CN116555128B - 一种促进皮肤胶原再生的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种可改善皮肤衰老的植物乳杆菌及其应用，该植物乳杆菌保藏编号为CGMCC NO.23434，其具有抑制皮肤胶原蛋白降解的作用。该植物乳杆菌制备的益生菌产品能促进胶原蛋白再生改善皮肤衰老，同时，还可作为一种益生菌，协调肠道微生物平衡，从而达到维护宿主机体健康的作用，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于益生菌技术领域，特别涉及一种对皮肤衰老具有改善作用的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
皮肤是人体表面积最大的器官，因直接与外部环境接触，而被视为抵御微生物、有毒气体和紫外线(UV)等不利因素的第一道防线。然而，器官的老化自出生便开始，而皮肤更是机体最早出现衰老迹象的器官。皮肤衰老不仅关乎健康，更影响观感，因此如何延缓皮肤老化已成为全世界共同关注的一个美学问题。皮肤衰老在临床上表现为皱纹、下垂、松弛和粗糙的纹理外观的出现。其中，面部皱纹被认为是皮肤老化的最突出特征之一，其主要是由于真皮层内的胶原蛋白降解导致。由此，皮肤真皮层内的结构完整性和修复能力决定了真皮微环境的平衡乃至皮肤健康。因此，了解胶原蛋白在老化过程中的降解途径并找到可促进胶原蛋白再生的物质对于改善皮肤衰老、维护机体健康至关重要。
目前市场上针对改善皮肤衰老的途径主要集中在涂抹化妆品的研发上，但是由于皮肤的物理屏障存在使得有效颗粒物质难以到达皮肤深处发挥改善作用，且这些“有效成分”无法刺激内源性的胶原蛋白产生，因而改善效果不佳。基于此，有效物质的正确给予途径及如何激发内源性胶原蛋白产生的作用机制是改善皮肤衰老所要解决的两大难点。最新研究表明口服益生菌有利于缓解皮肤老化特征，包括改善皮肤的pH值、氧化损伤、紫外线损伤与皮肤屏障功能障碍等。
因此，开发一种可改善皮肤衰老作用的益生菌至关重要，尤其是针对皮肤衰老过程中最为明显的皱纹生成。
发明内容
针对现有改善皮肤衰老的途径的不足和实际需求，本发明提供一种具有促进胶原蛋白再生功能的植物乳杆菌及其应用，研究植物乳杆菌对皮肤衰老的改善作用，通过动物实验，检测皮肤衰老指标(水分、弹性)、皮肤结构变化(表皮厚度、真皮密度)、物质组成(胶原蛋白)与降解胶原蛋白的金属蛋白酶9(MMP9)的含量，评价菌株对皮肤衰老的改善作用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种分离自乳制品中的植物乳杆菌LPL-01，该菌株于2021年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，分类命名为植物乳杆菌Lactobacillus plantarumLPL-01，保藏编号为CGMCC NO. 23434。
本发明提供上述植物乳杆菌的培养方法，其特征在于，将植物乳杆菌接种在MRS液体培养基中，在30~37℃下培养18~24 h。
另一方面，本发明提供植物乳杆菌在改善皮肤衰老产品中的应用。
优选的，所述产品中植物乳杆菌的活菌数不低于1×106CFU/mL。
优选的，所述产品为促胶原蛋白生成剂。
另一方面，本发明提供一种含有上述植物乳杆菌的组合物、促胶原蛋白生成剂或相关产品。
上述产品中含有的植物乳杆菌可使宿主皮肤中胶原蛋白再生或降解被抑制。
优选的，其中植物乳杆菌的活菌数不低于1×106CFU/mL。
另一方面，提供一种本发明的植物乳杆菌能够改善衰老皮肤的水分与弹性降低的应用；
另一方面，提供一种本发明的植物乳杆菌能够降低衰老皮肤的表皮厚度与真皮密度。进一步的，本发明的植物乳杆菌能够使衰老引起的表皮变薄、真皮结构疏松症状得以缓解。可用于上述表皮变薄、真皮结构疏松改善的应用。
另一方面，提供一种本发明的植物乳杆菌改善衰老皮肤的胶原蛋白含量减少的应用，进一步的，胶原蛋白为Collagen Ⅳ与Laminin 311。
另一方面，提供一种本发明的植物乳杆菌抑制衰老皮肤中MMP9的产生的应用。本发明的植物乳杆菌抑制胶原蛋白酶的降解，从而提高胶原蛋白含量，最终改善皮肤衰老。
本发明相比现有技术的有益效果为：
（1）本发明通过平板涂布及划线纯化，成功筛选到一株可促进胶原蛋白再生的植物乳杆菌，保藏编号为CGMCC NO. 23434。
（2）植物乳杆菌LPL-01能够通过促进宿主皮肤中胶原蛋白再生或者抑制胶原蛋白降解来改善皮肤衰老。
（3）植物乳杆菌制备的益生菌产品能促进胶原蛋白再生改善皮肤衰老，同时，还可作为一种益生菌，协调肠道微生物平衡，从而达到维护宿主机体健康的作用，应用前景广阔。
附图说明
图1 各组皮肤生理指标水平。
图2 各组皮肤HE染色与马松三色染色。
图3 各组皮肤胶原蛋白(CollagenⅣ与Laminin 311)的免疫荧光染色与结果统计。
图4 各组皮肤中MMP9的ELISA检测结果。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步详细解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
实施例1 微生物培养准备
本发明的植物乳杆菌LPL-01分离自乳制品，该菌株于2021年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为CGMCC NO. 23434。
菌体制备：取植物乳杆菌在MRS培养基内活化两代后，以2%接种量接种于MRS液体培养基内培养12 h，离心(4000 rpm，10 min)去除上清液，用PBS清洗菌体两次后，灌胃时，以0.9%生理盐水重悬浮并调整其菌悬液浓度为1×109CFU/mL。
实施例2 动物模型
实验动物选用SPF级C57BL/6N(8月龄，雄性)小鼠，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司。
N-乙酰基-N-2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸, N(1)-acetyl-N(2)-formyl-5-methoxykynuramine, AFMK, 是褪黑激素的代谢产物，将其作为阳性对照。
动物实验共分为4组，分别是对照组、模型组(自然衰老组)、AFMK+自然衰老组与植物乳杆菌+自然衰老组，每组12只小鼠，共48只。
小鼠饲养条件：温度24℃，控制光照12 h，黑暗12 h，每三天更换一次垫料。适应性饲养一周后，将36只小鼠随机分为3组，每组12只。
对照组(CON)：8月龄小鼠，不进行任何操作，对8月龄小鼠直接取材；
自然衰老组(Aging)：将8月龄小鼠置于常规条件下正常饲养至12月龄；
AFMK干预组(Aging+AFMK)：从8月龄开始，每天早上于固定时间(7:00~8:00)通过灌胃给予小鼠10 mg/kg/d的AFMK，直至12月龄。
植物乳杆菌干预组(Aging+L)：从8月龄开始，每天早上于固定时间(7:00~8:00)通过灌胃给予小鼠1×109CFU/mL的植物乳杆菌0.2ml，直至12月龄。
饲养期间，四组小鼠可正常饮水进食，每周称量一次体重，并检测皮肤生理指标，包括：皮肤水分、弹性、油脂、pH、拉力与光泽度。干预实验结束后禁食24h，通过摘取眼球的方式收集小鼠血液，低温离心后收集血清并冻存于-80℃待测。采用无菌操作摘取小鼠背部皮肤，均分为两份，一份置于4%多聚甲醛中固定，另一份冻存于-80℃冰箱待测。再将肠道剖开，取出肠道内容物用于肠道菌群的16S rRNA检测。
实施例3 皮肤结构的检测
将固定于4%多聚甲醛中的不同组小鼠的不同部位的皮肤经梯度酒精进行脱水，再用石蜡包埋，最后制成厚度为5µm的切片。该切片用于HE染色、马松三色染色，用于观察皮肤表皮厚度与真皮密度。
各组小鼠背部皮肤的生理指标，包括水分(角质层含水量(stratum corneumwater content, SCWC))、弹性(Elasticity)、油脂(Oil content)、酸碱度(pH)、拉力(Skinpull)与光泽度(Skin gloss)。如图1所示，油脂(B)、pH(D)拉力(E)与光泽度(F)这四项指标在不同组小鼠背部皮肤中变化并不明显。此外，与对照组相比，衰老组中的皮肤水分(A)与弹性(C)都明显下降。然而添加了植物乳杆菌与AFMK之后，背部皮肤中的水分与弹性都显著增加，但是植物乳杆菌的改善作用更为明显。以上结果表明植物乳杆菌能改善衰老皮肤中的水分与弹性降低，进而修复皮肤衰老。
如图2所示，HE染色(A-C)与马松三色(D-F)染色展示了三组小鼠背部皮肤中的表皮与真皮结构。统计结果显示，与对照组相比，衰老组中皮肤的表皮厚度(G)与真皮密度(H)明显降低。然而，添加了植物乳杆菌与AFMK之后，表皮厚度与真皮密度显著增加，但是植物乳杆菌的改善作用更为明显。该结果表明，在皮肤衰老过程中，皮肤结构会发生明显变化，表现为表皮变薄、真皮结构疏松，然而植物乳杆菌的添加能发挥良好的改善作用。
实施例4 皮肤胶原蛋白的检测
将实施例2中皮肤切片用于免疫荧光染色，检测真皮内的不同胶原蛋白表达：胶原蛋白Ⅳ（Collagen Ⅳ）与层粘连蛋白311（Laminin 311）。
如图3所示，免疫荧光染色显示了三组小鼠背部皮肤真皮层中Collagen Ⅳ(A-C)与Laminin 311(D-F)这两种胶原蛋白的表达。结合统计学结果显示，与对照组相比，衰老组皮肤中Collagen Ⅳ(G)与Laminin 311(H)这两种胶原蛋白的表达量明显降低。然而，添加了植物乳杆菌与AFMK之后，这两种蛋白的表达量又显著增加，但是植物乳杆菌的改善作用更为明显。
该结果表明，在皮肤衰老过程中，真皮中的胶原蛋白含量逐渐降低，而植物乳杆菌的添加能有效地改善这一过程，其可通过增加胶原蛋白含量改善皮肤衰老。
实施例5 皮肤金属蛋白酶的检测
取出冻存于-80℃冰箱的不同组小鼠的皮肤样本，利用ELISA技术检测小鼠皮肤中MMP9的含量。
如图4所示，利用ELISA试剂盒检测了三组小鼠背部皮肤中MMP9的含量。结果表明，与对照组相比，衰老小鼠皮肤中的MMP9的含量明显增加，然而，添加植物乳杆菌与AFMK之后，背部皮肤中的MMP9水平显著降低，但是植物乳杆菌的改善作用更为明显。该结果表明，在皮肤衰老过程中，MMP9水平上调，进而诱导胶原蛋白的降解，导致皮肤衰老。然而，植物乳杆菌能有效地降低MMP9水平，随即抑制胶原蛋白的降解，最终改善皮肤衰老。
综上所述，植物乳杆菌LPL-01能够通过降低衰老小鼠皮肤中MMP9的产生，抑制胶原蛋白酶的降解，从而提高胶原蛋白含量，最终改善皮肤衰老。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1. 一种改善皮肤衰老的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌分类命名为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株名为LPL-01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 23434，保藏日期为2021年09月17日。
2. 一种权利要求1所述的植物乳杆菌的培养方法，其特征在于，将植物乳杆菌接种在MRS液体培养基中，在30~37℃下培养18~24 h。
3.一种含有权利要求1所述植物乳杆菌或其菌液发酵物的组合物。
4.一种含有权利要求1所述植物乳杆菌或其菌液发酵物的菌剂。
5.一种含有权利要求1所述植物乳杆菌的产品，其特征在于，所述产品为促胶原再生剂。
6.权利要求3的组合物、权利要求4的菌剂或权利要求5的产品的制药用途，其特征在于，所述制药用途为可使宿主皮肤内胶原蛋白再生或胶原蛋白降解被抑制。
7. 根据权利要求6所述的制药用途，其特征在于，所述产品中植物乳杆菌的活菌数不低于1×106 CFU/mL。
8.根据权利要求6所述的制药用途，其特征在于，所述产品为促胶原再生剂。
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