBS)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；下述实例中涉及的青霉素购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；下述实例中涉及的链霉素购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；下述实例中涉及的胰蛋白酶购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；下述实例中涉及的TNF-α自派普泰克生物科技(苏州)有限公司；下述实例中涉及的MTT购自北京索莱宝科技有限公司；下述实例中涉及的NF-κB激活－核转运检测试剂盒(货号：SN368)购自上海碧云天生物技术有限公司；下述实施例中涉及的IL-6(货号：ml058097)和IL-10(货号：ml028580)的ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H200.1 g/L、MnSO40.05 g/L、吐温-801ml/L，pH 7.0。
MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.6g/L、MgSO4·7H200.1 g/L、MnSO40.05 g/L、吐温-801ml/L、琼脂20g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.05g/L，pH 7.0。
乳清蛋白培养基：乳清蛋白40g/L、酵母粉15g/L、乳糖10g/L、Na2HPO41.88 g/L、NaH2PO43.12g/L，pH 7.0。
DMEM培养基：甘氨酸30mg/L、L-精氨酸盐酸盐84mg/L、L-半胱氨酸盐酸盐63mg/L、L-谷氨酰胺584mg/L、L-组氨酸盐酸盐42mg/L、L-异亮氨酸105mg/L、L-亮氨酸105mg/L、L-赖氨酸盐酸盐146mg/L、L-甲硫氨酸30mg/L、L-苯丙氨酸66mg/L、L-丝氨酸42mg/L、L-苏氨酸95mg/L、L-色氨酸16mg/L、L-酪氨酸二钠104mg/L、L-缬氨酸94mg/L、氯化胆碱4mg/L、D-泛酸钙4mg/L、叶酸4mg/L、烟酰胺4mg/L、盐酸吡哆醇4mg/L、核黄素0.4mg/L、盐酸硫胺素4mg/L、i-肌醇7.2mg/L、CaCl2200 mg/L、Fe(NO3)3·9H2O 0.1mg/L、MgSO497.67mg/L、KCl 400mg/L、NaHCO33700 mg/L、NaCl 6400mg/L、NaH2PO4·H2O 125mg/L、D-葡萄糖4500mg/L、酚红15mg/L。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
活菌数的检测方法：采用国标《GB 4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》。
下述实施例中涉及的乳酸菌培养上清的制备方法如下：
将乳酸菌划线于MRS固体培养基上，37℃条件下培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃条件下培养18h进行活化，连续活化两代，得到活化液；将活化液按2％(v/v)的接种量接种于乳清蛋白培养基中，37℃条件下培养24h，得到菌液；将菌液经8000g离心10min，取上清；将上清用浓度为1mol/L的NaOH溶液调pH值至7.0后经0.22μm滤膜过滤除菌，得到乳酸菌培养上清。
实施例1：副干酪乳杆菌的获取
具体步骤如下：
1、筛选
以来源于江苏无锡地区的人体粪便为样本，将样本经预处理后，在20％甘油中保存于-80℃冰箱，取出解冻后，混匀样本吸取0.5mL样本加到4.5mL，以含有0.05g/L半胱氨酸的9g/L生理盐水进行梯度稀释，选择合适的梯度稀释液涂布在MRS固体培养基上，于37℃培养48h，挑取副干酪乳杆菌的典型菌落至MRS固体培养基上划线纯化，挑取单菌落转接至MRS液体培养基(含有0.05g/L半胱氨酸)增菌，30％甘油保藏，得到菌株CCFM1147；其中，副干酪乳杆菌的典型菌落呈乳白色、不规则型、圆形凸起、光滑。
2、鉴定
提取菌株CCFM1147的基因组，将菌株CCFM1147的16S rDNA进行扩增和测序(由苏州金唯智生物科技有限公司进行，CCFM1147的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将该序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示菌株CCFM1147为副干酪乳杆菌，命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CCFM1147。
实施例2：副干酪乳杆菌对银屑病样皮质形成细胞增殖的影响
具体步骤如下：
将冻存的HaCaT细胞37℃复温后，1000rpm离心5min，取沉淀；将沉淀用含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基洗涤一次后，用含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基重悬细胞并计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液接种至10cm培养皿，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养，次日更换一次含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基继续于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养。细胞生长至70％～80％密度时进行传代。
选取生长状态良好的HaCaT细胞，将HaCaT细胞经浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化后离心、用DMEM培养基重悬，进行细胞计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液按照5×103个/孔接种于96孔培养板中，每孔100μL，在96孔培养板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养24h；培养24h后，以96孔培养板中每个孔内细胞为单位，将细胞分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、副干酪乳杆菌CCFM1147干预组(CCFM1147)和副干酪乳杆菌1干预组(L.paracasei 1)(副干酪乳杆菌1是和副干酪乳杆菌CCFM1147同批筛选得到的其他乳酸菌)，每组5个复孔，其中，在空白对照组的每个孔中分别加入100μL DMEM培养基，在模型组、副干酪乳杆菌CCFM1147干预组和副干酪乳杆菌1干预组的每个孔中分别加入90μL浓度为20ng/mL的TNF-α溶液(TNF-α溶液是通过将TNF-α溶于DMEM培养基而得)，并且，在副干酪乳杆菌CCFM1147干预组的每个孔中加入10μL副干酪乳杆菌CCFM1147培养上清，在副干酪乳杆菌1干预组的每个孔中加入10μL副干酪乳杆菌1培养上清，将96孔培养板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中干预24h；干预24h后，将96孔培养板从细胞培养箱中取出，吸去每孔内液体并在每孔中加入100μL含有0.5mg/mL MTT的DMEM培养基，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中孵育4h；孵育4h后，将96孔培养板从细胞培养箱中取出，吸去每孔内液体并在每孔中加入150μL DMSO，将96孔培养板37℃恒温震荡10min；震荡10min后，在酶联免疫检测仪OD570 nm处测量96孔培养板各孔的吸光值，得到96孔培养板各孔的细胞增殖抑制率(实验结果见图1)；其中，细胞增殖抑制率＝(1-干预组OD570 nm/空白对照组OD570nm)×100％。
由图1可知，以空白对照组增殖抑制率为0，模型组细胞过度增殖，细胞增殖抑制率为负数；而副干酪乳杆菌CCFM1147显著抑制了细胞的过度增殖(P＜0.0001)，细胞增殖抑制率为53.6％，且较之副干酪乳杆菌1(细胞增殖抑制率＝23.4％)，抑制效果更好。
可见，相比于副干酪乳杆菌1，副干酪乳杆菌CCFM1147更能够显著抑制银屑病样细胞的过度增殖，缓解银屑病病情。
实施例3：副干酪乳杆菌对银屑病样皮质形成细胞NF-κB核转运的影响
具体步骤如下：
将冻存的HaCaT细胞37℃复温后，1000rpm离心5min，取沉淀；将沉淀用含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基洗涤一次后，用含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基重悬细胞并计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液接种至10cm培养皿，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养，次日更换一次含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基继续于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养。细胞生长至70％～80％密度时进行传代。
选取生长状态良好的HaCaT细胞，将HaCaT细胞经浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化后离心、用DMEM培养基重悬，进行细胞计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液按照2×105个/mL的细胞浓度接种于6孔培养板中，每孔2.5mL，在6孔培养板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养24h；培养24h后，以6孔培养板中每个孔内细胞为单位，将细胞分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、副干酪乳杆菌CCFM1147干预组(CCFM1147)和副干酪乳杆菌1干预组(L.paracasei 1)(副干酪乳杆菌1是和副干酪乳杆菌CCFM1147同批筛选得到的其他乳酸菌)，其中，在空白对照组的每个孔中分别加入100μL DMEM培养基，在模型组、副干酪乳杆菌CCFM1147干预组和副干酪乳杆菌1干预组的每个孔中分别加入90μL浓度为20ng/mL的TNF-α溶液(TNF-α溶液是通过将TNF-α溶于DMEM培养基而得)，并且，在副干酪乳杆菌CCFM1147干预组的每个孔中加入10μL副干酪乳杆菌CCFM1147培养上清，在副干酪乳杆菌1干预组的每个孔中加入10μL副干酪乳杆菌1培养上清，将96孔培养板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中干预24h；干预24h后，将6孔培养板从细胞培养箱中取出，用NF-κB激活—核转运检测试剂盒检测细胞的NF-κB核转运情况(实验结果见图2)。
由图2可知，较之空白对照组，模型组的NF-κB红色荧光更强，且将两张图片重合后，模型组细胞核内的红色荧光液更强，说明NF-κB的核转运被增强；而副干酪乳杆菌CCFM1147有效地抑制了NF-κB核转运的增强，即细胞核内红色荧光减弱，且较之副干酪乳杆菌1，NF-κB核转运程度更接近空白组。
可见，相比于副干酪乳杆菌1，副干酪乳杆菌CCFM1147更能够有效抑制银屑病样细胞中NF-κB核转运这一银屑病典型特征，进而缓解银屑病病情。
实施例4：副干酪乳杆菌对银屑病样皮质形成细胞中促炎因子IL-6水平的影响
具体步骤如下：
将冻存的HaCaT细胞37℃复温后，1000rpm离心5min，取沉淀；将沉淀用含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基洗涤一次后，用含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基重悬细胞并计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液接种至10cm培养皿，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养，次日更换一次含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基继续于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养。细胞生长至70％～80％密度时进行传代。
选取生长状态良好的HaCaT细胞，将HaCaT细胞经浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化后离心、用DMEM培养基重悬，进行细胞计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液按照2×105个/mL的细胞浓度接种于6孔培养板中，每孔2.5mL，在6孔培养板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养24h；培养24h后，以6孔培养板中每个孔内细胞为单位，将细胞分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、副干酪乳杆菌CCFM1147干预组(CCFM1147)和副干酪乳杆菌1干预组(L.paracasei 1)(副干酪乳杆菌1是和副干酪乳杆菌CCFM1147同批筛选得到的其他乳酸菌)，其中，在空白对照组的每个孔中分别加入100μL DMEM培养基，在模型组、副干酪乳杆菌CCFM1147干预组和副干酪乳杆菌1干预组的每个孔中分别加入90μL浓度为20ng/mL的TNF-α溶液(TNF-α溶液是通过将TNF-α溶于DMEM培养基而得)，并且，在副干酪乳杆菌CCFM1147干预组的每个孔中加入10μL副干酪乳杆菌CCFM1147培养上清，在副干酪乳杆菌1干预组的每个孔中加入10μL副干酪乳杆菌1培养上清，将96孔培养板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中干预24h；干预24h后，将6孔培养板从细胞培养箱中取出后离心，用ELISA试剂盒检测细胞上清液中IL-6的含量(实验结果见图3)。
由图3可知，副干酪乳杆菌CCFM1147干预后，细胞上清液中IL-6的含量降低了17.54％，较模型组显著降低(p＜0.05)，且与空白对照组无显著性差异；而副干酪乳杆菌1干预组细胞上清液中IL-6的含量均与模型组并无显著差异。
可见，相比于副干酪乳杆菌1，副干酪乳杆菌CCFM1147更能够显著下调银屑病样角质形成细胞中典型上调促炎因子至正常水平，尤其是降低IL-6水平。
实施例5：副干酪乳杆菌对银屑病样皮质形成细胞中促炎因子IL-8水平的影响
具体步骤如下：
将冻存的HaCaT细胞37℃复温后，1000rpm离心5min，取沉淀；将沉淀用含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基洗涤一次后，用含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基重悬细胞并计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液接种至10cm培养皿，于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养，次日更换一次含有5％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素的DMEM培养基继续于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养。细胞生长至70％～80％密度时进行传代。
选取生长状态良好的HaCaT细胞，将HaCaT细胞经浓度为2.5g/L的胰蛋白酶消化后离心、用DMEM培养基重悬，进行细胞计数，得到细胞重悬液；将细胞重悬液按照2×105个/mL的细胞浓度接种于6孔培养板中，每孔2.5mL，在6孔培养板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中培养24h；培养24h后，以6孔培养板中每个孔内细胞为单位，将细胞分为空白对照组(Control)、模型组(Model)、副干酪乳杆菌CCFM1147干预组(CCFM1147)和副干酪乳杆菌1干预组(L.paracasei 1)(副干酪乳杆菌1是和副干酪乳杆菌CCFM1147同批筛选得到的其他乳酸菌)，其中，在空白对照组的每个孔中分别加入100μL DMEM培养基，在模型组、副干酪乳杆菌CCFM1147干预组和副干酪乳杆菌1干预组的每个孔中分别加入90μL浓度为20ng/mL的TNF-α溶液(TNF-α溶液是通过将TNF-α溶于DMEM培养基而得)，并且，在副干酪乳杆菌CCFM1147干预组的每个孔中加入10μL副干酪乳杆菌CCFM1147培养上清，在副干酪乳杆菌1干预组的每个孔中加入10μL副干酪乳杆菌1培养上清，将96孔培养板于37℃、气相含5％(v/v)CO2的细胞培养箱中干预24h；干预24h后，将6孔培养板从细胞培养箱中取出后离心，用ELISA试剂盒检测细胞上清液中IL-8的含量(实验结果见图4)。
由图4可知，副干酪乳杆菌CCFM1147干预后，细胞上清液中IL-8的含量降低了9.4％，较模型组显著降低(p＜0.01)；而副干酪乳杆菌1干预组细胞上清液中IL-6的含量均与模型组并无显著差异。
可见，相比于副干酪乳杆菌1，副干酪乳杆菌CCFM1147更能够显著下调银屑病样角质形成细胞中典型上调促炎因子至正常水平，尤其是降低IL-8水平。
实施例6：副干酪乳杆菌的应用
副干酪乳杆菌CCFM1147可用于制备身体乳，身体乳的具体制备过程如下：
将10份副干酪乳杆菌CCFM1147培养上清、0.3份保湿剂、0.3份润肤剂、0.1份乳化剂、0.5份防腐剂、油相基质30份、水相基质60份混合，得到身体乳。
实施例7：副干酪乳杆菌的应用
副干酪乳杆菌CCFM1147可用于制备沐浴露，沐浴露的具体制备过程如下：
将10份副干酪乳杆菌CCFM1147培养上清、10份表面活性剂脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸盐、5份乳化剂辛烯基琥珀酸淀粉糖、5份增稠剂聚乙二醇、10份清洁剂十二烷基硫酸钠(月桂醇硫酸钠)、0.3份防腐剂乙内酰脲、0.5份香精，60份水相基质混合，得到身体乳。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株能够抑制HaCaT细胞异常增殖的副干酪乳杆菌
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1200
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1045)..(1046)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1080)..(1082)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1112)..(1114)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1116)..(1116)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1126)..(1127)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1135)..(1135)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1144)..(1146)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1148)..(1148)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1150)..(1152)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1155)..(1155)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1173)..(1174)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1186)..(1186)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221> misc_feature
<222> (1192)..(1192)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 1
nnngccgnng ngggnngcct atacatgcaa gtcgaacgag ttctcgttga tgatcggtgc 60
ttgcaccgag attcaacatg gaacgagtgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg 120
cccttaagtg ggggataaca tttggaaaca gatgctaata ccgcatagat ccaagaaccg 180
catggttctt ggctgaaaga tggcgtaagc tatcgctttt ggatggaccc gcggcgtatt 240
agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgatgatac gtagccgaac tgagaggttg 300
atcggccaca ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat 360
cttccacaat ggacgcaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggctttcggg 420
tcgtaaaact ctgttgttgg agaagaatgg tcggcagagt aactgttgtc ggcgtgacgg 480
tatccaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc 540
aagcgttatc cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta agtctgatgt 600
gaaagccctc ggcttaaccg aggaagcgca tcggaaactg ggaaacttga gtgcagaaga 660
ggacagtgga actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg 720
cgaaggcggc tgtctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag 780
gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgaatg ctaggtgttg gagggtttcc 840
gcccttcagt gccgcagcta acgcattaag cattccgcct ggggagtacg accgcaaagt 900
tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 960
agcaacgcga agaaccttac cagtcttgac atctttttga tcacctgaga gatcaggttt 1020
ccccttcggg ggcaaaatga cagtnngcat ggtgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgtgn 1080
nnagtcccgc aacgagcgca ccttatgact annncngcat ttagtnncac tctantagac 1140
tgcnnnanan nnagnggtgg atgacgtcaa tcnncatgcc ccctantgac cnggggctac 1200

Claims (9)

1.一株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，其特征在于，所述副干酪乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61161，保藏日期为2020年08月21日。
2.权利要求1所述副干酪乳杆菌或权利要求1所述副干酪乳杆菌发酵而得的培养上清在制备预防和/或治疗银屑病的药品中的应用；将权利要求1所述副干酪乳杆菌接种于乳清蛋白培养基中，培养得到菌液；将菌液离心取上清，得到培养上清。
3.一种产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述副干酪乳杆菌和/或权利要求1所述副干酪乳杆菌发酵而得的培养上清；将权利要求1所述副干酪乳杆菌接种于乳清蛋白培养基中，培养得到菌液；将菌液离心取上清，得到培养上清。
4.如权利要求3所述的一种产品，其特征在于，所述产品中，所述产品为日化用品或药品。
5.如权利要求4所述的一种产品，其特征在于，所述日化用品为洗护用品。
6.如权利要求4所述的一种产品，其特征在于，所述药品为涂抹型药品。
7.如权利要求6所述的一种产品，其特征在于，所述涂抹型药品含有权利要求1所述副干酪乳杆菌和附加剂；或者，所述涂抹型药品含有权利要求1所述副干酪乳杆菌发酵而得的培养上清和附加剂；或者，所述涂抹型药品含有权利要求1所述副干酪乳杆菌、权利要求1所述副干酪乳杆菌发酵而得的培养上清和附加剂；所述附加剂为软膏剂、防腐剂和/或抗氧化剂。
8.如权利要求7所述的一种产品，其特征在于，所述软膏剂为单甘脂、硬脂酸、十八醇、丙三醇、白凡士林和/或尼帕金乙酯。
9.如权利要求7所述的一种产品，其特征在于，所述防腐剂为苯甲酸和/或乙醇。
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