CN113832050B - 一株高效合成烟酰胺、抗光老化的发酵乳杆菌xjc60及其应用 - Google Patents

一株高效合成烟酰胺、抗光老化的发酵乳杆菌xjc60及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高效合成烟酰胺、抗光老化的发酵乳杆菌及其应用。发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)XJC60，保藏编号为GDMCC No：61827。本发明的有益效果为：1、本发明中的发酵乳杆菌XJC60来源于阳光充足的新疆奶酪，为本土来源的优良菌株。2、与传统抗光老化的化学药物相比，本发明具有对生态环境无毒副作用、无残留风险，绿色安全。3、本发明使用方便、安全，在基因、细胞、动物多水平证实均无对人体有潜在的危害，具有安全、高效的优点。5、本发明的发酵乳杆菌XJC60是从756株益生菌中筛选出的具有良好的抗紫外损伤作用的乳杆菌。

Description

一株高效合成烟酰胺、抗光老化的发酵乳杆菌XJC60及其应用
技术领域：
本发明属于微生物领域，具体涉及一株高效合成烟酰胺、抗光老化的发酵乳杆菌及其应用。
背景技术：
皮肤是机体和外界直接接触的重要器官，也是人体最大的器官。作为免疫反应的第一道防线，它的主要作用就是保护机体免受各种物理性、化学性及病原微生物的伤害。随着近年来臭氧空洞的出现,过量紫外辐射所造成的强烈生化效应已成为严重的环境危害,正直接或间接地破坏人类赖于生存的环境以及人类的自身健康。随着人们越来越关注皮肤健康，追求健康年轻的皮肤，美容护肤逐渐成为人们关注的热点。因此，寻找有效、安全的修复皮肤紫外损伤、缓解炎症、预防皮肤光老化方法具有重大的应用研究价值。
急性高剂量的紫外辐照会引起皮肤细胞的凋亡坏死，直接损害皮肤的天然屏障功能。紫外辐射导致皮肤细胞凋亡坏死的主要机制是：紫外辐射可直接损失皮肤细胞的线粒体，引起细胞色素氧化酶功能失调及细胞氧化磷酸化功能受阻，最终导致线粒体内膜两侧的膜电位下降。同时，进入细胞内的氧自由基增多并生成活性氧簇(reactive oxygenspecies，ROS)，导致细胞病理损伤。因此，使用具有稳定线粒体膜电位、减少ROS产生的药物或天然化合物，可以预防及修复光损伤导致的皮肤细胞坏死以及光老化现象。
乳酸菌(Lactic acid bacteria，LAB)是一类利用糖类发酵产生乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌。乳酸菌被美国食品药品监督管理局认证为安全微生物，是与人类关系最为密切的微生物之一。乳酸菌可以保持肠道微生态平衡，抑制肠内有害菌生长，控制内毒素，减少腐败物质产生，制造营养物质，刺激组织发育等。在20世纪90年代乳酸菌的抗氧化活性被发现，但其具体分子机制尚不明确。有文献报道植物乳杆菌C2具有合成酚类、黄酮类化合物及花青素的作用，能有效清除活性氧自由基。亦有研究指出无毛小鼠中口服特定的益生菌可有效预防紫外线诱导的皮肤脱水，并减少皮肤细胞中的过氧化氢水平及蛋白质氧化、增加黄嘌呤氧化酶活性。因此，特定的益生菌具有通过增加抗氧化物质、下调ROS物质水平的作用，可被应用于预防及治疗紫外线引起的皮肤损伤。
目前对于抗皮肤光老化功能因子的研究主要集中于植物源的多糖、多肽类和黄酮类物质。但随着现今化妆品行业从植物提取物时代进入微生态护肤时代，行业中产生了许多针对改善皮肤微生态产品的需求。因此，寻找有效物质基础明确、具有强大抗氧化能力的益生菌，可从微生态角度解决紫外线引起的皮肤光老化问题，具有广阔的市场发展空间和较高的市场价值。
发明内容：
本发明的第一个目的在于公开了一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)XJC60。本发明的发酵乳杆菌XJC60可高效合成烟酰胺，在体内、体外均明显减低紫外损伤后表皮细胞的活性氧水平、缓解细胞损伤，有效预防紫外辐射导致的皮肤光老化现象。
本发明的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)XJC60，其于2021年7月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：61827。
本发明的第二个目的提供上述发酵乳杆菌XJC60在制备预防和/或治疗紫外损伤的产品中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种预防和/或治疗紫外损伤的产品，其含有发酵乳杆菌XJC60作为活性成分。
优选，所述的发酵乳杆菌XJC60是以发酵乳杆菌XJC60的活菌菌体、菌体破碎物、发酵液或发酵上清液的形式使用。
优选，所述的产品为食品、药品或保健食品
进一步优选，所述的药品含有发酵乳杆菌XJC60、药物载体和/或药物辅料。
进一步优选，所述的食品是发酵乳杆菌XJC60发酵生产得到的乳制品、豆制品或果熟制品；或所述食品包括含有发酵乳杆菌XJC60的固体饮料。
本发明的第四个目的是提供一种鉴别发酵乳杆菌XJC60的引物对，引物对包括如SEQ.ID No.3和SEQ.ID No.4所示的核苷酸序列。
本发明的第五个目的是提供一种鉴别发酵乳杆菌XJC60的方法，其是以上述引物对作为扩增引物对待测菌进行PCR反应扩增，如果扩增出318bp的产物，则为发酵乳杆菌XJC60，如果没有扩增出318bp的产物，则不是发酵乳杆菌XJC60。
本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明中的发酵乳杆菌XJC60来源于阳光充足的新疆奶酪，为本土来源的优良菌株。
2、与传统抗光老化的化学药物相比，本发明具有对生态环境无毒副作用、无残留风险，绿色安全。
3、本发明使用方便、安全，在基因、细胞、动物多水平证实均无对人体有潜在的危害，具有安全、高效的优点。
5、本发明的发酵乳杆菌XJC60是从756株益生菌中筛选出的具有良好的抗紫外损伤作用的乳杆菌，具体体现为：
(1)明显提高紫外损伤后人角质形成细胞存活率；
(2)高效清除DPPH自由基和羟基自由基；
(3)显著降低紫外损伤HaCaT细胞的高活性氧水平，并且稳定受损细胞的线粒体膜电位；
(4)本发明能高效合成抗光老化因子烟酰胺。
因此，发酵乳杆菌XJC60在制备修复或治疗紫外损伤的产品(如食品、药品和护肤品等)中，具有巨大的应用前景。
Lactobacillus fermentum XJC60于2021年7月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：61827。
附图说明
图1是通过修复UVB损伤HaCaT及抗氧化能力筛选优势菌株；
图中展示处理后存活率最高的、DPPH自由基清除能力最强、羟基自由清除能力最强的前30株乳杆菌数据，阳性对照为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strainShirota)；
图注：与MRS对照组比较，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001。
图2是发酵乳杆菌XJC60对UVB损伤的HaCaT细胞活性氧水平的影响；其中(a)-(d)分别为正常对照组、MRS培养基对照组、发酵乳杆菌XJC60(处理组)和干酪乳杆菌Shirota(阳性对照组)处理组的FSC-SSC散点图；(e)-(f)各组在FITC通道上的平均荧光强度。
图3是发酵乳杆菌XJC60对UVB损伤的HaCaT细胞线粒体膜电位的影响。
图4是白化豚鼠正常对照组、紫外辐照模型组、发酵乳杆菌XJC60处理组的H&E染色图。
图5是发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)XJC60的分子靶标验证。
图注M为DNA marker，1为发酵乳杆菌XJC60经分子靶标序列(SEQ ID NO.3和SEQID NO.4)扩增后的PCR产物电泳图，2-89为其他乳杆菌经分子靶标序列扩增后的PCR产物电泳图。2-89的乳杆菌菌株信息如下表1所示。
表1靶标扩增结果
Figure GDA0003776234140000051
Figure GDA0003776234140000061
Figure GDA0003776234140000071
Figure GDA0003776234140000081
具体实施方案
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的培养基如下
MRS琼脂平板(g/L)：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏5.0g/L、酵母膏粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐温80 1.0ml/L、K2PO4·3H20 2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、柠檬酸三胺2.0g/L、MgSO4·7H20 0.2g/L、MnSO4·4H20 0.05g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，配制方法是将各成分混合均匀灭菌制得。
MRS液体培养基是在MRS琼脂平板的基础上减去琼脂。
高产胞外多糖MRS肉汤培养基(g/L)：蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏粉5.0g/L、柠檬酸三胺2.0g/L、乙酸钠5.0g/L、MgSO4·7H20 0.2g/L、MnSO4·4H20 0.05g/L、蔗糖20.0g/L、吐温80 1.0g/L，溶剂为水，配制方法是将各成分混合均匀灭菌制得。
DMEM细胞培养基(mg/L)：二水合氯化钙265.00mg/L、九水合硝酸铁0.10mg/L、氯化钾400.00mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钠6400.00mg/L、无水磷酸二氢钠109.00mg/L、丁二酸75.00mg/L、丁二酸钠100.00mg/L、L-盐酸精氨酸84.00mg/L、L-盐酸胱氨酸63.00mg/L、甘氨酸30.00mg/L、L-盐酸组氨酸42.00mg/L、L-异亮氨酸105.00mg/L、L-亮氨酸105.00mg/L、L-盐酸赖氨酸146.00mg/L、L-甲硫氨酸30.00mg/L、L-苯丙氨酸66.00mg/L、L-丝氨酸42.00mg/L、L-苏氨酸95.00mg/L、L-色氨酸16.00mg/L、L-酪氨酸72.00mg/L、L-缬氨酸94.00mg/L、D-泛酸钙4.00mg/L、酒石酸胆碱7.20mg/L、叶酸4.00mg/L、肌醇7.20mg/L、烟酰胺4.00mg/L、核黄素0.40mg/L、盐酸硫胺4.00mg/L、盐酸吡哆辛4.00mg/L、葡萄糖1000.00mg/L、丙酮酸钠110.00mg/L、酚红15.00mg/L。加入10％胎牛血清的DMEM细胞培养基为完全培养基。
实施例1乳杆菌的分离、保藏、鉴定
1.1益生菌的分离及菌种库保藏
采集中国新疆维吾尔自治区发酵食品作为样本，共204份。在无菌环境下，取0.1g奶酪样本加入10ml MRS液体培养基，震荡混匀后于37℃厌氧条件下富集培养24h，吸取0.5ml菌液做梯度稀释。加入生理盐水制成10-1至10-5稀释梯度菌悬液，选取10-3、10-4、10-5三个梯度菌悬液，分别吸取100μl至MRS琼脂培养基，使用涂布棒涂抹均匀，再于37℃厌氧条件下培养48h。挑取平板上形态典型的菌落至MRS琼脂培养基上进行划线纯化，纯化后挑取单菌落接种入MRS液体培养基中，37℃厌氧培养48h，30％甘油保藏于-80℃超低温冰箱中。从204份发酵食品样品中，共分得805株菌，最终总计保藏756株益生菌。
1.2乳杆菌的鉴定
采用细菌DNA提取试剂盒(Mabio，CHINA)进行细菌DNA提取，后采用2×PCR mix(Dongshengbio，CHINA)进行PCR扩增。PCR扩增引物采用16S rRNA基因通用引物，上游引物序列为27F：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’；下游引物序列为1492R：5’-CTAC GGCTAC CTT GTT ACG A-3’。PCR反应条件为：预变性95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃1min30s共35个循环，72℃退火延伸10min。对PCR产物进行切胶回收，后进行一代测序(由苏州金唯智生物科技有限公司完成)。将获得的16S rRNA基因序列比对NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，结果显示与乳杆菌同源性最高。对于比对结果中Identity和Coverage均与已知乳杆菌相似度大于99％的菌株，可确定为乳杆菌。
经鉴定后，756株益生菌中有515株乳杆菌。其中本专利所要求保护的菌株16SrRNA基因序列如SEQ ID No.1所示。将该序列比对NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，结果提示其与发酵乳杆菌同源性最高，命名为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)XJC60，其于2021年7月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号为GDMCC No：61827。
发酵乳杆菌XJC60的菌体呈短杆状，在MRS琼脂平板该菌菌落呈淡黄色圆形、边缘光滑，该菌在37℃厌氧环境下于MRS培养基中培养8小时即达稳定期，异型发酵，代谢葡萄糖产酸产气。
实施例2乳杆菌的培养及乳杆菌发酵液的制备
将发酵乳杆菌XJC60从甘油管中接种至MRS琼脂平板上，于37℃厌氧培养48h，挑取单菌落接入高产胞外多糖的MRS肉汤培养基中，于37℃厌氧培养48h。采用10000g×4℃离心5min，获取发酵上清，采用1mol/L NaOH将发酵液pH调整至7.35-7.45。采用0.22μm滤膜过滤调整pH值后的发酵上清液，获得发酵乳杆菌XJC60发酵的无细胞上清液，冻存于-80℃待用。其他乳杆菌的发酵上清液也参照此方法制作。
实施例3乳杆菌抗皮肤细胞UVB损伤能力的评估
3.1建立UVB辐射的HaCaT光损伤细胞模型
采用人角质细胞HaCaT(中山大学附属第一医院皮肤科馈赠)作为研究对象，采用完全培养基对HaCaT细胞进行培养。将传代HaCaT细胞种于孔板中，当细胞增殖覆盖孔板80％面积时，进行UVB辐射。UV辐照的条件为：采用UVB-313EL灯管(ANTOINE，波峰值313nm，40W)，调整辐射强度为0.02mW/cm2，辐射剂量为0、12、18、24、36、48mJ/cm2。
3.2不同剂量UVB照射HaCaT细胞的存活影响
HaCaT细胞培养至对数期，收集细胞。96孔板内设阴性对照、阳性对照和不同剂量处理组，阴性对照组只加入完全培养基，阳性对照组和处理组调整细胞悬液浓度，以1×105个/mL每孔接种100μL细胞悬液，每组均设3个实验孔。边缘孔用无菌PBS填充，细胞培养板置于5％CO2，37℃培养箱培养24h。培养24h细胞长至单层后，吸走培养基，用无菌PBS清洗3次，清除原有培养基后，每孔加入100μL无菌PBS。阳性对照组用锡纸包裹，避免受到UVB照射。处理组分别给予0、10、15、20、30、40min的UVB照射，辐射剂量分别为0、12、18、24、36、48mJ/cm2。照射后吸走PBS后每孔加入100μL完全培养基继续培养。培养24h后，用CCK-8法测定细胞存活率。
随着UVB照射剂量的增加，HaCaT细胞的存活率下降。UVB灯管(0.02mW/cm2)照射时间为15min，辐射剂量为18mJ/cm2时，HaCaT细胞存活率达到50％，选此剂量作为UVB损伤HaCaT细胞模型的剂量。
3.3 515株乳杆菌发酵上清液对UVB损伤的HaCaT细胞存活率的影响
HaCaT细胞培养至对数期，收集细胞。96孔板内设阴性对照、阳性对照和处理组，阴性对照组只加入完全培养基，阳性对照组和处理组调整细胞悬液浓度，以1×105个/mL每孔接种100μL细胞悬液，每组均设3个实验孔。边缘孔用无菌PBS填充，细胞培养板置于5％CO2，37℃培养箱培养24h。
培养24h细胞长至单层后，吸走培养基，用无菌PBS清洗3次，清除原有培养基后，每孔加入100μL无菌PBS。阳性对照组用锡纸包裹，避免受到UVB照射。处理组给予15min的UVB照射，辐射剂量为18mJ/cm2。
照射后处理组每孔加入100μL 10％乳杆菌发酵上清液的完全培养基继续培养，阳性对照组是加入100μL 10％干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain Shirota)发酵上清液的完全培养基。培养24h后，用CCK-8法测定细胞存活率。
505株乳杆菌的发酵上清液中，有303株对UVB损伤的HaCaT细胞的存活率高于MRS处理组，且有统计学意义。如图1(a)结果所示，仅展示修复UVB损伤的HaCaT细胞的前30株乳杆菌数据。
实施例4乳杆菌体外抗氧化能力的评估
4.1 303株乳杆菌的DPPH自由基清除能力评估
在96孔板中每孔加入100μL 0.2mmol/L DPPH乙醇溶液和100μL(乳杆菌发酵上清液)，震荡混匀后避光反应30min，于517nm处测吸光值Ai，用100μL MRS液体培养基代替样品，同操作得到吸光值(Aj)，同时设置100μL无水乙醇及100μL蒸馏水的空白孔(Ab)和100μL0.2mmol/L DPPH乙醇溶液及100μL蒸馏水的对照孔(Ac)，每个处理3个重复。计算DPPH·自由基清除率：
Figure GDA0003776234140000131
样品的DPPH自由基清除率越高，样品的抗氧化性能越强。303株乳杆菌的发酵上清液中，有149株的DPPH自由基清除能力高于MRS处理组，且有统计学意义。如图1(b)结果所示。
4.2 149株乳杆菌的羟基自由基清除能力评估
在96孔板中每孔加入30μL 0.75mmol/L邻二氮菲溶液后,加入60μL 0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.40)和30μL 0.75mmol/L FeSO4，制成工作液。在该工作液中分别加入30μL的样品溶液(乳杆菌发酵上清液或MRS培养基)，最后加入30μL 0.01％(v/v)H2O2，37℃水浴60min，在536nm处测定各样品吸光度Ai，同时设置在工作液中加入30μL的0.01％(v/v)H2O2及30μL蒸馏水的空白孔(Ab)和30μL的乳杆菌发酵上清液及30μL蒸馏水的对照孔(Ac)，每个处理3个重复。清除率按下式计算：
Figure GDA0003776234140000132
样品的羟基自由基清除率越高，样品的抗氧化性能越强。149株乳杆菌的发酵上清液中，有56株的羟基自由基清除能力高于60％。如图1(c)结果所示。
4.3 56株乳杆菌发酵上清液对UVB损伤HaCaT细胞的活性氧水平
HaCaT细胞培养至对数期，收集细胞。6孔板内设正常对照组(Normal Control)、MRS培养基对照组、阳性对照和处理组，调整细胞悬液浓度，以1×106个/mL，每孔接种2mL细胞悬液。细胞培养板置于5％CO2，37℃培养箱培养24h。
培养24h细胞长至单层后，吸走培养基，用无菌PBS清洗3次，清除原有培养基后，每孔加入2mL无菌PBS。阳性对照组用锡纸包裹，避免受到UVB照射。处理组给予15min的UVB照射，辐射剂量为18mJ/cm2。
照射后正常对照组加入2mL完全培养基，MRS培养基对照组2mL10％MRS培养基的完全培养基、处理组加入2mL 10％发酵乳杆菌XJC60发酵上清液的完全培养基、阳性对照组是加入2mL 10％干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain Shirota)发酵上清液的完全培养基继续培养。培养24h后，用500μL 0.25％含EDTA的胰酶收集孔内细胞，用等体积无菌PBS清洗2次。
用1mL无血清培养基稀释的2μmol/L DCFH-DA(Beyotime Biotechnology，China)重悬于离心管中，37℃细胞培养箱内避光孵育30分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。
用无菌PBS洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。用200μL无菌PBS重悬于流式管中，通过流式细胞仪检测细胞内的荧光强度。
在56株乳杆菌中，本专利发酵乳杆菌XJC60发酵上清液最能稳定UVB损伤HaCaT细胞后下降的活性氧水平。如图2所示，MRS培养基对照组的FITC通道荧光强度为310.59，发酵乳杆菌XJC60发酵上清液处理组FITC通道荧光强度为93.90，干酪乳杆菌Shirota发酵上清液处理组FITC通道荧光强度为203.51，正常对照组FITC通道荧光强度为71.05。紫外损伤组的FITC通道绿色荧光强度显著高于正常细胞组，而发酵乳杆菌XJC60发酵上清液处理组则降低紫外损伤组的绿色荧光强度，即发酵乳杆菌XJC60发酵上清液可降低紫外损伤导致的HaCaT细胞产生的高活性氧水平。
实施例5乳杆菌修复UVB损伤细胞的机制研究
5.1发酵乳杆菌XJC60发酵上清液上调UVB损伤HaCaT细胞的线粒体膜电位
HaCaT细胞培养至对数期，收集细胞。6孔板内设正常对照组(Normal Control)、MRS培养基对照组、阳性对照和处理组，调整细胞悬液浓度，以5×105个/mL，每孔接种2mL细胞悬液。细胞培养板置于5％CO2，37℃培养箱培养24h。
培养24h细胞长至单层后，吸走培养基，用无菌PBS清洗3次，清除原有培养基后，每孔加入2mL无菌PBS。阳性对照组用锡纸包裹，避免受到UVB照射。处理组给予15min的UVB照射，辐射剂量为18mJ/cm2。
照射后正常对照组加入2mL完全培养基，MRS培养基对照组2mL10％MRS培养基的完全培养基、处理组加入2mL 10％发酵乳杆菌XJC60发酵上清液的完全培养基、阳性对照组是加入2mL 10％干酪乳杆菌(Lactobacillus casei strain Shirota)发酵上清液的完全培养基继续培养。培养24h后，用500μL 0.25％含EDTA的胰酶收集孔内细胞，用等体积无菌PBS清洗2次。
将25μL的200×JC-1(SIGMA-ALDRICH,USA)加入5mL分析缓冲液中，混合均匀，制成JC-1工作液。将每孔细胞重悬于500mL JC-1工作液中，在5％CO2、37℃培养箱中避光孵育30分钟。
以1000r/min,，4min离心细胞，弃掉上清液。用无菌PBS洗涤细胞一次后，用200μL无菌PBS重悬细胞于流式管中，通过流式细胞仪检测细胞内的荧光强度。
如图3所示，MRS培养基空白对照组的FITC通道荧光强度为4120.85，发酵乳杆菌XJC60发酵上清液处理组FITC通道荧光强度为2591.31，干酪乳杆菌Shirota发酵上清液处理组FITC通道荧光强度为3225.59，正常对照组FITC通道荧光强度为2961.45。MRS培养基处理的紫外损伤组JC-1水平高于正常细胞组，而发酵乳杆菌XJC60发酵上清液处理组则能上调紫外损伤组的JC-1水平，即发酵乳杆菌XJC60发酵上清液可回调细胞凋亡早期下降的线粒体膜电位，可一定程度修复紫外损伤对HaCaT细胞造成的损伤。
实施例6发酵乳杆菌XJC60发酵上清液对紫外损伤白化豚鼠皮肤的影响
6.1发酵乳杆菌XJC60发酵上清对白化豚鼠皮肤的安全性评价
6.1.1实验动物和饲养条件
选用6只成年白化雌豚鼠(250-350g)进行正式试验。试验前动物要在动物房环境至少适应3-5天。实验动物及实验动物房应符合国家相应规定，选用标准配合饲料，饮水不限制。
6.1.2实验步骤
试验前约24h，将实验动物背部脊柱两侧毛剪掉，不可损伤表皮，去毛范围左、右各约3cm×3cm。取受试物约0.5mL(g)直接涂在皮肤上，然后用二层纱布(2.5cm×2.5cm)和一层玻璃纸或类似物覆盖，再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤作为对照。采用封闭试验，敷用时间为4h。
6.1.3结果评价
于清除受试物后的1、24、48和72h观察涂抹部位皮肤反应，按表2进行皮肤反应评分，以受试动物积分的平均值进行综合评价，根据24、48和72h各观察时点最高积分均值，按表3判定皮肤刺激强度。观察时间的确定应足以观察到可逆或不可逆刺激作用的全过程，一般不超过14d。按下列公式计算每天每只动物平均积分，以表3判定皮肤刺激强度。
Figure GDA0003776234140000171
检测后发现发酵乳杆菌XJC60发酵上清液对白化豚鼠皮肤刺激强度为无刺激性。
表2皮肤刺激反应评分
Figure GDA0003776234140000172
表3皮肤刺激强度分级
Figure GDA0003776234140000181
6.2发酵乳杆菌XJC60发酵上清液修复UVB辐照的白化豚鼠急性光损伤
实验动物和饲养条件：选用6只成年白化雌豚鼠(250-350g)进行试验。试验前动物要在动物房环境至少适应3-5天。实验动物及实验动物房应符合国家相应规定，选用标准配合饲料，饮水不限制。
进行正式急性光损伤试验前18h-24h，将动物脊柱两侧皮肤去毛，试验部位皮肤需完好，无损伤及异常。备4块去毛区，每块去毛面积约为2cm×2cm。
选用波长为280-320nm的UVB灯管作为UV光源。实验前需用辐照计量仪在实验动物背部照射区设6个点测定光强度(mW/cm2),测得平均光强度为0.24mW/cm2。将动物固定，按表4所示，去毛区3和4用铝箔覆盖，胶带固定，去毛区1和2接受UVB照射。
照射剂量的计算：
照射剂量(mJ/cm2)＝照射时间(sec)×光强度(mW/cm2)
照射时间为5min，照射总剂量为75mJ/cm2。
接受UVB照射后，在去毛区1和3涂敷0.2mL发酵乳杆菌XJC60发酵上清液，在去毛区2和4涂敷0.2mL的MRS液体培养基。去毛区1为发酵乳杆菌XJC60发酵上清液处理组、去毛区2是MRS模型组、去毛区4是正常对照组结束后分别于1、24、48和72h观察皮肤反应，根据表5判定每只动物皮肤反应评分。
结果如表6所示，1区红斑和焦痂形成积分为0.83±0.41，水肿形成积分为1.67±0.82；2区红斑和焦痂形成积分为1.67±0.75，水肿形成积分为0.83±0.37；3、4区积分均为0。1区红斑和焦痂情况极显著低于2区(P＝0.09)，1区水肿程度显著低于2区(P＝0.10)。结果说明发酵乳杆菌XJC60发酵上清液可显著修复UVB损伤的白化豚鼠皮肤。
表4动物去毛区的试验安排
Figure GDA0003776234140000191
表5皮肤刺激反应评分
Figure GDA0003776234140000192
表6紫外辐照皮肤刺激反应评分结果
Figure GDA0003776234140000193
Figure GDA0003776234140000201
6.3发酵乳杆菌XJC60发酵上清液修复UVB辐照的白化豚鼠急性光损伤的病理分析
6.3.1标本切片的制备(6.2中的1区是处理组、2区是模型组、4区是正常对照组)
在装有豚鼠的密封性良好鼠笼中通入CO2气体，使豚鼠窒息死亡。快速切取豚鼠皮肤组织标本常规福尔马林固定48小时以上。取出固定好的皮肤组织，用流水漂洗过夜，次日进行如下步骤的石蜡包埋：
70％乙醇1h→80％乙醇1h→90％乙醇1h→95％乙醇1h→95％乙醇1h→100％乙醇1h→100％乙醇1h→正丁醇1h→二甲苯30min→溶蜡1.5h→溶蜡2h→包埋。
常规皮肤组织石蜡切片，厚度5μm，将制好的切片于室温下晾干过夜，随后放入4℃冰箱密封保存，备用。
6.3.2H&E染色
将上述石蜡切片置于二甲苯中脱蜡10min。迅速移入二甲苯与无水乙醇(1:1)混合液中5min。切片再依次经100％、95％、85％、70％乙醇入蒸馏水，各级均为3min。
转入苏木精染液染色8min。以蒸馏水洗去多余染液1％盐酸酒精(70％乙醇配制)分色约25s(镜检监控，以细胞核与核内染色质清晰为度)。立即流水冲洗约15％，至细胞核呈蓝色。双蒸水短暂冲洗。随即用1％伊红染液着色2min。再依次经70％、85％、95％、100％乙醇逐级脱水，各级各3min。切片经2次二甲苯透明后，滴加适量中性树胶，迅速加盖玻片封固，于光镜下观察并摄片记录。
结果如图4所示，正常组豚鼠皮肤组织结构相对完整，真皮与表皮层细胞结构排列规则有序各层结构完整且正常，其皮下毛囊、皮脂腺形态丰盈完整；模型组豚鼠皮肤结构异常角质化严重，增生现象明显，部分可见炎性细胞浸润和细胞轻度坏死。发酵乳杆菌XJC60发酵上清液处理后可改善UV导致的皮肤结构异常，缓解病变形态。
实施例7乳杆菌修复紫外损伤活性物质检测
7.1标准储备液的配制
准确称取烟酰胺标准品50mg，用超纯水定容于25mL棕色容量瓶中，过0.22μm微孔滤膜，配制成质量浓度为2mg/mL标准储备液，避光置于4℃冰箱储存。
7.2样品处理方法
准确吸取一定量发酵乳杆菌XJC60发酵上清液、干酪乳杆菌Shirota发酵上清液、MRS培养基过0.22μm微孔滤膜，制得样品液，避光置于4℃冰箱储存。
7.3高效液相质谱条件
高效液相质谱检测条件如下：色谱柱：COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A：25mmol/L磷酸二氢钾缓冲液；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样器温度：4℃；进样体积：20μL；数据采集波长设定为254nm。
结果如表7所示，发酵乳杆菌XJC60发酵上清液中烟酰胺含量为18mg/L显著高于干酪乳杆菌Shirota发酵上清液中的烟酰胺含量、MRS培养基中的烟酰胺含量。
表7发酵上清液中烟酰胺含量
Figure GDA0003776234140000211
Figure GDA0003776234140000221
注：烟酰胺标品保留时间12.93min
实施例8乳杆菌基因组及表型的安全性评价
8.1乳杆菌的基因组特征及安全性评估
采用Illumina Nextseq 550二代测序及Nanopore MinION三代测序平台对515株乳杆菌进行全基因组测序。细菌基因组DNA提取方法同前。二代测序采用AMT Rapid DNA-Seq Kit for Illumina(CISTRO,CHINA)建库，采用High Output v2.5 kit(Illumina,USA)试剂盒测序。三代测序采用Rapid Barcoding Sequencing Kit(Nanopore,UK)建库，后采用R9.4.1芯片(Nanopore,UK)测序。下机数据分别采用Trimmomatic(v0.39)及Filtlong(v0.2.0)软件进行质控，后采用Unicycler(v0.4.8)软件进行组装。组装后乳杆菌的基因组采用Quast(v5.0.2)软件进行基因组质控评估，采用Abricate(v0.8.13)软件查找并注释毒力基因及耐药基因。
经测序获得发酵乳杆菌XJC60基因组完成图，该菌基因组大小为1.97Mb，GC比为51.65％，其基因组含2,003个CDS、229个重复区、58个tRNA和15个rRNA，不含质粒。采用prokka软件注释发现XJC60基因组中含有1,622个有功能的编码基因以及381个假想蛋白。采用Abricate软件比对VFDB(Virulence Factor Database)、ARG-Annot(AntibioticResistance Gene-ANNOTation)、CARD(the Comprehensive Antibiotic ResearchDatabase)、Resfinder数据库，均未发现发酵乳杆菌XJC60含有毒力基因或耐药基因。
8.2乳杆菌对抗生素的敏感性
根据欧盟食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)标准，使用微量肉汤稀释法检测本专利发酵乳杆菌XJC60对8种抗生素的敏感性。该8种抗生素为：氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素。将生长至对数生长期的乳杆菌悬液调整至0.5麦氏浊度，后加入不同浓度的抗生素稀释剂(浓度从0.5-64μg/ml)，37℃厌氧培养48小时。48小时后读取菌株对每种抗生素的最小抑菌浓度(minimalinhibit concentration，MIC)，根据EFSA提供的细菌耐药性标准判定菌株对该抗生素为敏感(sensitive，S)、中等(intermediated，I)、耐药(resistant，R)。
发酵乳杆菌XJC60对氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、红霉素、克林霉素、四环素和氯霉素的MIC依次为：0.5μg/ml、4μg/ml、0.5μg/ml、64μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、4μg/ml、1μg/ml，可知该菌对EFSA规定的8种抗生素菌敏感。
8.3乳杆菌的溶血试验
在无菌环境下，用接种环接种目标乳杆菌于血平板上，37℃培养48h，观察溶血现象。48h后观察发酵乳杆菌XJC60菌落周围未出现溶血现象，而阳性对照溶血葡萄球菌ATCC6538菌落周围出现透明溶血环，表明发酵乳杆菌XJC60不具有溶血风险。
8.4乳杆菌发酵液对HaCaT细胞的安全性评价
8.4.1细胞培养及传代
细胞培养：人角质形成细胞HaCaT细胞培养于含10％胎牛血清(Fetal BovineSerum，FBS)的DMEM培养基中，培养条件为37℃、5％CO2。培养48h后细胞可铺满T25细胞培养瓶底部80％，此时可进行细胞的传代。
细胞传代：采用无菌巴氏吸管移除瓶内旧培养基，用PBS溶液洗去残留培养基。向瓶内加入2ml 0.25％含EDTA的胰酶，37℃孵育6min后显微镜下观察细胞收回突触或细胞间隙增大后立即用含血清培养基终止消化。用无菌巴氏滴管轻柔吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液。将细胞悬液转至15ml无菌离心管中，1000r/min离心5min，弃上清后采用PBS冲洗细胞2次后重悬细胞于含10％FBS的DMEM培养基中，计数后分装至新的T25细胞培养瓶中，并补足培养基。
8.4.2乳杆菌对HaCaT细胞的安全性评价
采用CCK8检测乳杆菌发酵上清液液对HaCaT细胞的安全性，检测方法同前述。将HaCaT细胞以104个/孔密度接种于96孔板中，加入含10％FBS的DMEM培养基，37℃ 5％CO2培养24h。将1μl乳杆菌发酵上清液加入每孔细胞中，重新置于37℃ 5％CO2细胞箱中培养24h。24h后进行CCK8检测评价HaCaT细胞存活率。
本专利发酵乳杆菌XJC60发酵上清液作用HaCaT细胞24h后细胞存活率为96.71±13.81％，与不加入发酵液的正常细胞存活率不存在差异(P＝0.785)。因此认为发酵乳杆菌XJC60发酵上清液对于HaCaT细胞无毒性作用。
实施例9乳杆菌的特异分子靶标识别
9.1乳杆菌的特异分子靶标挖掘
采用Prokka(v1.11)、Roary(v3.11.2)软件对发酵乳杆菌XJC60及NCBI数据库内其他73株发酵乳杆菌及其它1400株乳杆菌的全基因组进行泛基因组分析。获得核心基因组后，采用Gubbins(v2.4.1)识别包含碱基取代密度较高的基因。基于泛基因组分析获得的发酵乳杆菌XJC60有别于其它乳杆菌的特异序列。采用Oligo(v7)软件针对特异序列进行引物设计，获得识别该菌的特异性分子靶标序列引物SEQ.ID No.3和SEQ.ID No.4。
9.2.乳杆菌特异分子识别靶标有效性验证
采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)及琼脂糖电泳验证发酵乳杆菌XJC60的特异分子识别靶标序列的有效性。检测模板为细菌的DNA，DNA提取方法同前。
PCR反应体系配置如下：
Figure GDA0003776234140000251
以下为PCR反应条件：
Figure GDA0003776234140000252
PCR结束后取5-10μl PCR产物进行1.5％琼脂糖电泳。若发酵乳杆菌XJC60能在318bp处形成单一特异条带，而其他乳杆菌不能形成318bp的单一条带，则说明该对靶标具有良好识别发酵乳杆菌XJC60的效能。
如图5和表1所示，除发酵乳杆菌XJC60的DNA加入引物SEQ ID No.3和SEQ.ID No.4扩增后形成318bp的特异性扩增产物外，其余乳杆菌分离株均未见特异扩增产物形成。结果提示分子靶标序列SEQ ID No.2能特异的鉴别发酵乳杆菌XJC60与其它乳杆菌。
虽然本发明已将较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的内容为准。
序列表
<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
广东环凯生物科技有限公司
广东科环生物科技有限公司
<120> 一株高效合成烟酰胺、抗光老化的发酵乳杆菌及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1447
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌XJC60(Lactobacillus fermentum)
<400> 1
ttaggcggct ggctcctaaa aggttacccc accgactttg ggtgttacaa actctcatgg 60
tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120
ttactagcga ttccgacttc gtgcaggcga gttgcagcct gcagtccgaa ctgagaacgg 180
ttttaagaga tttgcttgcc ctcgcgagtt cgcgactcgt tgtaccgtcc attgtagcac 240
gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatctgacgt cgtccccacc ttcctccggt 300
ttgtcaccgg cagtctcact agagtgccca acttaatgct ggcaactagt aacaagggtt 360
gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgacg accatgcacc 420
acctgtcatt gcgttcccga aggaaacgcc ctatctctag ggttggcgca agatgtcaag 480
acctggtaag gttcttcgcg tagcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540
cccccgtcaa ttcctttgag tttcaacctt gcggtcgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600
tgcgttagct ccggcactga agggcggaaa ccctccaaca cctagcactc atcgtttacg 660
gcatggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctacccat gctttcgagt ctcagcgtca 720
gttgcagacc aggtagccgc cttcgccact ggtgttcttc catatatcta cgcattccac 780
cgctacacat ggagttccac taccctcttc tgcactcaag ttatccagtt tccgatgcac 840
ttctccggtt aagccgaagg ctttcacatc agacttagaa aaccgcctgc actctcttta 900
cgcccaataa atccggataa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960
ttagccgtga ctttctggtt aaataccgtc aacgtatgaa cagttactct catacgtgtt 1020
cttctttaac aacagagctt tacgagccga aacccttctt cactcacgcg gtgttgctcc 1080
atcaggcttg cgcccattgt ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtatgggcc 1140
gtgtctcagt cccattgtgg ccgatcagtc tctcaactcg gctatgcatc atcgccttgg 1200
taggccgtta ccccaccaac aagctaatgc accgcaggtc catccagaag tgatagcgag 1260
aagccatctt ttaagcgttg ttcatgcgaa caacgttgtt atgcggtatt agcatctgtt 1320
tccaaatgtt gtcccccgct tctgggcagg ttacctacgt gttactcacc cgtccgccac 1380
tcgttggcga ccaaaatcaa tcaggtgcaa gcaccatcaa tcaattgggc caacgcgttc 1440
gacttgc 1447
<210> 2
<211> 435
<212> DNA
<213> 发酵乳杆菌XJC60(Lactobacillus fermentum)
<400> 2
atgaaaaagg gcattgctaa tactcccgct tccactgctc cgtcacccgg caaactttgg 60
aataaccatt ataatgttat tcttcaaaat aacgcaacaa atcaaatggc tcagctaaac 120
accaaacgtc acgcaaaaaa actaccctta ggccaaatgc aagtatcatt tgaggacatt 180
accgcccttt ttaagggaga taaattagat gccttagatg cccaattgtt tgattacatt 240
ctcataaagt atagtcaaac tagcaaccat gataatttcc caaccgtaac cttcaagcta 300
aaagaatata tgcatgaccg caaactaagg gatgctaaaa gtgcaagaaa aactttaaga 360
aaagaaatta ctaagtttgc tgacttaaag ctttcttact caggtggcaa cgataaaaat 420
aaaggcgaat tgtag 435
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatactcccg cttccactgc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agcatccctt agtttgcggt 20

Claims (7)

1.发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）XJC60，保藏编号为GDMCC No：61827。
2.权利要求1所述的发酵乳杆菌XJC60在制备预防和/或治疗紫外损伤的药物或护肤品中的应用。
3.一种预防和/或治疗紫外损伤的药物或护肤品，其特征在于，含有权利要求1所述的发酵乳杆菌XJC60作为活性成分。
4.根据权利要求3所述的药物或护肤品，其特征在于，所述的药物中含有发酵乳杆菌XJC60、药物载体和/或药物辅料。
5. 一种鉴别权利要求1所述的发酵乳杆菌XJC60的引物对，其特征在于，所述引物对包括如SEQ.ID No.3和SEQ.ID No.4所示的核苷酸序列。
6.一种鉴别发酵乳杆菌XJC60的方法，其特征在于，是权利要求5所述的引物对作为扩增引物对待测菌进行PCR反应扩增，如果扩增出318bp的产物，则为发酵乳杆菌XJC60，如果没有扩增出318bp的产物，则不是发酵乳杆菌XJC60。
7.权利要求1所述的发酵乳杆菌XJC60在产烟酰胺中的应用。
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AUPS057102A0 (en) * 2002-02-15 2002-03-07 Vri Biomedical Ltd Compositions and methods for treatment of skin disorders
KR101425716B1 (ko) * 2012-07-11 2014-08-14 (주)미애부생명과학 신규의 락토바실러스 퍼멘텀 균주, 이를 이용한 화장료 조성물 및 그 제조방법
CA2991990C (en) * 2015-07-20 2024-04-16 Quorum Innovations, Llc Biological activities of lactobacillus fermentum qi6 biofilm for improving skin and/or mucosal barrier functions
US11534468B2 (en) * 2017-12-06 2022-12-27 Lac2biome S.r.l. Composition based on probiotics and uses thereof
CN111454863A (zh) * 2020-04-12 2020-07-28 生合生物科技（扬州）有限公司 一种发酵乳杆菌及其在制备具有抗衰老功能的乳酸菌发酵液中的应用
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